איסוף שדה וזיהוי שגרתי במעבדה של רודיולה קרנולטה

Summary

כאן אנו מתארים את הזיהוי של Rhodiola Crenulata מבית גידול, מורפולוגיה של צמחים, תכונות רפואיות, תכונות מיקרוסקופיות וכרומטוגרפיה של שכבה דקה.

Abstract

זיהוי חומרים רפואיים הוא הנחת היסוד והערובה לבטיחות התרופה. רוב החוקרים המדעיים יעדיפו את תהליך הזיהוי הפשוט, המהיר, היעיל והזול של צמחי מרפא. Rhodiola crenulata היא תרופה טיבטית מסורתית הגדלה בגובה רב, מופצת בעיקר באזורי טיבט, יונאן וסצ'ואן בסין. לקרנולט רודיולה יש פעילויות ביולוגיות רבות, כמו נוגדות דלקת, נוגדות היפוקסיה ונוגדות חמצון, ויש לו פוטנציאל גדול להתפתחות. עם הביקוש הגובר בשוק וירידה מהירה בתוכן המשאבים, מספר רב של מוצרים מבולבלים של Rhodiola crenulata כבר מטריד אנשים. לכן, פרוטוקול זה מציג תהליך סטנדרטי לזיהוי רודיולה קרנולטה בשטח בשילוב עם בדיקות מעבדה שגרתיות. השילוב של בית גידול, תכונות מיקרוסקופיות וכרומטוגרפיה בשכבה דקה ללא ספק יזהה את רודיולה קרנולטה במהירות, ביעילות ומבחינה כלכלית, ויתרום להתפתחות מתמשכת של הרפואה הטיבטית ולבקרת האיכות של החומרים הרפואיים.

Introduction

לרפואת צמחים יש היסטוריה ארוכה וניסיון יישומי עשיר בסין, והיא הייתה ההקלטה השיטתית הראשונה בקלאסיקה הצמחית¹ של שנונג. גילוי הארטמיסינין המיושם על מלריה קידם את התפתחות רפואת הצמחים לשלב^{חדש 1}. השימוש בטכנולוגיה מדעית מודרנית כדי לחשוף את המנגנון המדויק של רפואת הצמחים מגדיל את שיעור הניצול והביקוש לרפואת צמחים, ופותח שוק בינלאומי חדש עבורה ^2,3,4. עם זאת, זה הוביל לשורה של השפעות שליליות. ללא אנשי מקצוע יש הבנה מעורפלת של המאפיינים של רפואת צמחים, מה שהופך את השימוש ברפואת צמחים להתמודד עם סיכון בטיחותי עצום⁵.

Rhodiola crenulata, אחד הצמחים של מיני רודיולה, מופץ בעיקר בטיבט, בצפון מערב יונאן ובמערב סצ'ואן בסין (איור 1)^6,7. Rhodiola crenulata מכיל salidroside, tyrosol, חומצה גאלית, ותרכובות אחרות לטיפול במחלות הקשורות היפוקסי באמצעות הפונקציה של "ממריץ צ 'י וקידום זרימת הדם, ניקוי הדופק ומרגיע אסטמה"8,9,10,11. חקירת שדה מראה כי ניתן למצוא רודיולה קרנולטה באזורי הטלוס האלפיני, מדרונות הערוצים ונקיקי הסלע בגובה של 4,000-5,600 מ'. סביבת הגידול שלו קרה, מלאה בשמש ובקרינה עזה, והוא שייך למערכת האקולוגית של האחו האלפיני. רודיולה קרנולטה יכולה להיות מופצת באוכלוסיות למלריות ודמויות נקודה בהתאם לשטח הגידול, וזרימת גנים יכולה להתבצע באמצעות האבקה צולבת.

הפלת האבקה של הסוג רודיולה, חפירת אי חוקיות והסביבה האקולוגית המנוונת הופכים את רודיולה קרנולטה למין בסכנת הכחדה ^6,12. לאור הערך הרפואי הגבוה של רודיולה קרנולטה, מוצרים מזויפים צפויים לזרום לשוק. מאמר זה מציג את בית הגידול של Rhodiola crenulata וכמה שיטות זיהוי מעבדה נוחות. ראשית, ראינו את סביבת הגידול של Rhodiola crenulata ואת התכונות הרפואיות שלה. שנית, המיקרו-מבנה של אבקת מרפא נצפה במיקרוסקופ. השלב האחרון הוא נקודת המפתח. המרכיבים המייצגים של Rhodiola crenulata הופרדו וזוהו על פי תכונות ספיחה או פירוק שונות של רכיבים אלה בחומר מסוים. אימות מבוסס DNA או שיטות ניתוח מטבולומיות של צמחי מרפא הן מסובכות ויקרות¹³. שיטות בסיסיות, נוחות וחסכוניות אלה יכולות לזהות במהירות רודיולה קרנולטה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

Rhodiola crenulata נאסף מהר השלג Zhuoda, מחוז Ganzi, המחוז האוטונומי הטיבטי Ganzi, מחוז סצ'ואן, סין (N 31.44570°, E 99.96086°, 4892 מ '). הצמחים מאומתים כמקוריים על ידי פרופסור יי ז'אנג מבית הספר לרפואה אתנית, אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית.

1. אוסף של Rhodiola crenulata

1. צלמו את מפת סביבת המחיה של Rhodiola crenulata.
2. צלמו את כל הצמח, העלים, הקליקס וקנה השורש של Rhodiola crenulata.
3. השתמשו בשפכטל כדי לנקות את העשבים השוטים והאבנים השבורות בטווח של 1 מ' מ-Rhodiola crenulata כדי להבטיח את הכרייה החלקה שלאחר מכן.
4. חפרו את האדמה עם מעדר עד שכל הריזוספרה נראית ואספו את שורש הברז.
   הערה: יש לאסוף את השורשים וקני השורש של Rhodiola crenulata המשמשים בחלקי מרפא בסתיו, כאשר גבעולי הפרח נובלים.

2. זיהוי אופייני

1. שימו לב לתכונות המראה של Rhodiola crenulata בעין בלתי: שורשים גליליים וקצרים וקני שורש, משטח חום, אפידרמיס צהוב קרום עם דפוס ורוד, ופרוסות כתומות-אדומות או בורדו.
2. זהה אותו על ידי ריח: זה נותן ריח ריחני כאשר ליד האף.
3. זהה אותו לפי טעם: קח חתיכה קטנה של שורש לתוך הפה, תחילה ללגום ולאחר מכן ללעוס, טעם מעט מריר, ואז מתוק.

3. זיהוי מיקרוסקופי של גרגרי עמילן באבקה רפואית

1. מוציאים את האדמה על פני השטח של Rhodiola crenulata עם מברשת, לשים אותו בתנור ב 40 °C, ולהפוך את עשבי תיבול כל 24 שעות.
   הערה: קלות השבירה של חומרים רפואיים נחשבת לתקן לייבוש לחות.
2. אבקו את חומרי המרפא המיובשים באמצעות מכונת אבקה וסננו את האבקה הרפואית באמצעות מסננת מס' 3 (ראו טבלת חומרים).
3. קחו שקופית נקייה (ראו טבלת חומרים), חפרו את האבקה עם מחט לניתוח (ראו טבלת חומרים) והניחו אותה באופן שווה על שליש מהשקופית בטווח של 2 מ"מ.
4. השתמשו בטפטפת זכוכית (ראו טבלת חומרים) כדי להוסיף טיפת מים שעברו דה-יוניזציה לאבקה. השתמשו בפינצטה (ראו טבלת חומרים) כדי להחזיק קצה אחד של הכיסוי (ראו טבלת חומרים) כדי לגעת במהירות ברמת הנוזל ולכסות את האבקה.
   הערה: השתמש במחט אנטומית כדי לערבב בעדינות מים ואבקה רפואית כדי להבטיח ערבוב דגימה אחיד. לא אמורות להיות בועות אוויר בין המגלשה, האבקה וזכוכית הכיסוי.
5. פתח את המיקרוסקופ (ראה טבלת חומרים) והנח את השקופית בשלב 3.4 על הפלטפורמה כדי לאבטח אותה. כוונן את מקור האור ואת ספירלת המיקוד הגסה כדי לראות את האבקה. התאם את הספירלה הפרפוקלית העדינה עד שהרקמות נראות בבירור. עברו למטרה של פי 40 והתבוננו בגרגרי העמילן.
   הערה: עמילן את הגרגרים המוצגים כגרגרים בודדים או מרובים, ונקודת הטבור מופיעה בצורת עצם הרינג או סדק.

4. זיהוי מיקרוסקופי של קטטרים, תאי שעם, סיבים, תאי פרנכימה מעץ ומסת פיגמנט באבקה רפואית

1. קח שקופית נקייה (ראה טבלת חומרים), חפור את האבקה עם מחט כירורגית (ראה טבלת חומרים), ומקם אותה בשליש מהשקופית.
2. השתמשו בטפטפת זכוכית (ראו טבלת חומרים) כדי להוסיף טיפת כלורל הידרט (ראו טבלת חומרים) לאבקה. קח את המגלשה עם פינצטה (ראה טבלת חומרים) וחמם אותה במנורת האלכוהול שלוש פעמים, בכל פעם למשך שנייה אחת.
   הערה: יש להימנע מבועות במהלך החימום. הנוזל נשאר לא זורם, מה שמעיד על כך שהחדירה הושלמה.
3. השתמשו בטפטפת זכוכית כדי להוסיף טיפת גליצרין (ראו טבלת חומרים). השתמשו בפינצטה כדי להחזיק קצה אחד של הכיסוי כדי לגעת במהירות ברמת הנוזל.
4. פתח את המיקרוסקופ והנח את המגלשה על הפלטפורמה כדי לאבטח אותה. כוונן את מקור האור ואת ספירלת המיקוד הגסה כדי לראות את האבקה. התאם את הספירלה הפרפוקלית העדינה עד שהרקמות נראות בבירור. התבוננו בצנתר, בתאי השעם, בסיבים, בתאי פרנכימה מעץ ובבלוק פיגמנט על ידי מעבר לעדשה אובייקטיבית פי 40.
   הערה: מצולע מצולע או ארוך של תאי שעם, כלי ספירלי בעל מבנה סלילי ברור, פרנכימה של קסילם המכילה גבישי חול של סידן אוקסלט, וגוש פיגמנט אדום או חום-אדום.

5. הכנת דגימות כרומטוגרפיות בשכבה דקה (TLC) של Rhodiola crenulata והפניה שלה

1. מניחים את נייר השקילה על האיזון (ראו טבלת חומרים) ושוקלים 3 גרם אבקת רודיולה קרנולטה.
2. קח את האבקה לתוך בקבוק חרוטי 100 מ"ל (ראה טבלה של חומרים), ולהוסיף 25 מ"ל מתנול עם פיפטה בטן גדולה (ראה טבלה של חומרים). הכניסו את הבקבוק החרוטי למכשיר האולטרסוני. כוונו את ההספק ל-250 ואט, את התדר ל-40 קילו-הרץ ואת הזמן ל-30 דקות (ראו טבלת חומרים) והפעילו את המכשיר.
   הערה: מטרת מכשיר האולטרסאונד היא להבטיח כי אבקת Rhodiola crenulata מומסת לחלוטין מבלי להשפיע על התוצאות של ניסויים כרומטוגרפיים בשכבה דקה לאחר מכן.
3. הסר את הבקבוק החרוטי ושטוף את הבקבוק החיצוני במים זורמים לטמפרטורת החדר (RT).
4. לשאוף 800 μL של נוזל מוכן בשלב 5.3 עם מזרק 1 מ"ל. סנן עם קרום מסנן מיקרונקבובי 0.22 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים) ואסוף 400 מיקרוליטר של תמיסת דגימה באמצע הזרם של Rhodiola crenulata בבקבוק דגימה כרומטוגרפית.
5. שקלו והוסיפו 2 מ"ג של סלידרוסיד, טירוסול וחומצה גאלית (ראו טבלת חומרים) ל-3 בקבוקים חרוטיים נפרדים של 100 מ"ל, בהתאמה. מוסיפים 25 מ"ל מתנול עם פיפטה בטן גדולה לכל בקבוק חרוט.
6. הכניסו את הבקבוק החרוטי למכשיר האולטרסוני, כוונו את ההספק ל-250 ואט, את התדר ל-40 קילוהרץ ואת הזמן ל-30 דקות, וחזרו על שלב 5.3 (ראו טבלת חומרים).
7. לשאוף 800 μL של נוזל מוכן בשלב 5.6 עם מזרק 1 מ"ל. סנן עם קרום מסנן מיקרונקבובי 0.22 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים) ואסוף 400 מיקרוליטר של תמיסה סטנדרטית של סלידרוסיד, טירוסול וחומצה גאלית באמצע הזרם בבקבוקי דגימה כרומטוגרפיים תואמים.

6. זיהוי TLC

1. פיפטה טריכלורומתאן (5 מ"ל), אתיל אצטט (4 מ"ל), מתנול (2 מ"ל) וחומצה פורמית (0.5 מ"ל) (ראו טבלת חומרים). יש להוסיף לצד אחד של גליל הכרומטוגרפיה בעל המיכל הכפול (ראו טבלת חומרים), לנער ולערבב באופן שווה. מכסים את ראש הגליל העליון.
2. הניחו את החומצה הגאלית, הסלידרוזיד, תמיסת הטירוסול הסטנדרטית ותמיסת רודיולה קרנולטה על מדף הדגימות במיקומים A1-A4.
3. הניחו את יריעת הסיליקון בגודל 5X10 ס"מ (ראו טבלת חומרים) על שולחן הדגימה. הפעל את מכונת הדגימה האוטומטית (ראה רשימת חומרים) ופתח את שסתום בקרת האוויר.
4. פתח את תוכנת visionCATS (ראה טבלת חומרים). לחץ על New > New Folder (בשם Rhodiola crenulata sample test) > אישור. לחץ על שיטה חדשה (שם Rhodiola crenulata sample test) > אישור > ATS 4.
5. לחץ על הגדרת שלב סיום. לחץ על עקוב אחר הקצאה כדי לערוך את התיאור (חומצה גאלית, סלידרוסיד, טירוסול ודוגמת רודיולה קרנולטה ).
6. לחץ על HPTLC Steps. הגדר את פרמטרי השכבה הדקה (5 ס"מ x 10 ס"מ). בחר Application Type (פס), הגדר את הפרמטרים (Table 1) ולחץ על הלחצן OK .
7. איכות מילוי/שטיפה פתוחה. סמן את מלא רק אמצעי אחסון מתוכנת. הגדר את הרמה התחתונה של הבקבוקון (מ"מ) ל- 0.5 ולחץ על הלחצן אישור.
8. לחץ על Execute Method.
9. לחץ על הלחצן עקוב אחר הקצאה , סמן את מרכז והגדר את הפרמטרים (טבלה 2).
10. לחצו על הלחצן 'המשך ' לדגימה אוטומטית.
11. כבו את מכונת הדגימה האוטומטית ואת שסתום האוויר. הסירו את יריעת הסיליקון ממכונת הדגימה האוטומטית.
12. הכניסו את יריעת הסיליקון לצד השני של גליל הכרומטוגרפיה של המיכל הכפול בשלב 6.1, כסו את ראש הצילינדר העליון ורוו מראש למשך 20 דקות.
13. מהדקים בעדינות את הקצה העליון של צלחת השכבה הדקה עם טוויטר, מכניסים במהירות את יריעת הסיליקון לסוכן הפיתוח ומכסים את ראש הגליל העליון.
    הערה: הסר את יריעת הסיליקון כאשר הקצה הקדמי המתקפל נמצא במרחק של 0.5-1.0 ס"מ מהקצה העליון של לוח השכבה הדק.
14. לאחר שהממס האורגני מתאדה, רססו את התמיסה הכרומוגנית על פני יריעת הסיליקון בטמפרטורת החדר לקבלת תוצאות כרומוגניות.
    הערה: התמיסה הכרומוגנית היא תמיסה מימית המכילה 2% FeCl₃ ו-1% K₃[Fe(CN)₆].

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

פרוטוקול ניסויי זה מתאר זיהוי ואיסוף של רודיולה בקרנולט בשטח. קרזולט רודיולה נוטה לחיות באזורי טאלוס אלפיניים, מדרונות גאיות ונקיקי סלע בגובה רב. סביבת הגידול, הצמח השלם, הפרח והעלים של קרודיולה יכולים להיות מוצגים באיור 2. לקרנולט רודיולה יש קנה שורש חו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ישנם יותר מ -90 מינים של צמחי רודיולה בעולם, ויותר מ -60% מכל המינים נמצאים בסין, נפוצים כולל Rhodiola crenulata, Rhodiola rosea, Rhodiolas achalinensis, ו Rhodiola algida¹⁷. Rhodiola crenulata, שתועדה בחלק הראשון של הפרמקופיאה הסינית (2020), היא תרופה טיבטית מסורתית הגדלה בגובה רב. הביקוש בשוק לרודיולה ק?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm millipore filter	Millipore	SLGP033RB
Automatic sampling machine	CAMAG	ATS 4
Chloral hydrate	Fuzhou Brunei Technology Co., Ltd	ST1002
Chromatographic sample bottles	Zhejiang ALWSCI Technology Co., Ltd	C0000008
Conical flask	Sichuan Shubo Co., Ltd	1121
Cover glass	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd	10211818c
Dissecting needle	Shanghai Bingyu Fluid Technology Co., Ltd	BY-5026
Electronic balance	SHIMADZU	ATX124
Ethyl acetate	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	2022120901
Formic acid	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	2021110801
Gallic acid	Chengdu Herbpurify Co., Ltd	M-017
Glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10010618
High speed  crusher	Beijing Zhongxingweiye Instrument Co., Ltd	FW-100
Methanol	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	20230108
Microscope	Chongqing Oprec Nistrument Co.,  Ltd	B203
Microscope slide	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd	7105P-G
Oven	Shanghai Yuejin Medical Equipment Co., Ltd	DHG-8145
Pharmacopoeia sieve	Hangzhou Xingrun sieve factory	572423281330
Pipette	Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd	120302008
Salidroside	Chengdu Herbpurify Co., Ltd	H-040
Saturate tank	Yancheng Liegu Technology Co., Ltd	10*20 P-1
Silica gel plate	Yantai Jiangyou Silica Gel Development  Co., Ltd	HSG20211227
Trichloromethane	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	20221013-1
Tweezer	Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd	130302027
Tyrosol	Chengdu Herbpurify Co., Ltd	L-042
Ultrasound equipment	Ningbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., Ltd	SB-8200DTS
Volumetric pipet	Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd	120301006