הדגמה של תרבית יריעות תאים בהרכבה עצמית ויצירה ידנית של אורגנואיד תלת-ממדי דמוי גיד/רצועה באמצעות פיברובלסטים עוריים אנושיים

Summary

כאן אנו מדגימים מודל אורגנואיד תלת שלבי (הרחבה דו-ממדית [2D], גירוי דו-ממדי, הבשלה תלת-ממדית [3D]) המציע כלי מבטיח למחקר בסיסי בגידים ושיטה פוטנציאלית ללא פיגומים להנדסת רקמות גידים.

Abstract

גידים ורצועות (T/L) הם מבנים חזקים המאורגנים היררכית המאחדים את מערכת השלד והשרירים. לרקמות אלה יש מטריצה חוץ-תאית עשירה בקולגן מסוג I (ECM) ותאי שושלת T/L המסודרים בקפידה הממוקמים בעיקר בשורות מקבילות. לאחר פציעה, T/L דורשים זמן רב לשיקום עם סיכון גבוה לכישלון ולעתים קרובות תוצאות תיקון לא משביעות רצון. למרות ההתקדמות האחרונה במחקר הביולוגיה של T/L, אחד האתגרים שנותרו הוא שבתחום T/L עדיין חסר פרוטוקול התמיינות סטנדרטי המסוגל לשחזר את תהליך היווצרות T/L במבחנה. לדוגמה, התמיינות עצם ושומן של תאים מקדימים מזנכימליים דורשת רק תרבית תאים דו-ממדית סטנדרטית (2D) ותוספת של אמצעי גירוי ספציפיים. לצורך התמיינות לסחוס, יש צורך בתרבית כדוריות תלת מימדית (תלת מימדית) ותוספת של TGFß. עם זאת, התמיינות תאים לגיד דורשת מודל תרבית תלת ממדי מסודר מאוד, אשר באופן אידיאלי צריך להיות נתון גם לגירוי מכני דינמי. הקמנו מודל אורגנואיד בן 3 שלבים (הרחבה, גירוי והתבגרות) כדי ליצור מבנה דמוי מוט תלת-ממדי מתוך יריעת תאים בהרכבה עצמית, המספקת מיקרו-סביבה טבעית עם גורמי ECM, אוטוקרינים ופרקריניים משלה. לאורגנואידים דמויי מוטות אלה יש ארכיטקטורה תאית רב-שכבתית בתוך ECM עשיר וניתן לטפל בהם די בקלות לחשיפה למתח מכני סטטי. כאן, הדגמנו את פרוטוקול 3 השלבים באמצעות פיברובלסטים עוריים הזמינים באופן מסחרי. אנו יכולים להראות שסוג התא הזה יוצר אורגנואידים חזקים ושופעי ECM. ההליך המתואר יכול להיות ממוטב עוד יותר במונחים של מדיה תרבותית ואופטימיזציה לקראת גירוי מכני צירי דינמי. באותו אופן, מקורות תאים חלופיים יכולים להיבדק עבור הפוטנציאל שלהם ליצור אורגנואידים T / L ובכך לעבור התמיינות T / L. לסיכום, הגישה האורגנואידית התלת-ממדית המבוססת יכולה לשמש כמודל למחקר בסיסי של גידים ואפילו להנדסת T/L ללא פיגומים.

Introduction

גידים ורצועות (T/L) הם מרכיבים חיוניים של מערכת השלד והשרירים המספקים תמיכה חיונית ויציבות לגוף. למרות תפקידן הקריטי, רקמות חיבור אלה מועדות להתנוונות ולפציעות, הגורמות לכאב ולפגיעה בניידות¹. יתר על כן, אספקת הדם המוגבלת שלהם ויכולת הריפוי האיטית שלהם עלולים להוביל לפציעות כרוניות, בעוד שגורמים כגון הזדקנות, תנועה חוזרת ונשנית ושיקום לא תקין מגבירים עוד יותר את הסיכון לניוון ופציעה². טיפולים קונבנציונליים, כגון מנוחה, פיזיותרפיה והתערבויות כירורגיות, אינם מסוגלים לשחזר באופן מלא את המבנה והתפקוד של T/L. במהלך השנים האחרונות, חוקרים שאפו להבין טוב יותר את האופי המורכב של T / L על מנת לחפש טיפולים יעילים להפרעות T / L ^3,4,5. T/L נבדלים על ידי מבנה מאורגן היררכית, מטריצה חוץ-תאית (ECM), המורכב בעיקר מסיבי קולגן מסוג I ופרוטאוגליקנים, תכונה שקשה לשכפל במבחנה⁶. מודלים מסורתיים של תרביות תאים דו-ממדיות (2D) אינם מצליחים ללכוד את הארגון התלת-ממדי (3D) האופייני של רקמות T/L, ומגבילים את פוטנציאל התרגום שלהם, כמו גם מעכבים את ההתקדמות החדשנית בתחום התחדשות T/L.

לאחרונה, הפיתוח של מודלים אורגנואידים תלת-ממדיים הציע אפשרויות חדשות לקידום מחקר בסיסי והנדסת רקמות ללא פיגומים של סוגי רקמות שונים 7,8,9,10,11,12,13. לדוגמה, כדי לחקור צומת מיוטנדי, Larkin et al. 2006 פיתחו מבני שרירי שלד תלת-ממדיים יחד עם מקטעי גידים מאורגנים עצמיים הנגזרים מגיד זנב חולדה¹⁰. יתר על כן, שילה ועמיתיו 2013, באמצעות שימוש בתעלות גידול מצופות פיברונקטין במיקרו-מכונה, כיוונו את ההרכבה העצמית של פיברובלסטים עוריים אנושיים ליצירת סיבים תאיים ללא סיוע של פיגומים תלת-ממדיים, גישה שיכולה ללכוד תכונות מפתח של התפתחות גידים עובריים¹¹. במחקר שנערך על ידי Florida et al. 2016, תאי סטרומה ממח עצם הורחבו תחילה לשושלות עצם ורצועות, ולאחר מכן שימשו ליצירת יריעות תאים חד-שכבתיות בהרכבה עצמית, אשר יושמו לאחר מכן ליצירת מבנה רב-פאזי של עצם-רצועה-עצם המחקה את הרצועה הצולבת הקדמית הטבעית, מודל שמטרתו לשפר את ההבנה של התחדשות רצועות¹². כדי להבהיר תהליכי מכנוטרנסדוקציה של גידים, Mubyana et al. 2018 השתמשו במתודולוגיה נטולת פיגומים שבאמצעותה נוצרו סיבי גיד בודדים ונתונים לפרוטוקול העמסה מכני¹³. אורגנואידים הם מבנים תלת-ממדיים המאורגנים בעצמם המחקים את הארכיטקטורה המקורית, המיקרו-סביבה והפונקציונליות של רקמות. תרביות אורגנואידים תלת-ממדיות מספקות מודל רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית לחקר ביולוגיה של רקמות ואיברים, כמו גם פתופיזיולוגיה. מודלים כאלה יכולים לשמש גם כדי לגרום להתמיינות ספציפית לרקמות של סוגי תאי גזע / אב שונים^14,15. לפיכך, יישום מודלים אורגנואידים תלת ממדיים בתחום הביולוגיה T/L והנדסת רקמות הופך לגישה אטרקטיבית מאוד ^9,16. מקורות תאים חלופיים יכולים להיות מיושמים עבור הרכבת אורגנואידים ולעורר לקראת התמיינות טנוגנית. סוג תא רלוונטי אחד המשמש להדגמה במחקר זה הוא פיברובלסטים עוריים ^7,17,18. תאים אלה נגישים בקלות באמצעות הליך ביופסיה של העור, שהוא פחות פולשני בהשוואה לניקוב מח עצם או שאיבת שומן וניתן להכפיל אותם די מהר למספרים גדולים בשל יכולת ההתרבות הטובה שלהם. לעומת זאת, סוגי תאים מיוחדים יותר, כגון פיברובלסטים תושבי T/L, מאתגרים יותר לבידוד והרחבה. לכן, פיברובלסטים עוריים שימשו גם כנקודת מוצא לטכנולוגיות תכנות מחדש של תאים לקראת תאי גזע עובריים פלוריפוטנטיים מושרים¹⁹. חשיפת פיברובלסטים עוריים לתנאי תרבית תלת-ממדיים ספציפיים ולרמזי איתות, כגון טרנספורמציה של גורם גדילה-בטא 3 (TGFß3), אשר דווח כי הוא פועל כמווסת מרכזי של תהליכים תאיים שונים, כולל היווצרות ותחזוקה של T/L, יכול להגביר את ההתמיינות הטנוגנית שלהם במבחנה המובילה לביטוי גנים ספציפיים לגידים ולשקיעת T/L-טיפוסי ECM^{20, 21}.

כאן, אנו מתארים ומדגימים פרוטוקול אורגנואיד תלת-שלבי שהוקם ויושם בעבר (הרחבה דו-ממדית, גירוי דו-ממדי והבשלה תלת-ממדית) תוך שימוש בפיברובלסטים עוריים אנושיים רגילים בוגרים (NHDFs) הזמינים מסחרית כמקור תא, ומציע מודל רב ערך לחקר טנוגנזה במבחנה ⁷. למרות העובדה שמודל זה אינו שווה ערך לרקמת In vivo T/L, הוא עדיין מספק מערכת רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית שניתן להשתמש בה לחקר מנגנוני התמיינות תאית, חיקוי פתופיזיולוגיה של T/L במבחנה, והקמת פלטפורמות לרפואה מותאמת אישית וסינון תרופות. יתר על כן, בעתיד, מחקרים יכולים להעריך אם אורגנואידים תלת-ממדיים מתאימים להנדסת T/L נטולת פיגומים על ידי אופטימיזציה נוספת, כמו גם ניתנים לשימוש לפיתוח מבנים חזקים מבחינה מכנית בקנה מידה הדומים מאוד לממדים ולתכונות המבניות והביופיזיות של רקמות T/L מקוריות.

Protocol

הערה: כל השלבים חייבים להתבצע באמצעות טכניקות אספטיות.

1. תרבות וטרום התרחבות של NHDFs

1. הפשירו במהירות את בקבוקון ההקפאה המכיל פיברובלסטים עוריים אנושיים רגילים (NHDFs, 1 x 10⁶ תאים) בטמפרטורה של 37°C עד שהם כמעט מפשירים.
2. יש להוסיף באיטיות 1 מ"ל של מדיום גידול פיברובלסטים שחומם מראש 2 (ערכה מוכנה לשימוש הכוללת מדיום בסיסי, סרום עגל עוברי 2% (FCS), גורם גדילה פיברובלסט בסיסי (bFGF) ואינסולין) בתוספת 1% פניצילין/סטרפטומיצין (עט/סטרפטוקו) (מדיום NHDF), שחומם מראש ב-37°C לתאים.
3. מעבירים את התאים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
4. הסר את supernatant. להשהות מחדש את גלולת התא ב 12 מ"ל של מדיום NHDF שחומם מראש.
5. מעבירים את התאים לבקבוק T-75 ומנערים לזמן קצר בצורה צולבת. מניחים את בקבוק T-75 ב 37 ° C באינקובטור 5% CO₂ לח.
6. שנה את המדיום כל יומיים. התבוננו ב- NHDFs תחת מיקרוסקופ עד שהם מגיעים למפגש של 70% - 80%.

2. הרחבה דו-ממדית

1. מוציאים את בקבוק T-75 של האינקובטור ומסירים את מדיום ה-NHDF. שטפו את התאים במי מלח חומץ פוספט שחומם מראש (PBS).
2. הוסף 3 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA לתאים. דוגרים על התאים בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח של 5% CO₂ עד שהתאים מתנתקים מהבקבוק (כ-3 דקות).
3. הוסף 6 מ"ל של מדיום NHDF שחומם מראש כדי לנטרל את פעולת הטריפסין. מעבירים את התאים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
4. צנטריפוגו את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב RT ולהסיר את supernatant.
5. יש להשהות מחדש את כדורית התא ב-DMEM (Modified Eagles Medium) של Dulbecco בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS), 1x MEM חומצות אמינו, 1% עט/סטרפטוקו, שחומם מראש ב-37°C.
6. צלחת NHDFs בצלחת תרבית תאים דבק 10 ס"מ בצפיפות של 8 x 10³ NHDFs / cm² (בסך הכל, 4.4 x 10⁵ NHDFs לכל צלחת 10 ס"מ). התנדנדו בעדינות בצורה צולבת.
7. מניחים את צלחת תרבית התאים בקוטר 10 ס"מ בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח CO₂ של 5%. שנה את המדיום כל יומיים
8. עקוב אחר התאים תחת מיקרוסקופ עד הגעה למפגש של 100% (כ -5 ימים).

3. גירוי דו-ממדי

1. הוציאו את צלחות תרבית התאים בקוטר 10 ס"מ המכילות את ה-NHDF (משלבים 2.6 ו-2.7) מהאינקובטור. מוציאים את מדיום התרבית ושוטפים את התאים עם PBS שחומם מראש.
2. הוסף 10 מ"ל של DMEM גלוקוז גבוה בינוני בתוספת 10% FBS, 50 מיקרוגרם / מ"ל חומצה אסקורבית, ו 1% עט / strep, מחומם מראש ב 37 ° C.
3. הניחו את צלחת הפטרי בטמפרטורה של 37°C באווירה לחה של 5% CO₂ . שנה את המדיום כל יומיים.
4. עקוב אחר NHDFs תחת מיקרוסקופ במשך 14 ימים.

התבגרות 4. 3D

1. מוציאים את צלחת תרבית התאים בקוטר 10 ס"מ מהאינקובטור ומסירים את מדיום הגלוקוז הגבוה DMEM.
2. בעדינות ובמהירות לנתק את גיליון התא שנוצר מן הצלחת עם מגרד התא. תוך כדי ניתוק, גלגלו בו זמנית את יריעת התא לאורגנואיד דמוי מוט תלת-ממדי.
3. הרימו והניחו את האורגנואידים מסוג NHDF בצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ שאינה נצמדת (לתאים). סוג מנה זה משמש למניעת נדידת תאים מהאורגנואיד לפלסטיק.
4. בנקודת זמן זו או יום לאחר מכן (יום 0 או יום 1 להבשלה תלת-ממדית), אספו חלק מהאורגנואידים לניתוחים נוספים כגון משקל רטוב, הערכה היסטולוגית (אורגנואידים ביום 1 עדיפים ככל שהם הופכים קומפקטיים יותר), RNA ובידוד חלבונים.
5. תקן את הקצוות של האורגנואיד עם פיני מתכת כדלקמן:
   1. החזק צד אחד של האורגנואיד בזהירות עם טוויטר, ועם טוויטר אחר, החל בעדינות מתיחה ידנית של כ -10% התארכות צירית. כדי להעריך את התארכות הצירית של 10%, השתמש בנייר מילימטרי או בסרגל.
   2. לאחר מכן, הרימו סיכת מתכת אחת עם הפינצטה ולחצו ידנית למטה דרך קצה האורגנואיד לתוך צלחת הפלסטיק כדי לתקן אותה. חזור על הליך זה עם הסיכה השנייה בקצה השני של האורגנואיד.
6. הוסף 10 מ"ל של DMEM גלוקוז גבוה בינוני בתוספת 10% FBS, 1x MEM חומצות אמינו, 50 מיקרוגרם / מ"ל חומצה אסקורבית, 10 ng / mL TGFß3, ו 1% עט / strep, מחומם מראש ב 37 ° C.
7. הניחו את המנה בקוטר 10 ס"מ בטמפרטורה של 37°C באווירה לחה של 5% CO₂ . שנה את המדיום כל יומיים.
8. עקוב אחר האורגנואידים באופן קבוע במשך 14 יום.
   הערה: הסיכות עשויות להשתחרר, ולכן לתקן מחדש באמצעות אותה טכניקה כמתואר בשלב 4.5.
9. לאחר 14 יום, להסיר את מדיום גלוקוז גבוה DMEM מן האורגנואידים. שטפו את האורגנואידים עם PBS שחומם מראש.
10. מדדו אורגנואידים למשקל רטוב ביום 0 וביום 14 באמצעות סולם מדויק.
    1. הניחו צלחת ריקה בקוטר 10 ס"מ על המאזניים והורידו את המשקל לאפס כדי לוודא שרק משקל האורגנואידים נמדד. מוציאים את מדיום התרבית במלואו מהכלי בקוטר 10 ס"מ ומודדים את המשקל הרטוב של האורגנואיד אחד אחד.
       הערה: במחקר זה, ביום 0, שלושה אורגנואידים לכל תורם, וביום 14, שני אורגנואידים לכל תורם נשקלו.
11. על פי מטרות המחקר, ליישם חלק מהאורגנואידים של NHDF בניתוחים היסטולוגיים נוספים או להקפיא אותם מיד בחנקן נוזלי באמצעות צינורות סטריליים נטולי DNA/RNA לבידוד DNA, RNA וחלבונים לאחר מכן ולאחר מכן לאחסן אותם ב -80 ° C.
12. לחקירה היסטולוגית, תקן כל אורגנואיד ב- 5 מ"ל של פרפורמלדהיד 4% מקורר מראש (4 ° C) ב- PBS (מותאם ל- pH ניטרלי) למשך 45 דקות על קרח, ולאחר מכן שטיפת PBS ב- RT (2 x 5 דקות כל אחד).
13. Cryoprotect את האורגנואידים הקבועים באמצעות שיפוע סוכרוז על ידי הנחת האורגנואידים בצנצנות זכוכית עבור היסטולוגיה. לדגור על האורגנואידים ב-10% סוכרוז בתמיסת PBS במשך שעתיים ב-4°C, לאחר 20% סוכרוז/PBS במשך שעתיים ב-4°C, ולבסוף, 30% סוכרוז/PBS למשך הלילה ב-4°C. החליפו את תמיסות הסוכרוז על ידי כך שתחילה תוציאו אותן ואז תתמלאו בתמיסה החדשה.
14. הטמע את האורגנואידים בקריו-מדיום.
    1. מניחים צלחת נחושת על קרח יבש בקופסת קלקר ומצננים למשך 10 דקות.
    2. לאחר מכן, הניחו קריומולד פלסטיק, ממולא מראש בקריו-מדיום, על צלחת הנחושת ולחצו בעדינות את האורגנואיד לתחתית הקריומולד באמצעות פינצטה. המתן עד שהקריומדיום קפוא לחלוטין.
    3. עבור אורגנואידים ארוכים, תחילה לחתוך לשניים עם אזמל ולשים את שני חצאים מקבילים זה לזה ב cryomold. חזור על ההליך עבור כל אורגנואיד המיועד לעבור ניתוח היסטולוגי.
15. אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של -20°C עד להקפאה.
16. באמצעות קריוטום חותכים את האורגנואידים לאורכם במקטעים בעובי 10 מיקרומטר ובכפוף לצביעה היסטולוגית כגון המטוקסילין ואאוזין (H&E) באמצעות פרוטוקול^{סטנדרטי 8}.

תוצאות

מודל האורגנואידים התלת-ממדיים T/L הוקם בעבר והודגם כאן על ידי יישום NHDF שנרכש מסחרית (n = 3, 3 אורגנואידים לכל תורם, NHDF שימשו במעברים 5-8). זרימת העבודה של המודל מסוכמת באיור 1. איור 2 מראה תמונות מייצגות של ניגודיות פאזה של תרבית NHDF במהלך טרום ההתפשטות בצלוחיות T-75 (

Discussion

התוצאות שהודגמו במחקר זה מספקות תובנות חשובות לגבי ביסוס ואפיון מודל האורגנואיד התלת-ממדי NHDF לחקר רקמות T/L. פרוטוקול 3 השלבים הוביל להיווצרות אורגנואידים דמויי מוט תלת-ממדי המציגים תכונות אופייניות של נישת T/L. מודל זה דווח בעבר ב- Kroner-Weigl et al. 2023⁷ והודגם בפירוט רב כאן.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	A8960
10 cm adherent cell culture dish	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	CLS430167
10 cm non-adherent petri dish	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	CLS430591
Cryo-medium	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	4583
Cryomold standard	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	4557
D(+)-Sucrose	AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany	A2211
DMEM high glucose medium	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-HA
DMEM low glucose	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-LPXA
Fetal bovine serum	Anprotec, Bruckberg, Germany	AC-SM-0027
Fibroblast growth medium 2	PromoCell, Heidelberg, Germany	C-23020
H&E staining kit	Abcam	ab245880
Inverted microscope with high resolution camera	Zeiss	NA	Zeiss Axio Observer with  Axiocam 506
MEM amino acids	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	NEAA-B
Metal pins	EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic	04.31
Normal human dermal fibroblasts	PromoCell, Heidelberg, Germany	C-12302
Paraformaldehyde	AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	A3813
Penicillin/streptomycin	Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany	15140122
Phosphate buffer saline	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	P4417
TGFß3	R&D Systems, Wiesbaden, Germany	8420-B3
Trypsin-EDTA 0,05% DPBS	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	TRY-1B