טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי בתיווך כורכומינואיד על מודל מורין של קנדידאזיס פומי

Summary

פרוטוקול זה מתאר את היישום של טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי (aPDT) במודל מורין של קנדידה אוראלית. aPDT בוצע באמצעות תערובת מסיסה במים של כורכומינואידים ואור LED כחול.

Abstract

טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי (aPDT) נחקר בהרחבה במבחנה, ומודלים פרה-קליניים של זיהומים בבעלי חיים מתאימים להערכת טיפולים אלטרנטיביים לפני ניסויים קליניים. מחקר זה מתאר את היעילות של aPDT במודל מורין של קנדידה אוראלית. ארבעים עכברים עברו דיכוי חיסוני באמצעות זריקות תת-עוריות של פרדניזולון, ולשונם חוסנה באמצעות מטוש אוראלי שהושרה בעבר בתרחיף תאי C. albicans . טטרציקלין ניתן באמצעות מי שתייה במהלך הניסוי. חמישה ימים לאחר החיסון הפטרייתי, עכברים חולקו באופן אקראי לשמונה קבוצות; קבוצה תשיעית של עכברים לא נגועים שלא טופלו נכללה כקבוצת ביקורת שלילית (n = 5). שלושה ריכוזים (20 μM, 40 μM ו-80 μM) של תערובת כורכומינואידים נבדקו עם נורת LED כחולה (89.2 mW/cm²; ~455 nm) וללא אור (קבוצות C+L+ ו-C+L, בהתאמה). אור בלבד (C-L+), ללא טיפול (C-L-), ובעלי חיים ללא זיהום הוערכו כקבוצת ביקורת. הנתונים נותחו באמצעות מבחני ANOVA ו-Games-Howell של וולש (α = 0.05). קנדידה אוראלית הוקמה בכל בעלי החיים הנגועים ודמיינה באופן מקרוסקופי באמצעות נוכחות של כתמים לבנים אופייניים או pseudomembranes על גבי הלשונות. חלקים היסטופתולוגיים אישרו נוכחות גדולה של שמרים וחוטים המוגבלים לשכבה הקרטיניסטית של האפיתל בקבוצת C-L, ונוכחותם של תאים פטרייתיים הופחתה חזותית בתמונות שהתקבלו מעכברים שנחשפו ל- aPDT עם כורכומינואידים של 40 מיקרומטר או 80 מיקרומטר. aPDT בתיווך כורכומינואידים של 80 מיקרומטר קידם ירידה של 2.47 לוג₁₀ בספירת מושבות בהשוואה לאלה בקבוצת C-L- (p = 0.008). כל הקבוצות האחרות לא הראו ירידה מובהקת סטטיסטית במספר המושבות, כולל קבוצות פוטונסיטייזר (C+L-) או אור בלבד (C-L+). aPDT בתיווך כורכומינואיד הפחית את העומס הפטרייתי מהלשונות של עכברים.

Introduction

קנדידה אוראלית (OC) היא הזיהום הפטרייתי העיקרי של חלל הפה; זה נגרם על ידי צמיחת יתר של קנדידה spp. גורמים מקדימים לOC כוללים תפקוד אנדוקריני, שימוש באנטיביוטיקה רחבת טווח, רדיותרפיה וכימותרפיה, חסרים תזונתיים, קסרוסטומיה (זרימת רוק נמוכה), שימוש בשיניים תותבות, היגיינה לקויה, ובמיוחד, דיכוי חיסוני¹. מבין מיני הקנדידה , קנדידה אלביקנס היא הנפוצה והארסית ביותר; הוא נמצא כמין קומנסלי בגוף האדם וכפתוגן אופורטוניסטי. ל-C. albicans יש את היכולת לשנות את המורפולוגיה שלו משמרים קומנסליים (blastopores) לחוטים פתוגניים (hyphae ו-pseudohyphae)². צורות נימה, במיוחד hyphae, יכול לפלוש אפיתל המארח ע....

Protocol

פרוטוקול המחקר לשימוש בעכברים אושר על ידי ועדת האתיקה לשימוש בבעלי חיים (מספרי תיקים 05/2008 ו-09/2020) בבית הספר לרפואת שיניים, ארארקוארה, UNESP. C. albicans (ATCC 90028) שימש כזן הייחוס. נקבות עכברים שוויצריות בנות שישה שבועות (n = 45), עם טווח מסת גוף של 20-30 גרם, שימשו במחקר הנוכחי. בעלי החיים סופקו על ידי אוניברסיטת סאו פאולו, UNESP, Botucatu.

1. הכנת PS ובחירת מקור האור עבור aPDT

1. הכינו את ה-PS בהתאם למפרט של החומר שייבדק.
   הערה: במחקר זה, תערובת מסיסה במים של כורכומינואידים (תערובת מלח מסיסה במים¹² על בסיס CUR) שימשה כ-PS (ראו טבלת חומרים

תוצאות

מודל מורין של OC הראה כתמים לבנים טיפוסיים ופסאודוממברנות על הלשון של כל העכברים הנגועים (איור 4A). C. albicans שנמצאו מבעלי חיים C-L אישרו התיישבות רקמות על ידי מיקרואורגניזם זה (הערכים נעו בין 1.62 x 10⁴ ל 4.80 x 10⁵ CFU/mL). כצפוי, חיות מקבוצת NCtr לא הראו שינויים כלשהם ברקמות א?.......

Discussion

C. albicans נקשר לזיהומים בפה ובוושט אצל אנשים עם מצב של מדוכאי חיסון, סוכרת, שימוש ממושך באנטיביוטיקה והיגיינת פה לקויה ^1,3. המחקר של מחלות זיהומיות בבני אדם דורש הן חקירות חוץ גופיות והן חקירות in vivo לפני שניתן יהיה לתכנן ניסויים קליניים בצורה בטוח?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. albicans	ATCC (Rockville, Md, USA)	90028	Used to prepare the Candida inoculum
Centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany	022628146 (NA)	Used to prepare the Candida inoculum
Chlorpromazine chloride 2 mg/mL	Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil	-	Used to sedate animals during candida inoculation
Curcumin-based water-soluble salt	PDTPharma, Cravinhos, Brazil	-	Consisting of 53.4% of natural curcumin, and  46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1)
Digital colony counter	CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil	-	Used to count colonies on agar plates
Extruded mouse chow	Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil.	-	Used for the feeding of the mice
Ketamine Hydrochloride 10%	Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil	-	Used to anesthetize animals before  treatments and for euthanasia
Light-emitting diode handpiece (prototype)	Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil	-	Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA
Methylprednisolone acetate 40 mg	DEPO-MEDROL, Pfizer, New York	-	Used as an immunosuppressant
Microtome	Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA	SM2500	Used to cut the serial sections of the tongues
Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm	Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil	-	Used to keep the animals throughout  the experimental period
Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol	HiMedia, Mumbai, India	MM1067-500G	Culture medium for yeast growth (agar)
Spectrophotometer	Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil	K37-VIS	Used to standardize the inoculum concentration
Tetracycline hydrochloride	Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil	-	Antibiotic given to induce oral dysbiosis
Wood shavings	J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil	-	Used for floor covering inside the housing boxes
Xylazine 2%	Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil	-	Used in combination with ketamine for anesthesia
Yeast Nitrogen Broth	Difco, InterLab, Detroit, MI, USA	DF0919-07-3	Culture medium for yeast growth (broth)
Yeast Peptone Dextrose Broth	NutriSelect Basic, Sigma Aldrich	Y1375	Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow