בדיקת כימיה של צטיל קליק למדידת אצטילטרנספראז היסטון 1 אצטילציה

Summary

בדיקות כימיות מהירות ומדויקות לסינון מעכבים ספציפיים הן כלי חשוב בארסנל פיתוח התרופות. כאן, אנו מציגים בדיקה כימית מדרגית של קליק אצטיל-קליק כדי למדוד את העיכוב של פעילות אצטילציה HAT1.

Abstract

HAT1, הידוע גם בשם היסטון אצטילטרנספראז 1, ממלא תפקיד מכריע בסינתזה של כרומטין על ידי ייצוב ואצטילציה של H4 מתהווה לפני הרכבת נוקלאוזומים. הוא נדרש לצמיחת הגידול במערכות שונות, מה שהופך אותו למטרה פוטנציאלית לטיפול בסרטן. כדי להקל על זיהוי תרכובות שיכולות לעכב פעילות אנזימטית של HAT1, פיתחנו בדיקת אצטיל-קליק לסינון מהיר. בבדיקה פשוטה זו, אנו משתמשים ב- HAT1/Rbap46 רקומביננטי, אשר מטוהר מתאים אנושיים פעילים. השיטה משתמשת באנלוגי אצטיל-CoA 4-pentynoyl-CoA (4P) בגישה כימיית קליק. זה כרוך בהעברה אנזימטית של ידית אלקין דרך תגובת אצילציה תלוית HAT1 לפפטיד H4 N-terminal ביוטינילציה. לאחר מכן הפפטיד שנלכד משותק על לוחות נויטרווידין, ולאחר מכן מתפקד כימיית קליק עם ביוטין-אזיד. לאחר מכן, גיוס סטרפטווידין-פרוקסידאז משמש לחמצון אדום אמפלקס, וכתוצאה מכך פלט פלואורסצנטי כמותי. על ידי החדרת מעכבים כימיים במהלך תגובת האצילציה, אנו יכולים לכמת עיכוב אנזימטי בהתבסס על הפחתה של האות הפלואורסצנטי. חשוב לציין, תגובה זו ניתנת להרחבה, ומאפשרת סינון בתפוקה גבוהה של מעכבים פוטנציאליים לפעילות אנזימטית HAT1.

Introduction

בין האצטילטרנספראזות האיקריוטיות הרבות, HAT1 היה ההיסטון אצטילטרנספראז הראשוני שבודד ^1,2,3. מחקרים מאוחרים יותר ביססו היטב את תפקידו המרכזי בשכפול הכרומטין, במיוחד בסינתזה של נוקלאוזומים חדשים במהלך שלב^{S 4}. מאמצי המחקר שלנו הובילו להכרה כי HAT1 מגורה מאוד על ידי טיפול בגורם גדילה אפידרמלי (EGF) בתאי חלב⁵. יתר על כן, התברר כי HAT1 נדרש להתרבות תאים מהירה והיווצרות גידולים in vivo 6,7,8,9. הנתונים מצביעים על כך ש- HAT1 הוא קריטי בתיאום תהליכים אנאבוליים ואפיגנטיים לחלוקת תאים, ומניע את צמיחת הגידול.

HAT1 di-acetylates זנב אמינו-טרמינלי של היסטון H4 על ליזין 5 ו 12 בקומפלקס עם חלבון מלווה Rbap46, אשר קושר את ההיסטון ומציג את האמינו-טרמינוס ל- HAT1. טטרמרים היסטון או דיזומים¹⁰, יחד עם HAT1/Rbap46 ומלווי היסטון^{אחרים 11}, מיובאים לאחר מכן לגרעין. לאחר מכן היסטונים משוחררים כדי להיות מופקדים במזלג השכפול, או באתרים אחרים כדי לתמוך בהפעלה או דיכוי של גנים. הפונקציה של סימן הדי-אצטילציה HAT1 על היסטון H4 אינה מובנת במלואה. סביר להניח שהוא מוסר במהירות בטווח של 15-30 דקות על ידי פעולה של deacetylases היסטון 12,13,14,15 לאחר H4 מוכנס לכרומטין. לפיכך, סימן הדי-אצטילציה HAT1 אינו מופץ בכרומטין ועשוי שלא לשמש תפקיד אפיגנטי אמיתי, אם כי תפקיד בגיוס אנזימים משנים כרומטין-לכרומטין המתהווה הועלה¹². כמו כן, HAT1 אינו אצטילט כרומטין; פעילותו מוגבלת להיסטונים מסיסים.

הפיתוח של מעכבי אצטילטרנספראז היסטון במולקולות קטנות התעכב על ידי בדיקות לא ספציפיות ובעלות תפוקה נמוכה, ולעתים קרובות הביא ליצירת תרכובות תגובתיות ביולוגיות^16,17. בדיקת תקן הזהב למדידת פעילויות אצטילטרנספראז דורשת שימוש ב- ³H-אצטיל-coA, המגביל את התפוקה ודורש קרינה. עם זאת, לאחרונה, מעכבי אצטילטרנספראז ספציפיים וחזקים מאוד של מולקולות קטנות המכוונות ל- CBP/p300¹⁸ ו- KAT6A/B^19,20 תוארו ואושרו באמצעות שימוש ב- ³H-אצטיל-CoA. בהמשך, בדיקות משופרות כדי להשיג תפוקה טובה יותר ולהימנע מסכנות מעבדה מתוכננות.

ההתקדמות האחרונה בניטור אצטילציה²¹ השתמשה בכימיית קליקים כדי לאפשר ניטור תגובה אנזימטית. ישנם מגוון קודמנים תומכי קליק הנגישים במסלולים סינתטיים פשוטים או זמינים לרכישה שניתן לשלב בתגובות אנזימים. תגובות אלה מתבצעות בדרך כלל במערכות רקומביננטיות, אם כי בדיקות מבוססות תאים אפשריות גם²². היתרון של גורמים משלימים ומצעים התומכים בלחיצה הוא שהסינון יכול למדוד ישירות את פעילות האנזים ללא צורך במערכות קריאה מצומדות שלעתים קרובות מוטרדות על ידי תרכובות סינון ודורשות שלבי טיפול נוספים. זה מאפשר טיפולים מעכבים רק בשלב האנזימטי, בעוד שכל שלבי התפקוד והזיהוי במורד הזרם מתבצעים לאחר שטיפה נרחבת כדי להסיר תרכובות, ובכך מגבילים את הפוטנציאל להתרחשות הפרעות בבדיקה. יתרונות אלה הופכים את העיצוב של בדיקות מותאמות קליק לעדיף על פני בדיקות מצומדות המסתמכות בדרך כלל על זיהוי של קואנזים חופשי A.

שיקול חשוב אחד הוא הקבלה של גורמים משלימים התומכים בקליקים לאתר הפעיל של האנזים. ייתכן שגורמים משלימים קיימים המותאמים לשימוש בקליקים לא יהיו תואמים באופן מלא לאתר הפעיל הממוטב עבור הגורם המשותף המקורי. מידע מבני ומידול יכולים לשמש לתכנון תחליפי חומצות אמינו כדי להגדיל את האתר הפעיל כדי לשלב מצעים שהשתנו²³. זה עשוי לאפשר סינון עם קינטיקה אנזימית משופרת ורמות נמוכות יותר של סובסטרט ואנזימים. החיסרון של גישה זו הוא שכיסים קטליטיים שהשתנו עשויים שלא לזהות מעכבים המקיימים אינטראקציה חזקה עם האנזים המקומי. בסופו של דבר, נדרש שילוב של גישות כדי לזהות ולאמת מעכבי אנזימים פוטנציאליים.

במאמר זה אנו מתארים שיטה שפותחה לטיהור והערכה של פעילות האנזים HAT1 באמצעות קו-פקטור קליק 4-פנטינואיל-CoA²⁴. בדיקה זו (איור 1) משתמשת ברצף האנזים המקורי בקומפלקס עם החלבון השותף הנדרש Rbap46, אשר הוכח כמגביר את פעילות האנזים. טיהור האנזים מתאי האדם מאפשר הפעלת אנזים בצלולו, מה שעשוי לשמר שינויים מעוררים לאחר התרגום החשובים לפעילות אנזימית מלאה. תכנון ואופטימיזציה של בדיקות אנזימים רקומביננטיים עבור מסכים כימיים בעלי תפוקה גבוהה שימשו בהצלחה לזיהוי ואפיון מעכבי מולקולות קטנות HAT1.

Protocol

1. שיטה 1: ייצור וטיהור קומפלקס רקומביננטי HAT1/Rbap46

1. הפשרה, שחזור והרחבה של תאי HEK293f
   1. הפשירו 1-10 מיליון תאי יונקים HEK293f²⁶ לתוך 30 מ"ל בסגנון חופשי 293 מדיה בבקבוק 100 מ"ל. יש לדגור ב-8% CO₂ ב-37°C תוך כדי סיבוב ב-60 סל"ד.
   2. למחרת, ספרו ובדקו את כדאיות התא, ולאחר מכן התאימו את מהירות הסיבוב ל-120 סל"ד. יש להרחיב לתרבית של 300 מ"ל בצלוחית של 1 ליטר, תוך שמירה על צפיפות זריעה של 500,000 תאים/מ"ל ופיצול תאים לפני שהצפיפות עולה על 3 x 10⁶ תאים/מ"ל.
2. טרנספקציה HEK293f
   1. זרע 5 x 10⁵ תאים / מ"ל בתרבית 300 מ"ל בבקבוק 1 ליטר ותרבית במשך 24 שעות. למחרת, ספרו תאים כדי לוודא שהם בין 7.5 x 10⁵ עד 1.2 x 10⁶ תאים / מ"ל.
   2. הכינו תערובת של 300 מיקרוגרם של pHEK-FLAG-HAT1 ו-300 מיקרוגרם של DNA פלסמיד pHEK-Rbap46 ב-30 מ"ל של PBS. הוסף 1.2 מ"ל של פוליאתילנימין (PEI) ל- DNA/PBS וערבב. יש לדגור במשך 20 דקות ב-RT. הוסף את תערובת DNA/PBS/PEI לתרבית של 300 מ"ל ודגור ב-37°C למשך 48 שעות ב-120 סל"ד.
3. קצירת תאים
   1. ספור תאים כדי לוודא שהם נופלים בין 1.7 x 10⁶ עד 2.5 x 10⁶ תאים/מ"ל. בצפיפות תאים זו, הוסף פורסקולין לריכוז סופי של 12.5 מיקרומטר כדי להפעיל HAT1 ולדגור על תאים במשך 30 דקות, 37°C, 120 סל"ד.
   2. גלולה את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות, לשטוף פעם אחת עם 30 מ"ל של PBS, ולהקפיא בזק נוזל N₂. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לטיהור החלבון, או להמשיך ישירות לטיהור.
4. HAT1/Rbap46 קומפלקס טיהור חרוזי דגל
   1. ליז תאים ולהכין תמצית חלבון.
      1. הכינו את מאגר הליזה על ידי הוספת טבליה אחת של קוקטייל מעכב פרוטאז (PIC) ל-50 מ"ל של RSB-500 (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM NaCl, 25 mM MgCl₂).
      2. הפשירו את גלולת התא מתרבית של 300 מ"ל על קרח וליז עם 40 מ"ל של חיץ ליזה קר כקרח עם 0.1% טריטון X-100. יש לסחור על קרח ואז לסחור כלפי מטה במהירות של 10,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4°C. אספו את כל הסופרנאטנט לתוך צינור אחד של 50 מ"ל על קרח, שהוא כעת תמצית החלבון.
   2. הכינו חרוזי דגל.
      1. פצל את חרוזי FLAG לארבעה צינורות חרוטיים של 15 מ"ל על ידי הוספת 400 μL של תרחיף חרוזי אגרוז M2-FLAG לכל צינור המכיל 5 מ"ל של 0.1 M גליצין pH 3.5, 0.01% Triton X-100. נערו כל צינור במרץ במשך 5 שניות ביד.
      2. פולס צנטריפוגה במשך 30 שניות ב 1000 x גרם ב 4 ° C, לשאוף supernatant, לשטוף פעמיים עם 5 מ"ל של RSB-500 + 0.1% Triton X-100 (Tx-100; ללא מעכב פרוטאז), ולדגור על קרח.
   3. בצע FLAG immunoprecipitation.
      1. הוסף 10 מ"ל של תמצית חלבון לכל 15 מ"ל צינור חרוטי המכיל חרוזים שטופים. לדגור על הצינורות ב 4 ° C עם סיבוב הפוך לפחות 90 דקות או לילה.
      2. לשטוף את החרוזים כרוכים 5x ב 10 מ"ל של RSB-500 + 0.1% Tx-100. עבור כל שטיפה, הפוך את הצינור 2x-5x כדי להשהות חרוזים, ולאחר מכן גלולה ב 1000 x גרם במשך 1 דקה ב 4 ° C. לבסוף, יש לשטוף 1x ב-RSB-100 (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 25 mM MgCl₂) + 0.1% Tx-100.
   4. FLAG peptide elution: יש להקפיד על קומפלקס HAT1 ב-1.5 מ"ל של Elution Buffer (EB) המכיל 0.5 מ"ג/מ"ל פפטיד FLAG. יש לדגור בטמפרטורה של 4°C למשך שעה אחת לפחות או למשך הלילה. צנטריפוגו את החרוזים המדוללים ב 1000 x גרם במשך 30 שניות ב 4 ° C ולאסוף את supernatant, אשר מכיל את קומפלקס HAT1 / Rbap46 מטוהר.
   5. יש לרכז חלבון ולהסיר פפטיד FLAG.
      1. הוסף את ההדבקה לצינור מסנן ניתוק דלתון של 20 מ"ל, 10,000. הבא את עוצמת הקול עד 15 מ"ל עם EB. יש לסחור במהירות של 2,500 x גרם במשך 15 דקות ב-4°C, ולחזור על הפעולה פעמיים עם 15 מ"ל נוספים של EB בכל פעם.
      2. שחזר את הפולט הסופי מצינור המסנן ובדוק את ריכוז החלבון עד A260. צפו לריכוז של 1 מ"ג חלבון סה"כ ב-6 מ"ל EB (לכל תרבית התחלתית של 300 מ"ל). בדוק את טוהר החלבון על ידי SDS-PAGE, Coomassie, ו immunoblotting, ולאחסן aliquots ב -80 ° C.

2. שיטה 2: עקומה סטנדרטית של לחץ אצטיל-קליק HAT1

1. הכנת עקומה סטנדרטית
   1. סנתז פפטיד H4 N-terminal בקרה חיובית עם הרצף: SCRG[Pra]GGKGLG[Pra]GGAKRHRKVLRGG[Lys(Biotin)], כאשר [Pra] מציין Propargylglycine.
   2. השהה מחדש את פפטיד Pra ל 0.1 מ"ג / מ"ל ב DMSO. ערבבו את פפטיד Pra עם פפטיד היסטון H4 ביוטינילציה (1-23-GGK-ביוטין) כדי ליצור עקומה סטנדרטית (איור 2; נפחים שנמצאים בטבלה 1). ניתן להכין עקומות סטנדרטיות טריות לפני קשירת הצלחת או, אם הן נעשות מראש, לערבב אותן עם 20 μL של 8 M אוריאה ולאחסן אותן בטמפרטורה של -20°C עד לשלב 3.3.

3. שיטה 3: בדיקת אצטיל-לחץ HAT1

1. הרכבת תגובות אצטילציה עם מעכבי בדיקה
   1. להרכיב תגובות אצטילציה בשכפול בצינורות PCR של 0.2 מ"ל או לוחות PCR של 96 באר מהרכיבים הבאים: פפטיד היסטון H4 ביוטינילציה (1-23-GGK-ביוטין) מושעה מחדש ב-DMSO ל-0.1 מ"ג/מ"ל (34.8 מיקרומטר), אנזים HAT1 מדולל מראש ב-EB, חיץ 20x (1M Tris pH 8.5, 0.1% NP40), 2 mM DTT, 4-pentynoyl-CoA מומס במים ל-1 מ"ג/מ"ל (1 מ"ל). תגובה של 20 μL כוללת 10 μL של אנזים, 1 μL של פפטיד H4, 1 μL של חיץ 20x, 1 μL של DTT מעורבב מראש ו aliquoted בארות של צלחת PCR 96 בארות על קרח.
   2. הוסף 1 μL של DMSO (בקרה שלילית) או תרכובת בדיקה מומסת ב 1-10 μM, או H4K12CoA²⁵ (או מעכב בקרה חיובית מתאים), לכל באר. מערבבים על ידי פיפטינג עדין ודגרים במשך 10 דקות על קרח כדי לאפשר לאנזים: קומפלקסים מעכבים להיווצר.
2. המשך תגובת אצטילציה
   1. ערבבו 2 μL של 4-pentynoyl-CoA עם 4 μL מים, ולאחר מכן הוסיפו לבארות. ערבבו בעדינות על ידי פיפט, צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 30 שניות ב RT כדי לאסוף את התכולה, ולדגור ב 37 ° C במשך 1 שעה בצינורות מכוסים או צלחות עם נייר כסף לסגירה חוזרת.
   2. יש לעבד את התכולה ישירות עבור מוצרי תגובה או להרוות עם 20 μL של 8 M urea ולאחסן ב -20 °C עד לעיבוד.
3. קשירת פפטיד לצלחת Neutravidin
   1. הוסף תוכן תגובה עם או בלי אוריאה לאלבומין בסרום בקר (BSA) צלחות שחורות חסומות מראש מצופות נויטרווידין 96 בארות המכילות 80 מיקרוליטר PBST (PBS + 0.1% Tween-20) לכל באר.
   2. הוסף פפטידים עקומות סטנדרטיים בשכפול לבארות שלהם המכילות 80 μL של PBST. קשרו פפטידים עם טלטול אורביטלי עדין למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (RT).
4. שטיפה: לאחר השלמת הקשירה, שאפו את הנוזל מהבארות ושטפו את הבארות עם 200 μL של PBST 3x 15 פעימות (נפח שבץ 180 μL) באמצעות מכונת כביסה.
5. תגובת כימיית קליק
   1. הכינו את הריאגנטים לתגובת הקליק באופן הבא: 100 mM Tris(3-hydroxypropyltriazolymethyl) ליגנד אמין (THPTA) במים ו-20 mM CuSO₄ במים. THPTA מונע הידרוליזה מזורזת Cu(II) ומרווה רדיקלים ופרוקסידים הנוצרים מ-O₂/Cu/ascorbate.
   2. הוסף את תערובת THPTA/Cu ל- 300 mM נתרן אסקורבט במים ו- 2.5 mM ביוטין אזיד ב- DMSO. תגובה בלחיצה אחת מכילה 140 μL של PBS, 10 μL של THPTA, 10 μL של CuSO₄, 10 μL של נתרן ascorbate, 20 μL של ביוטין-אזיד. יש לערבב תמיד את ריאגנטים הקליק טריים, ולאחר מכן לפזר 190 μL לכל באר, לאטום את הצלחת ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת.
6. שטיפה: שאפו את הנוזל מהבארות ושטפו את הצלחת 3x עם PBST (נפח שבץ 180 μL, 15 פעימות לכל שטיפה).
7. קשירת סטרפטאבידין-חזרת פרוקסידאז: לדלל סטרפטווידין-HRP (0.224 מ"ג/מ"ל) 1:10 בסטרפטאווידין (0.224 מ"ג/מ"ל), ולאחר מכן לדלל עוד יותר 1:1000 ב-PBST. מוסיפים Steptavidin-HRP: תערובת סטרפטאווידין (100 μL לבאר) ודגרים ב-RT למשך שעה אחת עם טלטול אורביטלי עדין.
8. יש לשטוף 3x עם PBST כמו בשלבים הקודמים.
9. חמצון אדום של Amplex
   1. שלב את ריאגנטי הזיהוי האדומים של Amplex באופן הבא: 4.45 מ"ל של חיץ NaHPO₄ (1x = 50 mM ריכוז סופי), 50 μL אמפלקס אדום (20 mM מדולל ב- DMSO), 500 μL של H₂O 2 מדולל₂.
   2. דללו את H₂O₂ מ-30% מהמניות ל-3% במאגר 1x NaHPO₄ , ואז הוסיפו 22.7 μL של 3% H₂O₂ לתוך 977 μL של 1x NaHPO₄ buffer (זהו H₂O₂ המשמש לתגובת האמפלקס). הוסף 100 μL של תערובת התגובה האדומה של אמפלקס לכל באר, דגור ב- RT למשך 30 דקות מוגן מפני אור, ולאחר מכן זהה עירור/פליטה פלואורסצנטית 571/585 ננומטר באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטי סטנדרטי.
10. חישוב עיכוב אנזימים: חישוב אחוזי עיכוב (איור 3) לפי הנוסחה הבאה: , כאשר D הוא הערך הפלואורסצנטי של תגובות בקרה המטופלות ב-DMSO בלבד, X הוא ערך התגובות המטופלות בתרכובות בדיקה, ו-BG הוא הערך של בארות רקע (בקרת פפטיד H4, ללא תוספת אנזים).
11. עקומת מינון: בחר תרכובות בדיקה שנמצאו כמעכבות את פעילות האנזים HAT1 לבדיקות חוזרות, כאשר התרכובת מדוללת סדרתית. לקבוע את דילולי המתחם באופן אמפירי. לדוגמה, התחל עם ריכוז מלאי של 2 mM, ולאחר מכן דלל סדרתית 1:3 עבור שמונה דילולים. לאחר מכן יש לדלל ביחס של 1:20 למבחני אנזימים המניבים מינון עליון של 100 מיקרומטר.
    1. התוויית העקומה: השתמש ברגרסיה של הריבועים הפחותים כדי להתאים לעקומות עיכוב מנה-תגובה (תוך שימוש בערכי עיכוב אחוזים משלב 3.10) בתוכנת ניתוח נתונים (GraphPad Prism) ולגזור ערכי IC₅₀ עבור כל תרכובת (איור 4).
12. תגובת אצטילציה עם אצטיל-CoA:
    1. השתמש באפשרות זו כדי לאשר את פעילות האנזים עם הקו-פקטור המקומי אצטיל-CoA במקום 4-פנטינואיל-CoA. בצע בדיקות אצטילציה HAT1 כמתואר בשלבים 3.1-3.2 עם אצטיל-CoA במקום 4-pentynoyl-CoA.
    2. זהו את תוצרי התגובה על קרומי ניטרוצלולוז (1-2 μL), אפשרו להם להתייבש, ואז נקודו עם נוגדנים נגד H4-ליזין-12-אצטיל או אנטי-H4-ליזין-5-אצטיל. כמת את אות האימונובלוט על ידי צפיפות.

תוצאות

עקומות סטנדרטיות בכפילות (16 בארות) צריכות להיכלל בכל צלחת כדי להבטיח ביצועי בדיקה נאותים. נתוני עקומה סטנדרטיים צריכים להיות מוגדרים בצורת טבלה, עם טווח של 100% עד 0% בהתאם ליחס בין פפטיד המכיל Pra לפפטיד H4 מקורי בתמיסה (טבלה 1). האות האדום של Amplex יהיה הגבוה ביותר בבארות פפטיד H4 100% / 0% טבע...

Discussion

בעשור האחרון, כימיית הקליק הפכה לבולטת²⁰, ואפשרה תכנון מדויק של מבנים כימיים אינטראקציה. בהקשר זה, קשרים קוולנטיים ביו-אורתוגונליים שונים²¹ התגלו כאפשרויות מבטיחות ליצירת קומפלקסים בסביבתם הטבעית. כימיית קליקים משתמשת בזוגות של קבוצות פונקציונליות המציגות תגובו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4P CoA	Cayman Chemical	10547	Click chemistry co-factor
Amplex Red	Fisher Sci	A12222	Fluorescence substrate
Biotin-PEG-Azide	Alfa Aesar	J64996MC	Click chemistry
Copper Sulfate	Sigma-aldrich	7758-98-7	Click chemistry
DMSO	Fisher Scientific	67-68-5	diluent
DTT	Acros Organics	03-12-3483	reducting agent
Forskolin	VWR	102987-310	Protein expression
Freestyle 293 Expression Medium	Thermo Fisher	12338018	Media
Freestyle 293-F cells	Thermo Fisher	R790-07	Protein expression
H4-peptide/1-23-GGK-biotin	Anaspec	AS65097	peptide substrate
HEPES	Sigma-aldrich	7365-45-9	EB buffer
Hydrogen peroxide 30% solution	Sigma-aldrich	Z00183-99-0	initiator
M2 FLAG antibody slurry	Millipore-Sigma	A2220	Protein purification
Macrosep 10K Filter (Pall Lab)	VWR	89131-980	Protein purification
Neutravidin Plate	Thermo Sci	15127	BSA-pre-blocked
NP40 (IGEPAL)	MP Biomedical	198596	20x buffer
pHEK-293 plasmid	Takara Bio	3390	Protein expression
Phosphate Buffered Saline 10x	Alfa Aesar	Z00082-33-6	wash buffer
Pra peptide	Genscript	Custom synthesis	biotinylated
Sodium Ascorbate	Sigma-aldrich	134-03-2	Click chemistry
Sodium chloride	Sigma-aldrich	7647-14-5	EB buffer
Sodium phosphate	VWR International	7558-80-7	buffer
Streptavidin	EMD Millipore	189730	competitor
Streptavidin-HRP	Cell Signaling	3999S	enzyme
THPTA ligand	Fisher Sci	1010-500	Click chemistry
Tris base	Sigma-aldrich	77-86-1	20x buffer
Triton-X 100	VWR International	9002-93-1	EB buffer
Tween-20	Sigma-aldrich	9005-64-5	Wash buffer
Urea	Sigma-Aldrich	57-13-6	quencher