JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לגרימת יתר לחץ דם מסוג H ולהעריך את ההשפעות נגד יתר לחץ דם של מרתח Huotan Jiedu Tongluo (HTJDTLD) המנוהל תוך גזסטרית. בחולדות עם יתר לחץ דם מסוג H, HTJDTLD היה בעל השפעות יעילות נגד יתר לחץ דם, שייתכן שהיו קשורות לעיכוב של הפעלת מסלול אפופטוזיס הנגרם על ידי לחץ אנדופלסמי (ER).

Abstract

יתר לחץ דם מסוג H, שהוא צורה ספציפית של יתר לחץ דם המאופיין ברמות גבוהות של הומוציסטאין בפלזמה (Hcy), הפך לאתגר גדול בתחום בריאות הציבור ברחבי העולם. מחקר זה בדק את ההשפעות ההיפוטנסיביות ואת המנגנונים הבסיסיים של מרתח Huotan Jiedu Tongluo (HTJDTLD), נוסחה יעילה ביותר ברפואה סינית מסורתית המשמשת בדרך כלל לטיפול בהיצרות כלי דם. מתיונין שימש לגרימת יתר לחץ דם מסוג H בחולדות, ו-HTJDTLD ניתן תוך גסטרית. לאחר מכן, לחץ הדם הסיסטולי והדיאסטולי של העורק הקאודלי של חולדות נמדד על ידי מנומטריה קאודלית לא פולשנית של חולדות. הערכה היסטולוגית של אבי העורקים בוצעה על ידי צביעת hematoxylin-eosin (HE). בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA) שימשה למדידת רמות Hcy, ותגובת שרשרת כמותית של פולימראז שעתוק לאחור (qRT-PCR) והקרישה המערבית שימשו לקביעת רמות ה-mRNA והחלבון של חלבון מווסת גלוקוז 78 (GRP78), גורם הקשור לקולטן נמק הגידול (TNF) גורם 2 (TRAF2), קינאזות c-Jun N-terminal (JNK) וקספאז-3. התוצאות הראו כי HTJDTLD הוריד באופן משמעותי את לחץ הדם, הקל על נגעים היסטופתולוגיים והוריד את רמות Hcy לאחר טיפול במתיונין. יתר על כן, HTJDTLD עיכב באופן משמעותי את ביטוי הגנים והחלבונים של GRP78, JNK, TRAF2 וקספז 3, המעורבים בעיקר במסלול אפופטוזיס המושרה על ידי לחץ ברשתית האנדופלסמית (ER). בסך הכל, התוצאות הצביעו על כך של- HTJDTLD היו השפעות יעילות נגד יתר לחץ דם בחולדות עם יתר לחץ דם מסוג H וחשפו את המנגנונים נגד יתר לחץ דם הקשורים לעיכוב הפעלת מסלול אפופטוזיס הנגרם על ידי לחץ ב- ER.

Introduction

יתר לחץ דם, גורם סיכון מרכזי להתקף לב, שבץ ואי ספיקת כליות, הפך לאתגר משמעותי בתחום בריאות הציבור המשפיע על מיליארד אנשים ברחבי העולם1. הומוציסטאין (Hcy), חומצת אמינו המכילה קבוצת תיול, היא מתווך מטבולי חיוני של מטבוליזם מתיונין. יתר לחץ דם עם רמות גבוהות של Hcy בפלזמה מוגדר כיתר לחץ דם מסוג H, אשר יכול להיות גורם סיכון משמעותי להתרחשות והישנות של מחלות לב וכלי דם כגון שבץמוחי 2,3. מחקרים אחרונים דיווחו כי תושבות משותפת של יתר לחץ דם מסוג H עלולה להחמיר את תופעות הלוואישל מחלות לב וכלי דם וכלי דם 4. יש לציין כי 75% מהחולים בסין עם יתר לחץ דם מסוג H סובלים מיתר לחץ דם ראשוני, המשפיע קשות על איכות החיים5. כיום, הטיפול ביתר לחץ דם מסוג H כולל בעיקר את הרפואה המערבית. עם זאת, זה עלול לגרום לתופעות לוואי מסוימות תאימות ירודה כבר לא יכול לענות על הצרכים לניהול מקיף של יתר לחץ דם מסוג H.

רפואה סינית מסורתית (TCM) היא משאב ייחודי עם היסטוריה של יותר מ -2,000 שנה בסין. בשל הצורך הבלתי מסופק בשליטה ביתר לחץ דם ברפואה המערבית, רופאים החלו לשקול את התפקיד הפוטנציאלי של TCM במניעה וטיפול ביתר לחץ דם מסוג H6. Huotan Jiedu Tongluo Decoction (HTJDTLD) היא נוסחת רפואה סינית מסורתית שנוסחה על ידי פרופסור יואה דנג, השואבת ממומחיותו הקלינית הנרחבת7. במהלך יותר מ -20 שנות יישום קליני, HTJDTLD הוכיח יעילות יוצאת דופן בטיפול במחלות לב וכלי דם במוח1. עם זאת, לא דווח אם ל- HTJDTLD יש השפעות טיפוליות ביתר לחץ דם מסוג H. לכן, מטרתנו הייתה לחקור את ההשפעות נגד יתר לחץ דם ואת המנגנונים הספציפיים של HTJDTLD בחולדות עם יתר לחץ דם מסוג H ולזהות תרופות טיפוליות פוטנציאליות לטיפול ביתר לחץ דם מסוג H.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת צ'אנגצ'ון לרפואה סינית. החומרים מפורטים בטבלת החומרים.

1. בעלי חיים וטיפול

  1. חלקו באופן אקראי 50 חולדות בוגרות עם יתר לחץ דם ספונטני (SHRs) (זכר, בן 50 יום) לחמש קבוצות, כולל קבוצת ביקורת (CON), מתיונין (MET), MET + HTJDTLD + Enalapril maleate (EM), MET + EM וקבוצות MET + HTJDTLD.
    הערה: חולדות הניסוי שוכנו בסביבה מבוקרת שנועדה להבטיח את נוחותן ורווחתן. המתקן כלל חדרים מבוקרי טמפרטורה שנקבעו בטמפרטורה קבועה של 22 מעלות צלזיוס, עם לחות יחסית של 40-60%. כלובי הדיור היו עשויים פוליקרבונט שקוף, שסיפק מקום רב לכל חולדה לנוע בחופשיות. לוח הזמנים של התאורה פעל לפי מחזור אור/חושך של 12 שעות, המדמה תנאי אור יום טבעיים. החולדות קיבלו מזון ומים נאותים.
  2. ספקו לחולדות את התזונה הבאה במשך 28 ימים.
    1. תנו לחולדות בקבוצת MET דיאטה של 3% מתיונין במשך 28 יום כדי לגרום ליתר לחץ דם מסוג H.
    2. יש לתת את החולדות בקבוצת MET + HTJDTLD + EM באופן תוך-גסטרי עם HTJDTLD (1.633 גרם/מ"ל) ו-EM (0.2 מ"ג/מ"ל) במינון של 1 מ"ל/ק"ג כאשר החולדות בנוסף לדיאטת 3% מתיונין.
    3. לנהל את החולדות בקבוצות MET + EM ו- MET + HTJDTLD עם HTJDTLD או EM על ידי gavage, בהתאמה, מלבד דיאטת מתיונין 3%.
      הערה: HTJDTLD מורכב Fructus Trichosanthis (20 גרם), Radix et Rhizoma Salviae miltiorrhizae (15 גרם), Lonicerae japonicae flos (30 גרם), Radix et Rhizoma Nardostachyos (15 גרם), Radix Angelicae sinensis (15 גרם), Radix et Rhizoma Glycyrrhizae (10 גרם), Hirudo (5 גרם), Radix et Rhizoma Rhodiolae crenulatae (15 גרם), ו Radix Scrophulariae (15 גרם), והוא decocted כפי שדווח בעבר7. EM מומס במים מטוהרים (0.2 מ"ג / מ"ל) שימש כבקרה חיובית.

2. מדידת לחץ דם

הערה: מדידות לחץ דם מבוצעות באמצעות מד לחץ דם לא פולשני (רשימת חומרים).

  1. לאחר טיפול של 28 ימים, צמו את החולדות בכל קבוצה במשך 12 שעות ומדדו את לחץ הדם.
  2. בחרו מכשיר ריסון המתאים לגודלה של החולדה. מכשיר הריסון המשמש במחקר זה כולל רשת ריסון גלילית, כיסוי בד, צינור תרמי וכרית קצף מייצבת. הניחו את החולדה ברשת הריסון, הכניסו את רשת הריסון לצינור התרמי ולאחר מכן הכניסו את הצינור התרמי לכיסוי הבד.
  3. הנח את כבל האות במיקום מתאים מתחת לכיסוי. הניחו את זנב החולדה ברווח המסופק בכיסוי והדקו אותו על כרית הצורה המייצבת. סביבה לא מאוכלסת, שקטה וחמה מועדפת למדידות. העבירו את החולדות לאתר המדידה 20-30 דקות מראש, כדי שהחולדות יוכלו להסתגל לסביבת המדידה.
    הערה: ניתן לבצע את שלבים 2.2-2.3 מספר פעמים כדי לייצב את החולדות. לאחר מספר אימונים החולדות יתרגלו לכך ויוכלו להתייצב מהר מאוד, מה שנוח למדידת לחץ הדם הבאה.
  4. חבר את חיבור צינור האוויר של חיישן הלחץ, חיבור האות וצינור ההחזקה. הניחו את חיישן הלחץ בקצה הזנב.
  5. למדוד את לחץ הדם. גל דופק מופיע לאחר החדרת זנב החולדה לחיישן. לחץ על התחל/עצור כדי להתחיל/לעצור את המדידה.
    הערה: ההתקן יקבע באופן אוטומטי אם זנב החולדה יוכנס לחיישן. כאשר זנב החולדה אינו מוכנס, חיישן הלחץ לא יתחיל ללחוץ ולא יבצע את המדידה.
  6. לאחר השלמת בדיקת לחץ הדם, תפריט התוצאות יופיע באופן אוטומטי. בדוק את הערך הממוצע של המדידה, סטיית התקן (SD), שגיאת התקן (SE) ומקדם השונות (CV) בתפריט תוצאות .
    הערה: לחץ הדם של כל חולדה נמדד שלוש פעמים, במרווח של יותר מ-2 דקות, וחושב הערך הממוצע.
  7. לאחר מדידת לחץ הדם, הרדימו את החולדה על ידי הזרקה תוך צפקית של עודף 2% נתרן פנטוברביטל (100 מ"ג/ק"ג). לאחר מכן, בעזרת מספריים כירורגיים ומלקחיים עם שיניים, נתחו את החולדה שכבה אחר שכבה מהפרינאום לצוואר. הופכים את תוכן בית החזה והבטן, מנווטים לביפורקציה של אבי העורקים הבטני בין שתי הכליות, ואוספים את אבי העורקים עד לחלק בקשת אבי העורקים.

3. צביעת Hematoxylin-eosin (HE)

  1. לתקן את רקמת כלי הדם אבי העורקים ב 4% paraformaldehyde לפחות 24 שעות.
  2. קחו את דגימות כלי הדם, ייבשו אותן באלכוהול הדרגתי, הפכו אותן לשקופות בקסילן והטמיעו אותן בפרפין.
  3. לאחר ההטבעה, יוצרים פרוסות רציפות בעובי 3-5 מ"מ. יבשו את הפרוסות בטמפרטורה של 60-70 מעלות צלזיוס, ואחסנו אותן בטמפרטורת החדר (RT).
  4. יש לטבול את החלקים בקסילן I למשך 30 דקות, קסילן II למשך 30 דקות, 100% אלכוהול I למשך 10 דקות, 100% אלכוהול II למשך 10 דקות, 95% אלכוהול I למשך 5 דקות, 95% אלכוהול II למשך 5 דקות, 80% אלכוהול למשך 5 דקות, ולאחר מכן לשטוף במים מזוקקים.
  5. מכתימים את החלקים בהמטוקסילין האריס למשך 5 דקות, ושוטפים במי ברז במשך 5 דקות. יש להבדיל ב-1% חומצה הידרוכלורית למשך 10 שניות, ולשטוף היטב במי ברז במשך 15 דקות. שטפו את החלק במי אמוניה במשך 5 שניות, ושטפו היטב במי ברז במשך 15 דקות.
  6. יש לבצע התבוננות מיקרוסקופית, להכתים באמצעות אאוסין למשך 10 דקות ולשטוף היטב במי ברז למשך 15 דקות.
  7. יש לייבש את החלקים על ידי טבילתם ב-80% אלכוהול אתילי למשך 10 שניות, 95% אלכוהול I למשך 5 דקות, 95% אלכוהול II למשך 5 דקות, 100% אלכוהול I למשך 10 דקות, 100% אלכוהול II למשך 10 דקות, קסילן I למשך 10 דקות וקסילן II למשך 10 דקות.
  8. אטמו את החלקים בעזרת מסטיק נייטרלי.
  9. שימו לב לשינויים ההיסטולוגיים ברקמות אבי העורקים תחת מיקרוסקופ אור (100x אובייקטיבי, 1000x הגדלה).

4. צביעת הטריכרום של מאסון

  1. בצעו הסרת שעווה שגרתית בדומה לצביעת HE.
  2. צביעת המטוקסילין: יש לטבול את המגלשות בתמיסת המטוקסילין למשך 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף מיד במי ברז.
  3. יש לטבול את המגלשות בתמיסת חומצה הידרוכלורית 1% למשך מספר שניות, ומיד לאחר מכן לשטוף במי ברז.
  4. יש לטבול את המגלשות בכתם מגנטה חומצי של ליכטנשטיין למשך 5 דקות ולאחר מכן לשטוף במים.
  5. יש לטבול את המגלשות בחומצה פוסהומוליבדית 1% למשך 5 דקות.
  6. יש לטבול את המגלשות בתמיסת שטיפה 2% אנילין כחול למשך 5 דקות ו-1% חומצה אצטית קרחונית למשך דקה אחת. לאחר מכן, שטפו את המגלשות במהירות ב-95% אלכוהול 3 פעמים.
  7. יש לבצע התייבשות שגרתית, שקיפות ואיטום חניכיים ניטרלי בדומה להכתמת HE.

5. מדידת Hcy על ידי ELISA

  1. מרדימים את החולדות על ידי הזרקה תוך צפקית של 2% נתרן pentobarbital (45 מ"ג / ק"ג) ולאשר את עומק ההרדמה על ידי צביטת בוהן. החזיקו את החולדה וחתכו את השפם כדי למנוע מגע בעת לקיחת דם. הסר את גלגלי העיניים של החולדה עם מלקחיים מעוקלים ולאסוף את הדם בצינורות microcentrifuge סטרילי מוכן. ואז, להרדים את החולדה עם זריקה intraperitoneal של עודף 2% pentobarbital נתרן (100 מ"ג / ק"ג).
  2. אפשר לדם לקרוש באופן טבעי במשך 10-20 דקות ב- RT, ולאחר מכן צנטריפוגה (626-1409 x גרם) את הדם במשך כ -20 דקות ב 2-8 מעלות צלזיוס.
  3. בזהירות לאסוף את supernatant ולאחסן אותו במקרר ב -80 מעלות צלזיוס.
  4. יש לדלל את התקן במבחנה בהתאם להוראות הערכה.
  5. הגדר בארות ריקות (לא מתווספים דגימות וריאגנטים אנזימים לבארות הבקרה הריקות; שאר השלבים זהים), בארות סטנדרטיות ובארות דגימה לבדיקה. הוסף 50 μL של תקנים לתוך הצלחת, 40 μL של פתרון דילול מדגם לתוך בארות הדגימה, ולאחר מכן 10 μL של סרום (דילול הסופי של הדגימה הוא 5 פעמים).
    הערה: הוסף את המדגם לתחתית הבארות של הצלחת; נסו לא לגעת בדפנות הבארות, ונערו בעדינות כדי לערבב.
  6. אוטמים את הצלחת בסרט איטום ודגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
  7. לדלל את תמיסת הכביסה המרוכזת 30 פעמים 30 פעמים במים מזוקקים ולהתכונן לשימוש.
  8. מוציאים את סרט האיטום בזהירות, משליכים את הנוזל ומנערים אותו כדי להסיר את כל הנוזלים. מלאו כל באר בתמיסת כביסה, השאירו אותה למשך 30 שניות והשליכו אותה. חזור על פעולה זו 5 פעמים והקש על כך יבש.
  9. הוסף 50 μL של מגיב אנזים לכל באר, למעט הבארות הריקות.
  10. השתמשו בסרט איטום כדי לאטום את הצלחת ולאחר מכן לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
  11. חזור על שלב 5.8.
  12. הוסיפו 50 μL של מפתח צבע A לכל באר, ואז הוסיפו 50 μL של מפתח צבע B, ונערו בעדינות כדי לערבב היטב. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 10 דקות תחת תאורה חלשה.
  13. הוסף 50 μL של תמיסת עצירה לכל באר כדי לסיים את התגובה (הצבע הכחול יהפוך צהוב).
  14. אפס את התגובה עם בארות ריקות ולמדוד את הספיגה (ערך OD) של כל באר ברצף ב 450 ננומטר.
    הערה: יש לבצע את המדידה תוך 15 דקות לאחר הוספת תמיסת העצירה.

6. מיצוי RNA ו-RT-PCR כמותי

  1. לחלץ RNA כולל.
    1. חותכים את רקמת אבי העורקים הטרי במהירות לגודל המתאים (30-50 מ"ג לחתיכה), וטוחנים היטב בחנקן נוזלי. מוסיפים 1 מ"ל של מגיב Trizol, מערבבים היטב, ולדגור על קרח במשך 10 דקות כדי lyze את הרקמה.
    2. צנטריפוגה ב 2250 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. בזהירות להעביר את supernatant לצינור microcentrifuge חדש ללא כדור.
    3. מוסיפים 200 μL כלורופורם, מנערים נמרצות במשך 15 שניות ודגורים ב-RT במשך 5 דקות.
    4. צנטריפוגה ב 2250 x גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C. התערובת תחולק לשלוש שכבות: השלב האורגני פנול-כלורופורם תחתון, השלב האמצעי והשלב המימי העליון.
    5. מעבירים בזהירות את הפאזה המימית העליונה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש (כ-60% נפח של טריזול). אין לשאוף לשלב הביניים; כמות קטנה של נוזל עליון ניתן להשאיר.
    6. מוסיפים נפח שווה של איזופרופנול, מערבבים בעדינות על ידי היפוך כ-10 פעמים, ומשאירים למשך 10 דקות ב-RT.
    7. צנטריפוגה ב 2250 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט ושטפו את משקע הרנ"א פעמיים עם 1 מ"ל של 75% אתנול.
    8. צנטריפוגה ב 2250 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, להשליך את supernatant, ולייבש באוויר ב RT במשך 5-10 דקות.
    9. להמיס RNA ב 15-50 μL של מים diethylpyrocarbonate (DEPC) ולבדוק את ריכוז RNA.
  2. ביצוע תעתיק לאחור ו-RT-qPCR (טבלה 1)
    1. זהה את ביטוי הגן הקשור ללחץ רשתית אנדופלסמי (ERS) ואפופטוזיס על ידי qRT-PCR. השתמש ב- RNA הכולל שהופק בשלב 6.1 ושעתק אותו לאחור ל- cDNA באמצעות ערכת סינתזת cDNA בהתאם להוראות היצרן.
    2. קבע את ביטוי הגן באמצעות מערכת זיהוי PCR בזמן אמת עם תערובת מאסטר SYBR Green PCR בנפח תגובה של 20 μL.
    3. לנתח כמותית את הנתונים בשיטת 2-ΔΔCTולבטא אותם כהפרש n-fold ביחס לביטוי של β-actin. הפריימרים מוצגים בטבלה 2.

7. כתם מערבי (WB)

  1. לחלץ חלבון רקמה כולל.
    1. מניחים כמות קטנה של בלוק רקמה בחלק הכדורי של 1-2 מ"ל homogenizer, ולחתוך את בלוק הרקמה ככל האפשר עם מספריים נקיים.
    2. הוסף 400 μL (w:v=1:10) של מאגר RIPA lysis והומוגניז. לאחר מכן, הניחו אותו על קרח. לאחר מספר דקות, טוחנים שוב ומניחים על קרח. חזור על תהליך הטחינה מספר פעמים.
    3. לאחר 30 דקות של ליזה, השתמש פיפטה כדי להעביר את הליזט לצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל ומניחים את הצינור בצנטריפוגה מקוררת מראש 4 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה ב 2250 x גרם במשך 10 דקות, ולהעביר את supernatant לצינור צנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל.
  2. לכמת את החלבון.
    1. יש לדלל את תקני החלבונים בהתאם להוראות הערכה. השג שיפועים של תקנים באופן הבא: 0, 25, 125, 250, 500, 1000, 1500 ו- 2000 ננוגרם/μL.
    2. קח 2.5 μL של דגימת החלבון ודלל אותו ל 25 μL (פי 10) באמצעות מדלל הדגימה.
    3. קחו צלחת של 96 בארות והוסיפו 20 מיקרוליטר של דגימת חלבון סטנדרטית (בהתאם לשיפוע הריכוז) וחלבון מטרה לבארות, בהתאמה - שתי בארות לכל דגימת חלבון מטרה.
    4. הכינו את התמיסה המתפתחת (מוכנה לשימוש) על ידי ערבוב נוזל A ונוזל B ביחס של 50:1, והוסיפו 200 μL של תמיסה מתפתחת לכל באר.
    5. מניחים את צלחת 96 בארות עם דגימות נוספות באינקובטור ב 37 ° C למשך 30 דקות.
    6. זהה את הספיגה ב 562 ננומטר.
    7. חשב את ריכוז החלבון שיש למדוד.
      1. קח את ריכוז החלבון הסטנדרטי כקואורדינטה אנכית ואת הספיגה ב- 562 ננומטר כקואורדינטה האופקית כדי לצייר את העקומה הסטנדרטית.
      2. חישוב ריכוז חלבון המטרה על סמך הנוסחה המתקבלת מהעקומה הסטנדרטית והספיגה הנמדדת של חלבון המטרה.
    8. הוסף 180 μL של מאגר העמסה ל 20 μL של דגימת חלבון בצינור מיקרוצנטריפוגה. הניחו את צינור הצנטריפוגה באמבט מתכת ונטרלו אותו בטמפרטורה של 100°C למשך 10 דקות. השתמש בחלבון מפורק WB או לאחסן אותו ב -20 ° C.
  3. בצע immunoblotting.
    1. הגדר ג'ל אלקטרופורזה חלבון.
      1. נקו וייבשו את צלחת זכוכית יציקת הג'ל (1 מ"מ או 1.5 מ"מ) וקיבעו אותה במכשיר יציקת הג'ל.
      2. הכינו ג'ל הפרדה 10% לפי טבלה 3. מוסיפים את ג'ל ההפרדה המוגדר בין לוחות הזכוכית. מוסיפים את תמיסת הג'ל לאט כדי למנוע ייצור של בועות אוויר. לאחר מכן, להוסיף כמות מתאימה של אתנול נטול מים כדי לשטח את פני השטח הנוזליים של המפריד. השאירו אותו ב-RT למשך 20-30 דקות עד שהג'ל מתמצק.
        הערה: ככל שהמשקל המולקולרי גבוה יותר, כך ריכוז הדבק נמוך יותר, בהתאם לצורך בניסוח ריכוזים אחרים של דבק מפריד.
      3. הכינו ג'ל מרוכז 5% לפי טבלה 3. לאחר התמצקות ג'ל ההפרדה, יוצקים את השכבה העליונה של אתנול נטול מים, ממלאים את הג'ל המרוכז ומכניסים לאט לאט את מסרק הג'ל המתאים לצלחת הזכוכית (היזהרו שלא יהיו בועות אוויר). השאירו אותו ב-RT למשך 20-30 דקות כדי שהג'ל המרוכז יתמצק.
    2. בצע אלקטרופורזה.
      1. שוקלים 60.5 גרם טריס, 375 גרם גליצין ו-20 גרם סודיום דודציל סולפט (SDS). מוסיפים מים ל-2 ליטר, מחממים ב-60°C ומערבבים עד להתמוססות ליצירת תמיסת אלקטרופורזה 10x. תן לפתרון להיות ב RT; יש לדלל אותו ל-1x בעת השימוש.
      2. מוציאים את צלחת הזכוכית המכילה דבק ממכשיר יציקת הג'ל, מושכים מטה את מסרק הדבק בזרימת המים במהירות אחידה, ובמקביל מנקזים את בועות האוויר בחור הדגימה.
      3. תקן את צלחת הזכוכית במיכל האלקטרופורזה והוסף את תמיסת האלקטרופורזה 1x המוגדרת. ודא כי המיכל הפנימי מלא וכי המיכל החיצוני הוא חצי המיכל הפנימי.
      4. הוסף את אותה מסה של דגימת חלבון ו 5 μL של סמן (המשמש כדי לציין את גודל החלבון) בתוספת הדגימה היטב.
      5. הפעל את הג'ל ב 60 V במשך 20 דקות, ולאחר מכן ב 100 V במשך 90 דקות עד מאגר ההעמסה פועל לתחתית.
    3. בצע העברת ממברנה.
      1. שוקלים 60 גרם טריס ו-288 גרם גליצין, ומוסיפים מים ל-2 ליטר. מערבבים וממיסים היטב את התמיסה כדי ליצור תמיסת העברת קרום 10x, ושומרים ב-RT. לדלל ביחס של 1:2:7 (תמיסת טרנסממברנה 10x: מתנול: מים) כדי ליצור תמיסת עבודה 1x.
        הערה: יש להכין מראש תמיסת Transmembrane ולקרר אותה ל-4°C במקרר.
      2. השרו את PVDF במתנול לפרק זמן מתאים (0.5-1 דקות) כדי להפעיל את הקבוצות הטעונות חיובית על הממברנה ולהקל על הקישור עם חלבונים בעלי מטען שלילי.
      3. קח את תפס העברת הממברנה ותקן אותו לאחר הנחת הרכיבים בסדר (משטח שחור-ספוג-מסנן נייר-אלקטרופורזה ג'ל-PVDF קרום-מסנן נייר-ספוג-משטח לבן ברצף).
        הערה: היזהר להימנע מבועות אוויר; כאשר יש בועות אוויר, השתמש בגלגלת כדי לגרש את בועות האוויר.
      4. מניחים את הסד במיכל העברת הממברנה, שמים לב לעקוב אחר מיקום האלקטרודה הנכון, מכניסים שתי שקיות קרח למיכל וממלאים בנוזל העברת קרום 1x. לבסוף, הניחו את כל מיכל הטרנסממברנה בקרח.
      5. הגדר את תנאי העברת הממברנה ל- 100 V למשך שעה אחת.
        הערה: ניתן להתאים את זמן העברת הממברנה בהתאם לגודל החלבון; ככל שהמשקל המולקולרי של החלבון קטן יותר, כך זמן העברת הממברנה קצר יותר.
    4. בצע חסימה.
      1. עבור חלבונים זרחניים, השתמש ב-5% BSA (ממס TBST) כתמיסה חוסמת. עבור חלבונים שאינם זרחניים, יש להשתמש בחלב דל שומן 5% (TBST ממס) לחסימה.
      2. יוצקים את הפתרון החוסם לתוך צלחת בגודל מתאים. הכניסו את קרום ה-PVDF לצלחת וודאו שקרום ה-PVDF שקוע בתמיסת החסימה. סוגרים את המנה ודגרים ב-RT למשך שעה.
      3. הסר את הממברנה. על פי תצוגת הסמן וגודלו של כל חלבון מטרה, חתכו את הממברנה לגודל המתאים ותייגו אותה במספרים סידוריים.
    5. לדגור על הנוגדן
      1. הסר את הפתרון החוסם וספג את שאריות הנוזל עם נייר פילטר. הניחו את PVDF החתוך המתאים לדילול הנוגדנים המתאים (כולל CPR78 [1:1000], TRAF2 [1:1000], p-JNK [1:1000], קספז [1:1000] ו-GAPDH [1:1000]) והניחו אותו על השייקר הסיבובי בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.
      2. יש להוסיף 1x TBST ולשטוף ב-RT שלוש פעמים (10 דקות כל אחת).
      3. יש לדגור על קרום PVDF בדילול נוגדנים משני בהתאם להוראות היצרן ולדגור ב-RT למשך שעה אחת.
      4. שטפו את הממברנה על ידי הוספת 1x TBST ב-RT שלוש פעמים (10 דקות כל אחת).
    6. לפתח את קרום PVDF.
      1. יש לערבב כמויות שוות של נוזל A ונוזל B בערכת התמיסה הזוהרת, לנער היטב ולהתכונן לשימוש.
      2. הניחו את קרום PVDF על סרט ההיצמדות כדי להתפשט, והוסיפו במהירות ובאופן שווה את החומר הזוהר המוכן על הממברנה במהירות ובאופן שווה. יש לדגור במשך 3 דקות ב-RT, תוך הימנעות מאור.
      3. זהה את רצועות החלבונים באמצעות ריאגנטים לזיהוי כתמים מערביים משופרים (ECL).

8. ניתוח נתונים

  1. בטא את כל הנתונים כממוצע ±- S.D. בצע ניתוח סטטיסטי על ידי ANOVA חד-כיווני באמצעות תוכנת SPSS 20.0. שקול את ההבדלים מובהקים סטטיסטית כאשר p < 0.05.

תוצאות

כפי שניתן לראות בטבלה 4 ובטבלה 5, לחץ הדם הסיסטולי (SBP) ולחץ הדם הדיאסטולי (DBP) היו גבוהים יותר באופן משמעותי בקבוצת MET מאשר בקבוצת CON בין שבוע לארבעה שבועות. לאחר הטיפול ב-HTJDTLD, ה-SBP וה-DBP של החולדות היו נמוכים משמעותית מאלה שבקבוצת ה-MET. יש לציין כי לשימוש המשולב של HTJDTLD ו- EM היית?...

Discussion

יתר לחץ דם היא אחת מהפרעות הלב וכלי הדם הנפוצות ביותר המשפיעה על שליש מהאוכלוסייה הבוגרת ומעלה את הסיכון לשבץ מוחי, מחלות לב כליליות ואי ספיקת לב וכליות8. יתר לחץ דם מסוג H הוא סוג מיוחד של יתר לחץ דם המתייחס להתרחשות משותפת של יתר לחץ דם ראשוני ורמות הומוציסטאין מוגברות ומשך תש...

Disclosures

אנו מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים כלשהם העלולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של מחוז ג'ילין (לא. YDZJ202301ZYTS189).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCRYeasen,China11149EScDNA synthesis kit 
Anti-beta-actin antibodyBioss, Chinabs-0061R
Anti-caspase-3 antibodyBioss, Chinabs-0081R
Anti-GPR78 antibodyAbcam, USAab108513
Anti-JNK antibodyAbcam, USAab76572
Anti-p-JNK antibodyBioss, Chinabsm-52462R
Anti-rabbit IgG antibodyBioss, Chinabs-0295G-HRP
Anti-TRAF2 antibodyBioss, Chinabs-22372R
Bio-Rad CFX96 Touch system Bio-RadCFX96real-time PCR detection system 
ECL Western Blot SubstratesMerck, MA, USAWBULP-10ML
Enalapril maleate folic acid tabletsYangzijiang Pharmaceutical Company, China20040991
FastStart SYBR Green MasterSigmaFSSGMMRO
Fructus TrichosanthisThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
HirudoThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
intelligent noninvasive sphygmomanometer Beijing Softron Biotechnology companyBP-2010A
Lonicerae Japonicae FlosThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
MethionineSigma, USAM9500
Radix Angelicae SinensisThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma GlycyrrhizaeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma NardostachyosThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma Rhodiolae CrenulataeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma Salviae MiltiorrhizaeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix ScrophulariaeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Rat Hcy ELISA KitsShanghai Meimian Industrial Company, ChinaMM-0293R2
RIPA bufferShanghai Beyotime Biotechnology companyP0013B

References

  1. Noone, C., Dwyer, C. P., Murphy, J., Newell, J., Molloy, G. J. Comparative effectiveness of physical activity interventions and antihypertensive pharmacological interventions in reducing blood pressure in people with hypertension: Protocol for a systematic review and network meta-analysis. Syst Rev. 7 (1), 128 (2018).
  2. Huang, K., Zhang, Z., Huang, S., Jia, Y., Zhang, M., Yun, W. The association between retinal vessel abnormalities and h-type hypertension. BMC Neurol. 21 (1), 6 (2021).
  3. Tan, Y., Nie, F., Wu, G., Guo, F., Wang, Y., Wang, L. Impact of h-type hypertension on intraplaque neovascularization assessed by contrast-enhanced ultrasound. J Atheroscler Thromb. 29 (4), 492-501 (2022).
  4. Towfighi, A., Markovic, D., Ovbiagele, B. Pronounced association of elevated serum homocysteine with stroke in subgroups of individuals: A nationwide study. J Neurol Sci. 298 (1-2), 153-157 (2010).
  5. Zhong, C., et al. High homocysteine and blood pressure related to poor outcome of acute ischemia stroke in Chinese population. Plos One. 9 (9), e107498 (2014).
  6. Hao, P., Jiang, F., Cheng, J., Ma, L., Zhang, Y., Zhao, Y. Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: Evidence and potential mechanisms. J Am Coll Cardiol. 69 (24), 2952-2966 (2017).
  7. Tian, T., et al. Huotan Jiedu Tongluo decoction inhibits balloon-injury-induced carotid artery intimal hyperplasia in the rat through the perk-eif2α-atf4 pathway and autophagy mediation. Evid Based Complement Alternat Med. 2021, 5536237 (2021).
  8. Simko, F., Pechanova, O. Potential roles of melatonin and chronotherapy among the new trends in hypertension treatment. J Pineal Res. 47 (2), 127-133 (2009).
  9. Li, T., et al. H-type hypertension is a risk factor for cerebral small-vessel disease. BioMed Res Int. 2020, 6498903 (2020).
  10. Rodrigo, R., Passalacqua, W., Araya, J., Orellana, M., Rivera, G. Homocysteine and essential hypertension. J Clin Pharmacol. 43 (12), 1299-1306 (2003).
  11. Lehmann, M., Gottfries, C. G., Regland, B. Identification of cognitive impairment in the elderly: Homocysteine is an early marker. Dement Geriatr Cogn. 10 (1), 12-20 (1999).
  12. dos Santos, E. F., et al. Evidence that folic acid deficiency is a major determinant of hyperhomocysteinemia in Parkinson's disease. Metab Brain Dis. 24 (2), 257-269 (2009).
  13. Zhao, W., Gao, F., Lv, L., Chen, X. The interaction of hypertension and homocysteine increases the risk of mortality among middle-aged and older population in the United States. J Hypertens. 40 (2), 254-263 (2022).
  14. Woo, K. S., et al. Hyperhomocyst(e)inemia is a risk factor for arterial endothelial dysfunction in humans. Circulation. 96 (8), 2542-2544 (1997).
  15. Lu, F., et al. The intervention of enalapril maleate and folic acid tablet on the expressions of the grp78 and chop and vascular remodeling in the vascular smooth muscle cells of h-hypertensive rats with homocysteine. Eur Rev Med Pharmaco. 22 (7), 2160-2168 (2018).
  16. López-García, P., Moreira, D. Selective forces for the origin of the eukaryotic nucleus. BioEssays. 28 (5), 525-533 (2006).
  17. Minamino, T., Komuro, I., Kitakaze, M. Endoplasmic reticulum stress as a therapeutic target in cardiovascular disease. Circ Res. 107 (9), 1071-1082 (2010).
  18. Chen, X., Cubillos-Ruiz, J. R. Endoplasmic reticulum stress signals in the tumour and its microenvironment. Nat Rev Cancer. 21 (2), 71-88 (2021).
  19. Ji, C., Kaplowitz, N. Hyperhomocysteinemia, endoplasmic reticulum stress, and alcoholic liver injury. World J Gastroentero. 10 (12), 1699-1708 (2004).
  20. Zhang, C., et al. Homocysteine induces programmed cell death in human vascular endothelial cells through activation of the unfolded protein response. J Biol Chem. 276 (38), 35867-35874 (2001).
  21. Cunard, R. Endoplasmic reticulum stress, a driver or an innocent bystander in endothelial dysfunction associated with hypertension. Cur Hypertens Rep. 19 (8), 64 (2017).
  22. Casas, C. GRP78 at the centre of the stage in cancer and neuroprotection. Front Neurosci. 11, 177 (2017).
  23. Urano, F., et al. Coupling of stress in the ER to activation of JNK protein kinases by transmembrane protein kinase ire1. Science. 287 (5453), 664-666 (2000).
  24. Borghi, A., Verstrepen, L., Beyaert, R. TRAF2 multitasking in tnf receptor-induced signaling to nf-κb, map kinases and cell death. Biochem Pharmacol. 116, 1-10 (2016).
  25. Wen, X. -. R., et al. Butylphthalide suppresses neuronal cells apoptosis and inhibits JNK-caspase3 signaling pathway after brain ischemia /reperfusion in rats. Cell Mol Neurobiol. 36 (7), 1087-1095 (2016).
  26. Jin, M., et al. Serine-threonine protein kinase activation may be an effective target for reducing neuronal apoptosis after spinal cord injury. Neural Regen Res. 10 (11), 1830-1835 (2015).
  27. Xu, F., et al. Estrogen and propofol combination therapy inhibits endoplasmic reticulum stress and remarkably attenuates cerebral ischemia-reperfusion injury and ogd injury in hippocampus. Biomed Pharmacother. 108, 1596-1606 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

HHuotan Jiedu Tongluo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved