מודל חולדה של פגיעה טראומטית קלה בראש סגור ותיקוף שלה

Summary

במאמר זה אנו מציגים מודל של פגיעה מוחית טראומטית קלה (mTBI) בראש סגור, ואת התיקוף שלו המציג דמיון יוצא דופן ל-mTBI האנושי בנוגע לביטויים התנהגותיים במהלך השלבים החריפים והתת-חריפים.

Abstract

מודלים של בעלי חיים חיוניים לקידום ההבנה שלנו של פגיעה מוחית טראומטית קלה (mTBI) ולהנחיית מחקרים קליניים. כדי להגיע לתובנות משמעותיות, פיתוח מודל יציב וניתן לשחזור של בעלי חיים הוא חיוני. במחקר זה אנו מדווחים על תיאור מפורט של מודל mTBI עם ראש סגור ועל שיטת אימות מייצגת באמצעות חולדות Sprague-Dawley כדי לאמת את אפקט המידול. המודל כולל הטלת משקל מסה של 550 גרם מגובה של 100 ס"מ ישירות על ראשה של חולדה על משטח הניתן להריסה, ואחריו סיבוב של 180 מעלות. כדי להעריך את הפגיעה, חולדות עברו סדרה של הערכות נוירו-התנהגותיות 10 דקות לאחר הפציעה, כולל זמן איבוד הכרה, זמן חיפוש התנהגות ראשון, יכולת בריחה ומבחן יכולת שיווי משקל קרן. בשלבים החריפים והתת-חריפים שלאחר הפציעה נערכו מבחנים התנהגותיים להערכת יכולת קואורדינציה מוטורית (משימת קרן), חרדה (מבחן שדה פתוח) ויכולות למידה וזיכרון (מבחן מוריס מבוך מים). מודל mTBI עם ראש סגור יצר תגובת פציעה עקבית עם תמותה מינימלית ושוכפל מצבים בחיים האמיתיים. שיטת התיקוף אימתה ביעילות את התפתחות המודל והבטיחה את יציבות ועקביות המודל.

Introduction

פגיעה מוחית טראומטית קלה (mTBI), או זעזוע מוח, היא סוג הפגיעה השכיח ביותר ויכולה להוביל לתסמינים שונים לטווח קצר וכרוניים¹. תסמינים אלה עשויים לכלול סחרחורת, כאבי ראש, דיכאון ואנהדוניה, בין היתר, מה שמוביל לסבל משמעותי עבור אנשים הסובלים מ-mTBI². מאחר שרוב ה-mTBIs נגרמים על-ידי טראומת כוח קהה³, הכרחי לפתח מודלים של בעלי חיים שמחקים במדויק פציעות כאלה. מודלים אלה חיוניים להשגת הבנה טובה יותר של הפציעה והמנגנונים העומדים בבסיסה, ומציעים סביבה מבוקרת עם שונות והטרוגניות מופחתות בהשוואה למחקרים בבני אדם.

מודלים מבוססים רבים של מכרסמים פותחו עבור פגיעה מוחית טראומטית (TBI), כולל פגיעה בכלי הקשה בנוזלים (FPI)⁴, פגיעה מבוקרת בקליפת המוח (CCI)⁵, פגיעה בירידה במשקל⁶, פגיעה מוחית טראומטית בפיצוץ⁷ ועוד. עם זאת, מודלים אלה מתמקדים בעיקר בשכפול תרחישי TBI בינוניים עד חמורים. לעומת זאת, המודלים הניסיוניים שתוכננו במיוחד כדי לדמות mTBI קיבלו פחות תשומת לב באופן יחסי ועדיין לא נחקרו^{מספיק 8}. לכן, יש צורך קריטי לבסס מודל יציב וניתן לשחזור של בעלי חיים שמייצג במדויק mTBI. מודל כזה ישפר באופן משמעותי את הבנתנו את ההשלכות הנוירוביולוגיות וההתנהגותיות הקשורות ל-mTBI.

לא ניתן להבחין בין הליקויים התפקודיים בחולדות mTBI בהשוואה לחולדות רגילות באמצעות תצפית מזדמנת לאחר שהשפעות ההרדמה פגו. לכן, יש צורך לנהל בדיקות ספציפיות. בבני אדם, מגוון רחב של הערכות קליניות משמשות להערכת חולים ^9,10,11. באופן דומה, גם ביסוס מודל מוצלח במודל החולדות מחייב שימוש בכלי הערכה מהירים כדי לקבוע את תקפותו.

במחקר זה אנו מציגים מודל של חולדות mTBI בעלות ראש סגור, המאפשר לחקור mTBI באופן דומה מאוד למצב האנושי. התיאור המפורט של המודל ותהליך התיקוף שלו מספק הבנה מקיפה של הגישה הניסויית המשמשת בחקר mTBI.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מרכז דרום. כל המחקרים נערכו בהתאם לעקרונות הרווחה והאתיקה של חיות המעבדה.

1. הליך האכלה והרדמה של בעלי חיים

1. הקבוצה מאכלסת 280-320 גרם חולדות זכרים של Sprague-Dawley ומתחזקת אותן במחזור אור/חושך של 12 שעות/12 שעות עם גישה למזון ומים עד לליביטום. בצעו את המחקר לאחר שהחולדות התאקלמו במשך 6 ימים.
2. הרדימו את החולדה עם איזופלורן 3% בזרימת אוויר של 0.6 ליטר/דקה בקופסת אינדוקציה עד שהיא אינה מגיבה לצביטת כף או זנב. לשמור על קצב זרימה במשך 30 שניות.
   הערה: לא נעשה שימוש במשככי כאבים מכיוון שהם יפריעו לתגובת החולדה בהערכות הנוירו-התנהגותיות.

2. התקנה טרום ניתוחית

1. מקמו ספוג בעל ערך קשיות של 35D (משקל של 35 ק"ג/מ"ק ספוג), באורך ורוחב זהים אך בעובי של 12 ס"מ, בתוך קופסה אקרילית (15 ס"מ x 22 ס"מ x 43 ס"מ) ללא כיסוי עליון.
2. חותכים רדיד אלומיניום (בעובי של 20 מיקרומטר) ומדביקים אותו על קופסת האקריליק באמצעות סרט הדבקה ליצירת משטח הרסני המסוגל לתמוך במשקל של חולדה. בנוסף, סמנו קו חיתוך בגודל של כ-10 ס"מ כמיקום המיועד למיקום ראש החולדה.
3. בעזרת מעמד ברזל, הדקו היטב את צינור ה-PVC למקומו. מכינים משקל מחורר, במשקל 550 גרם בקוטר 18 מ"מ. חבר את המשקולת לקו דיג בגובה של מטר אחד בתוך צינור פוליוויניל כלוריד או PVC. ולהתאים את מיקום צינור ההנחיה 3 ס"מ מעל רדיד הפח.
4. הכינו קסדה וכרית. הכינו קסדה באמצעות דיסק נירוסטה בקוטר 10 מ"מ ובעובי 3 מ"מ. הכינו כרית ספוג בצורת טריז שתניח מתחת לראשה של החולדה, ותבטיחו שהיא מאונכת לכיוון הכבידה.
   הערה: תרשים סכמטי של מנגנון ההשפעה מוצג באיור 1. מטרת הקסדה היא לזהות את מיקום הפגיעה ולהגביר את פיזור הכוח החיצוני. הכרית מנוצלת להבטחת נזק אחיד ויציב.

3. השראת mTBI

1. הניחו במהירות את החולדה המורדמת על חזה על נייר הכסף.
   הערה: שני מפעילים נדרשים להשראת mTBI – אחד להכנה והשני לאימות.
2. אופן ההכנה: הניחו את הכרית מתחת לחולדה, וודאו שראשה מקביל לנייר הכסף. יישרו את הקסדה עם אוזני החולדה ואבטחו אותה במקומה.
3. אימות: ודא שצינור ה-PVC ממוקם ישירות מעל הקסדה. לאחר ששני המפעילים מאשרים את ההגדרה הנכונה, המשך לשלב הבא.
4. השראת סיבוב ראש: שחררו את המשקולת, אפשרו לה ליפול ולפגוע בראשה של החולדה, מה שגרם לנפילה על הספוג ולסיבוב של 180 מעלות.
5. הניחו את החולדה על גבה בכלוב נקי.

4. אינדוקציה מזויפת

1. התייחסו לחולדה באותו אופן כמו בתיאור הקודם של השראת mTBI, אך אל תחשפו אותה לפגיעת ראש.

5. הליך תיקוף: הערכות נוירו-התנהגותיות חריפות

הערה: ההערכות הבאות שונו בהתבסס על ציוני החומרה הנוירולוגית⁹ והפרוטוקול של Flierl et ^al.10. כל ההערכות הללו בוצעו 10 דקות לאחר שהחולדה התאוששה מרפלקס הימין.

1. זמן איבוד ההכרה: רשמו את משך הזמן מהרגע שבו החולדה מורדמת ועד שהיא משחזרת את רפלקס הימין.
   הערה: רפלקס הימין הוא התהליך שבו החולדה מתהפכת כשהיא מונחת על גבה. אובדן רפלקס התיקון ייחשב כנקודת קצה הומנית, ויש להרדים את בעל החיים בהתאם להנחיות המוסדיות.
2. זמן חיפוש התנהגות ראשון: רשמו את משך הזמן מהרגע שבו החולדה מורדמת ועד שהיא מראה את התנהגות החיפוש בפעם הראשונה.
   הערה: חיפוש התנהגות הוא סימן להתעניינות בסביבה, תגובה פיזיולוגית.
3. יכולת בריחה
   1. הניחו את החולדה באמצע מנגנון עגול (0.5 מ' קוטר ו-0.3 מ' גובה) עם יציאה (12.5 ס"מ אורך ו-9 ס"מ רוחב).
   2. רשמו את הזמן שלוקח לחולדה לצאת מהעיגול.
      הערה: אם החולדה לא יוצאת מהעיגול בתוך 180 שניות, רשום את הזמן כ- 180 שניות.
4. בדיקת יכולת איזון קרן
   1. הניחו את החולדה על קורה ברוחב 3 ס"מ, 2 ס"מ ו-1.5 ס"מ למשך דקה אחת בהתאם.
   2. אם החולדה שומרת על שיווי משקל עם יציבה יציבה על הקורה, ציון זה 0.
   3. אם החולדה תופסת את צד הקורה, תנו ציון 1. אם החולדה מחבקת את הקרן ואיבר אחד נופל ממנה, ציון 2.
   4. אם החולדה מחבקת את הקרן ושתי הגפיים נופלות ממנה או מסתובבות עליה (>60 שניות), הניחו לה ציון 3.
   5. אם החולדה מנסה לאזן את הקרן אך נופלת (> 40 שניות), הניקוד הוא 4.
   6. אם החולדה מנסה לאזן את הקרן אך נופלת (>20 שניות), הניחו לה ציון 5.
   7. אם החולדה לא מנסה לאזן או להיתלות על הקרן ונופלת תוך 20 שניות, הניקוד הוא 6.
      הערה: מבחן איזון הקרן אינו דורש קדם-משפט.

6. הליך תיקוף: הערכת נוירו-התנהגות

הערה: לפני הניסויים ההתנהגותיים, החולדות טופלו במשך 2 דקות ביום במשך 3 ימים רצופים כדי למזער מתח ושיבוש חידושים. כל הניסויים ההתנהגותיים בוצעו על ידי הצבת בעלי החיים בסביבת הניסוי למשך 60 דקות לפני תחילת הניסוי.

1. יכולת קואורדינציה מוטורית (משימת קרן)
   1. מערך ניסיוני
      1. הניחו את החולדות בקצה אחד של קרן שיווי המשקל (1.5 מ' אורך ו-75 ס"מ מעל הרצפה). הניחו ארגז מילוט (כלוב ביתי משופע) בצד השני.
      2. מקמו ריפוד קצף מתחת לקורה כדי להפחית את הסיכון הפוטנציאלי לפגיעה בחולדות במקרה של נפילה במהלך הבדיקה.
      3. הפעל את מצלמת הווידאו.
      4. קבעו ימי בדיקה בנקודות זמן ספציפיות לאחר הפציעה או לאחר טיפול דמה (למשל, יום 1, יום 3 ויום 7).
   2. שלב האימון (יומיים)
      1. אמן את החולדות לחצות את הקרן ברוחב 4 ס"מ 3 פעמים ברציפות, ולאחר מכן שני ניסויים על הקרן ברוחב 2 ס"מ.
      2. במהלך האימון, הדריכו בעדינות את החולדות על פני הקרן עד שהן יכולות לחצות אותן בקלות ללא הפרעה.
   3. ניסוי קרן איזון
      1. הניחו את החולדות על קורה ברוחב 2 ס"מ במשך 5 ניסויים רצופים.
      2. תעד את ההתחלה והסיום של כל ניסוי כאשר אפה של החולדה חוצה את קווי ההתחלה והסיום, בהתאמה.
      3. החזירו את החולדות לכלובים בתום הניסוי.
   4. בדיקות בסיסיות
      1. בצע את ניסוי קרן האיזון לפני הפציעה או הטיפול.
      2. חשב את הערכים הממוצעים של 5 ניסויים רצופים אלה כדי לקבוע את קו הבסיס עבור כל חולדה.
   5. ניתוח נתונים
      1. נתח את זמן חציית הקרן ואת המספר הכולל של החלקות רגליים אחוריות באמצעות ניתוח וידאו על ידי חוקרים עיוורים לתנאי הניסוי.
2. חרדה (מבחן שדה פתוח)
   1. מערך ניסיוני
      1. הכינו את זירת השדה הפתוח, וודאו שהיא נקייה ונטולת רמזי ריח קודמים. חלקו את הזירה לשלושה אזורים: אזור פנימי מרכזי (33X33 ס"מ), אזור אמצעי (66X66 ס"מ) ואזור חיצוני.
   2. שלב הבדיקה
      1. הניחו חולדה במרכז זירת השדה הפתוח והפעילו את שעון העצר. אפשרו לחולדה לחקור את הזירה במשך 5 דקות בחופשיות. לאחר 5 דקות, החזירו בזהירות ובעדינות את החולדה לכלוב הביתי שלה.
   3. איסוף נתונים
      1. מדדו את המרחק הכולל שעברה החולדה במהלך 5 דקות החיפוש. קבעו את הזמן שהחולדה מבלה באזור הפנימי, האמצעי והחיצוני המרכזי.
   4. ניתוח נתונים
      1. השתמש במרחק הכולל שעבר כמדד להתנהגות גישושית כוללת ויכולת מוטורית. חשב את הזמן המושקע באזור הפנימי המרכזי כאינדיקטור לתגובות דמויות חרדה.
3. יכולות למידה וזיכרון (מבחן מבוך מים מוריס)
   1. ודא שמנגנון מבוך המים במצב תקין. צבעו את המים בשחור והניחו רמזים בארבעת הכיוונים הקרדינליים. מקמו את הפלטפורמה 2.5 ס"מ מתחת לפני המים.
   2. הגדירו מערכת ניטור כדי לתעד ולצפות בהתנהגות החולדות.
   3. יום שביל
      1. הכניסו במהירות את החולדה למבוך המים. אם החולדה לא מצליחה להגיע לרציף תוך 2 דקות, הנחו אותה בעדינות באמצעות מקל העץ.
      2. אפשרו לחולדה להכיר את סביבת המבוך בעודה עומדת על הרציף במשך 20 שניות, ואז הסירו אותה. ברגע שהחולדה נמצאת על הרציף, תנו לה להישאר 20 שניות, ואז הסירו אותה.
   4. חזרה יומית
      1. חזור על הליך יום האימון, והצבת החולדה במים מרבעים שונים. חזור על שלב 6.3.3. המשך את האימונים במשך 5 ימים רצופים.
   5. יום מבחן בדיקה: ביום^השישי , הסירו את הפלטפורמה והניחו את החולדה באותו רביע למשך 2 דקות.
   6. תצפית והקלטה: השתמשו במערכת הניטור כדי לעקוב אחר התנהגות החולדה בימי ניסוי ובדיקה.
   7. ניקוי: לאחר הוצאת החולדה ממבוך המים, השתמשו במגבת כדי לייבש אותה היטב.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

המנגנון ששימש בעבודה זו היה גרסה שונה של מודל קיין ומודל הילדים^11,12 של ריצ'ל מיצ'סיוק. במחקר זה, חולדות SD חולקו לקבוצות דמה ו-mTBI. כדי להדגים את יכולת השחזור של המודל הזה, ערכנו שלושה שכפולים עצמאיים של המודל הזה יחד עם הערכה נוירו-התנהגותית חר?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מודל זה מדמה בהצלחה mTBI עם ראש סגור ללא צורך בחתך בקרקפת או בפתיחת גולגולת, ומספק ייצוג מדויק יותר של תרחיש הפגיעה שנצפה במקרים אנושיים. הימנעות מחתך בקרקפת מסייעת למנוע תגובות דלקתיות שעלולות שלא להתאים למצב בפועל. בהשוואה למודל¹² לילדים של ריצ'ל מיצ'סיוק, המודל ששימש במחקר זה ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic box	In-house	N/A	15 cm x 22 cm x 43 cm
Anesthesia Machine	RWD Life Science Co.	R540 Mice & Rat Animal Anesthesia Machine
Helmet	In-house	N/A	Stainless-steel disk measuring 10 mm in diameter and 3 mm in thickness
Morris water maze	RWD Life Science Co.		Diameter 150 cm, height 50 cm,platform diameter 35 cm
Open field	RWD Life Science Co.	63007	Width100 cm, height 40 cm
Panlab SMART V3.0	RWD Life Science Co.	SMART v3.0
Perforated weight	In-house	N/A	Weight of 550 g and diameter of 18 mm
Pillow	In-house	N/A	Wedge-shaped sponge to place beneath the rat's head