שימוש בהדמיה חיה של Ex Vivo כדי לחקור חלוקות תאים ותנועות במהלך חידוש שיניים של עכבר

Summary

הדמיה חיה Ex vivo היא טכניקה רבת עוצמה לחקר התהליכים הדינמיים של תנועות תאים ואינטראקציות ברקמות חיות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המיישם מיקרוסקופ של שני פוטונים למעקב חי אחר תאי אפיתל דנטליים בחותכות עכבר בוגרות שלמות בתרבית.

Abstract

החותכת לעכבר הגדלה ללא הרף מתגלה כמערכת מודל בעלת יכולת טיפול גבוהה כדי לחקור את הרגולציה של תאי גזע אפיתל ומזנכימליים בוגרים והתחדשות שיניים. אוכלוסיות אבות אלה מחולקות, נעות ומתמיינות באופן פעיל כדי לשמור על הומאוסטזיס רקמות ולחדש תאים אבודים באופן מגיב. עם זאת, ניתוחים מסורתיים באמצעות קטעי רקמות קבועים לא יכלו ללכוד את התהליכים הדינמיים של תנועות תאים ואינטראקציות, מה שהגביל את יכולתנו לחקור את התקנות שלהם. מאמר זה מתאר פרוטוקול לשמירה על חותכות עכבר שלמות במערכת תרבית אקספלנט ותאי אפיתל דנטליים במסלול חי באמצעות מיקרוסקופ קיטוע זמן מולטיפוטון. טכניקה זו מוסיפה לארגז הכלים הקיים שלנו למחקר דנטלי ומאפשרת לחוקרים לרכוש מידע מרחבי-זמני על התנהגויות תאים וארגונים ברקמה חיה. אנו צופים כי מתודולוגיה זו תסייע לחוקרים להמשיך ולחקור מנגנונים השולטים בתהליכים התאיים הדינמיים המתרחשים הן במהלך חידוש השיניים והן במהלך התחדשותן.

Introduction

במהלך שני העשורים האחרונים, החותכת לעכבר התפתחה כפלטפורמה רבת ערך לחקר עקרונות ויסות תאי גזע בוגרים והתחדשות שיניים ^1,2. החותכת לעכבר גדלה ברציפות ומתחדשת לאורך כל חיי החיה. הוא עושה זאת על ידי שמירה על תאי גזע אפיתל ומזנכימליים, אשר יכולים לחדש את עצמם ולהתמיין לסוגי תאים שונים של השן ^1,2. בעוד שתאי גזע אפיתליאליים דנטליים מולידים אמלובלסטים, המפרישים את מטריצת האמייל, תאי גזע מזנכימליים דנטליים מולידים אודונטובלסטים, צמנטובלסטים ופיברובלסטים, היוצרים דנטין, צמנטום ורצועה חניכית, בהתאמה 3,4,5,6.

Protocol

כל העכברים הוחזקו במתקנים נטולי פתוגנים של בעלי חיים באוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס (UCLA) או באוניברסיטה העברית בירושלים (HUJI). כל הניסויים בעכברים בוצעו בהתאם לתקנות ולפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) או (MD-23-17184-3; הוג'י). זרימת עבודה כללית של שלבי הניסוי מוצגת באיור 2A. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל המכשירים, הריאגנטים והחומרים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הכנת פתרונות וג'לים

1. אמצעי דיסקציה: הכינו DMEM/F12 טרי עם 0.5% גלוקוז ושמרו אותו חם בטמפרטורה של 37°C עד לצורך בשלב 2.4.
   הערה: אנו ....

תוצאות

האזור האפי של חותכת העכבר הבוגר עטוף בתוך הלסת התחתונה (איור 1) ולכן אינו נגיש ישירות להדמיה ולמעקב חי אחר תאי האב השוכנים באזור הגדילה. לכן, פיתחנו שיטה לחלץ את כל החותכת מעצם הלסת ולתחזק אותה במערכת תרבית אקספלנט עבור מיקרוסקופ בהילוך מהיר של שני פוטונים (איור 2<.......

Discussion

הדמיית רקמות חיות היא טכניקה חשובה המאפשרת לנו לחקור את התהליכים וההתנהגויות הדינמיים של תאים כאשר הם נשמרים בסביבת הנישה שלהם⁴¹. באופן אידיאלי, הדמיה חיה מבוצעת in vivo עם רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה. עם זאת, הדמיה in vivo עבור איברים יונקים יכול להיות מאתגר בשל חוסר נגישו.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well, flat bottom tissue culture plate	Olympus plastics	25-107
25x HC IRAPO motCORR water dipping objective	Leica	11507704
Ascorbic acid (Vitamin C)	Acros Organics	352685000
D-(+)-Glucose bioxtra	Sigma Aldrich	G7528
Delta T system	Bioptechs	0420-4	Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup
Dissection microscope- LEICA S9E	Leica	LED300 SLI
DMEM/F12	Thermo Scientific	11039047	Basal media without phenol red
Feather surgical blade (#15)	Feather	72044-15
Fine forceps	F.S.T	11252-23
Glutamax	Thermo Scientific	35050-061	Glutamine substitute
Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective	Leica	n/a
low-melting agarose	NuSieve	50080
non-essential amino acids (100x)	Thermo Scientific	11140-050
penicillin–streptomycin	Thermo Scientific	15140122	10,000 U/mL
Petri dish	Gen Clone	32-107G	90 mm
Rat serum	Valley Biomedical	AS3061SC	Processed for live imaging
Razor blade #9	VWR	55411-050
Scalpel handle	F.S.T	10003-12
Scissors	F.S.T	37133
serrated forceps	F.S.T	11000-13
spring scissors	F.S.T	91500-09