השגת קריוקציות באיכות גבוהה של עין ארנב שלמה

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה להשגת קריוסקציות באיכות גבוהה של עיני ארנב שלמות. הוא מפרט את הליכי הדיסקציה, הקיבוע, ההטבעה והחתך של עין הארנב, אשר עשויים להיות מותאמים בקלות לשימוש בכל מחקר המשתמש באימונוהיסטוכימיה בעיניים גדולות יותר.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג קריוסקציות רשתית באיכות גבוהה בבעלי חיים גדולים יותר, כגון ארנבות. לאחר האינוקלציה, העין שקועה לזמן קצר בקיבוע. לאחר מכן, הקרנית והקשתית מוסרים והעין נשארת לילה לקיבוע נוסף ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר הקיבוע, העדשה מוסרת. לאחר מכן מכניסים את העין לקריומולד וממלאים אותה במדיום הטבעה. על ידי הסרת העדשה, למדיום ההטבעה יש גישה טובה יותר לזגוגית ומוביל ליציבות רשתית טובה יותר. חשוב לציין, יש לדגור את העין בהטבעה בינונית למשך הלילה כדי לאפשר חדירה מלאה לכל הזגוגית. לאחר הדגירה בלילה, העין קפואה על קרח יבש ונחתכת. ניתן להשיג קטעי רשתית שלמים לשימוש באימונוהיסטוכימיה. ניתן להשתמש בפרוטוקולי צביעה סטנדרטיים כדי לחקור את הלוקליזציה של אנטיגנים ברקמת הרשתית. היצמדות לפרוטוקול זה מביאה לקריוסקציות רשתית באיכות גבוהה שניתן להשתמש בהן בכל ניסוי באמצעות אימונוהיסטוכימיה.

Introduction

הרשתית מורכבת מכמה שכבות של תאים מתמחים בתוך העין שיחד פועלים להמרת אור לאותות עצביים. מכיוון שהרשתית ממלאת תפקיד קריטי בראייה, הבנת המבנה והתפקוד שלה יכולה לספק תובנות חשובות לגבי כמה מהגורמים הנפוצים ביותר לאובדן ראייה כגון ניוון מקולרי ורטינופתיה סוכרתית, בין היתר.

ארנבים משמשים כמודל נוח לבעלי חיים במחקר רשתית מכיוון שהם מציעים מספר יתרונות בהשוואה למודלים אחרים. עיני ארנב דומות יחסית באנטומיה לעיניים אנושיות ^1,2. לדוגמה, לארנבים יש אזור של צפיפות פוטורצפטור מוגברת, המכונה פס חזותי אופקי, המקביל לגומה המרכזית בבני אדם. למודלים נפוצים אחרים של בעלי חיים, כגון מכרסמים, אין מקבילה אנטומית. בנוסף, בהשוואה למכרסמים, כלי הדם ברשתית בארנבים דומים למדי לאלה שבבני אדם. עיני ארנב גדולות יחסית גם כן. זה הופך אותם למתאימים במיוחד למחקרים הכוללים מתן תרופות או התערבות כירורגית בתוך הזגוגית או הרשתית שאחרת עשויים להיות קשים או בלתי אפשריים בעין קטנה^{יותר 3}.

אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא טכניקה נפוצה לחקר לוקליזציה של אנטיגנים בתוך רקמה ויש לה יישומים נרחבים במחקר רשתית ^4,5,6. מכיוון שהרשתית היא מבנה עדין, השגת תוצאות שימושיות באמצעות IHC דורשת עיבוד רקמות זהיר. היפרדות רשתית וממצאים רקמתיים אחרים כגון שברים ברשתית או קפלים מתרחשים בדרך כלל במהלך העיבוד ועלולים להפריע לפרשנות התוצאות. עיבוד מוצלח תלוי במגוון גורמים, כולל מניפולציה של רקמות, סוג ומשך הקיבוע, סוג מדיה הטבעה וטכניקות חתך 7,8,9,10. למרות היתרונות של שימוש בארנבים כמודל לבעלי חיים במחקר רשתית, קיימים מעט מאוד פרוטוקולים המתארים עיבוד רקמות מוצלח של רשתית הארנבת. מאמר זה מתאר שיטה אמינה להשגת חתכי רשתית באיכות גבוהה מעיני ארנב שלמות לשימוש ב- IHC.

Protocol

כל ההליכים בוצעו בהתאם ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת דרום קליפורניה. 14 (n = 14) ארנבים בעלי חגורה הולנדית בגילאי 4 עד 6 חודשים שימשו בפיתוח פרוטוקול זה. נעשה שימוש בבעלי חיים זכרים ונקבות כאחד. כל בעלי החיים שקלו בין 2.0 ל -2.5 ק"ג. כל בעלי החיים שוכנו ביחידות. רשימה של חומרים וציוד מומלצים ניתן למצוא בטבלת החומרים.

1. הכנה

1. הכנה מקבעת.
   1. הכינו 4% פרפורמאלדהיד (PFA) במי מלח חוצצי פוספט (PBS). לכל הפחות, 50 מ"ל של קיבוע נדרש לכל עין.
2. הכנת סוכן Cryoprotective.
   1. הכינו 30% משקל לפי נפח (w/v) סוכרוז ב-PBS. הניחו על שייקר למשך 15 דקות לפחות כדי לוודא שהסוכרוז מומס לחלוטין. לכל הפחות, 50 מ"ל של סוכן cryoprotective נדרש לכל עין.
3. הכנת מכשיר דיסקציה.
   1. אספו שני זוגות מלקחיים, זוג מספריים מעוקלים, להב אזמל אחד וכלי דיסקציה בקוטר 100 מ"מ והניחו אותם ליד מיקרוסקופ דיסקציה. הגדרה לדוגמה מוצגת באיור 1A.

2. קיבוע ראשוני

1. לאחר שאיבה טרנס-לחמית¹¹, הניחו מיד את העין בלפחות 50 מ"ל של 4% PFA ב-PBS על קרח. ודא כי העין שקועה לחלוטין. אם בועות אוויר מצטברות על פני השטח החיצוניים של העין, הסירו אותן על ידי טלטול עדין.

3. הסרת קרנית וקשתית

1. לאחר 15 דקות, הסירו את העין מ-4% PFA ב-PBS והניחו אותה בכלי דיסקציה של 100 מ"מ תחת מיקרוסקופ נתיחה. מלאו את המנה ב-PBS כדי למנוע מהעין להתייבש.
2. הסר את הקרנית.
   1. התחילו ביצירת חתך עם להב כירורגי 1 מ"מ קדמי ללימבוס, במקביל למישור הקשתית כדי למנוע ניקוב בטעות של מבנים מתחתיו (איור 1B).
   2. יש להכניס מספריים מעוקלים לחתך הראשוני ולהמשיך לחתוך היקפית תוך שמירה על מרחק של 1 מ"מ מהלימבוס. השתמשו במלקחיים כדי לייצב את העין בזמן החיתוך (איור 1C).
   3. לאחר השלמת החתך ההיקפי, יש להסיר את הקרנית בעזרת מלקחיים ולנגב בעדינות עודפי PBS עם מגבון מעבדה. הניחו את הקרנית בתמיסת 30% סוכרוז בטמפרטורת החדר (RT) להגנה קריואקטיבית או להשלכה. Cryoprotection הוא שלם כאשר הקרנית שוקעת, אשר בדרך כלל לוקח פחות מ 1 שעה.
3. הסר את הקשתית.
   1. התחל על ידי ביצוע חיתוך ראשוני עם מספריים מעוקלים דרך הקשתית. הפרידו לחלוטין את הקשתית משאר הרקמה על-ידי חיתוך דומה להסרת הקרנית (איור 1D).
   2. לאחר השלמת החתך ההיקפי, הסירו את הקשתית במלקחיים ונגבו בעדינות עודפי PBS עם מגבון מעבדה. הניחו את הקשתית בתמיסת 30% סוכרוז ב-RT להגנה קריואקטיבית או השליכו כאמור לעיל. הגנה מפני קרינה מלאה כאשר הקשתית שוקעת, פעולה שנמשכת בדרך כלל פחות מ-30 דקות.

4. השלמת הקיבוע

1. לאחר הסרת הקרנית והקשתית, הניחו את העין בלפחות 50 מ"ל של 4% PFA טרי שהוכן ב-PBS והניחו אותו על שייקר לתסיסה עדינה. ודא שהעין נשארת שקועה במהלך אי שקט.
2. שמור את העין ב 4% PFA ב PBS ב 4 °C (75 °F) למשך הלילה.
   הערה: מצאנו כי 4% PFA גורם לצביעת IHC מעולה אם משתמשים בו בין 16 שעות ל -24 שעות ב -4 מעלות צלזיוס, עם משכי קיבוע ארוכים יותר וכתוצאה מכך צביעת רקע לא ספציפית מוגברת ומיסוך אפיטופ.

5. הסרת עדשה

1. למחרת בבוקר, להסיר את העין מ 4% PFA ב PBS ולהניח אותו בכלי דיסקציה 100 מ"מ תחת מיקרוסקופ ניתוח. מלאו את המנה ב-PBS כדי למנוע מהעין להתייבש.
2. הסירו את העדשה.
   1. התחל על ידי אחיזה זהירה של קפסולת העדשה הקדמית עם מלקחיים.
      הערה: היזהר מאוד לא לדחוף או למשוך בכוח את העדשה עם המלקחיים מכיוון שזה יכול ליצור היפרדות רשתית.
   2. הכניסו בזהירות את המספריים לחדר האחורי כשהלהבים מעוקלים אחורית לאורך העדשה. בצע חיתוך ראשוני דרך זונולי העדשה עם מספריים מעוקלים.
      הערה: היזהרו מאוד לא לדחוף או למשוך בכוח את הזונולים עם המספריים, שכן זה יכול ליצור היפרדות רשתית (איור 1E).
   3. המשיכו לבצע חתכים קטנים דרך זונולי העדשה בתבנית היקפית. בצע שלושה עד חמישה חיתוכים בכל שעת שעון.
   4. כדי לבדוק אם העדשה מופרדת משאר הרקמה, אחזו בעדינות בכמוסת העדשה הקדמית בעזרת מלקחיים ונסו להרים אותה בעדינות. אם העדשה אינה מתרוממת מיד, אל תנסה למשוך יותר מכיוון שהדבר עלול ליצור היפרדות רשתית. במקום זאת, בצע חתכים נוספים דרך זונולי העדשה הנותרים ונסה שוב.
   5. לאחר הפרדה משאר הרקמה, הניחו את העדשה בתמיסת 30% סוכרוז ב-RT להגנה קריו-פרוטקטורית או השליכו אותה כאמור לעיל. הגנה מפני קריוהגנה מלאה כאשר העדשה שוקעת, פעולה שנמשכת בדרך כלל מספר שעות.
3. מקם את העין לפחות 50 מ"ל של 30% סוכרוז ב PBS ב 4 ° C עבור cryoprotection. Cryoprotection הוא שלם כאשר העין שוקעת, אשר בדרך כלל לוקח 24-48 שעות. כדי לזרז הגנה קריו-הגנה, החליפו את תמיסת הסוכרוז הראשונית בתמיסת סוכרוז טרייה לאחר 8-12 שעות ו/או שמרו על העין בתמיסת סוכרוז ב-RT.

6. הטבעה

1. לאחר השלמת ההגנה מפני קריותרפיה, הסר את העין מתמיסת 30% סוכרוז והנח אותה בכלי דיסקציה של 100 מ"מ תחת מיקרוסקופ ניתוח. בזהירות להפוך את העין כך שהיא פונה כלפי מטה כדי להסיר תמיסת סוכרוז עודפת מהחלק הפנימי של העין.
   הערה: אין לנסות להסיר תמיסה עודפת מהחלק הפנימי של העין באמצעות מגבון מעבדה מכיוון שהמגבון עלול להידבק לגוף הזגוגית ולגרום להיפרדות רשתית.
2. כשהעין פונה כלפי מטה, נגבו בעדינות את עודפי תמיסת הסוכרוז מהחלק החיצוני של העין באמצעות מגבון.
3. ממלאים תבנית הטבעה חד פעמית בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) לעומק של 0.5-1.0 ס"מ.
   הערה: בסיס זה מבטיח שהעין לא תיגע בתחתית התבנית, מה שמפריע להקפאה מאוחר יותר.
4. מניחים את העין בתבנית ההטבעה החד פעמית הפונה כלפי מעלה. לאט למלא את החלק הפנימי של העין עם OCT תוך הקפדה מיוחדת על מנת למנוע היווצרות בועות בתוך העין. אם נוצרות בועות, הסירו אותן בזהירות או דחפו אותן לקצה התבנית בעזרת מלקחיים.
5. סיימו למלא את תבנית ההטבעה החד פעמית ב-OCT. ודאו שהעין שקועה לחלוטין ב-OCT ואינה נוגעת במשטחים הפנימיים של התבנית או חשופה לאוויר. לעטוף את תבנית הטבעה חד פעמית המכילה את העין ב OCT ב parafilm; יש להניח על 4 °C (75 °F) למשך הלילה.
   הערה: מניסיוננו, תקופות דגירה קצרות יותר אינן מאפשרות ל-OCT לחדור לחלוטין לזגוגית. כתוצאה מכך, שכבה של סוכרוז נשארת לעתים קרובות בין הרשתית לבין OCT. כאשר זה קורה, הרשתית לעתים קרובות מתנתקת או נקרעת לחלוטין משאר הרקמה במהלך הקפאה מכיוון שסוכרוז קפוא ככל הנראה מספק פחות תמיכה מבנית מאשר OCT קפוא, מה שהופך חלקים באיכות גבוהה לקשים או אפילו בלתי אפשריים להשגה.
6. למחרת בבוקר, מניחים את תבנית ההטבעה המכילה את העין ב-OCT בכלי דיסקציה של 100 מ"מ תחת מיקרוסקופ ניתוח. ודא שהקרום ההיאלואידי האחורי נראה מורם כלפי מעלה מהרשתית הפנימית.
   הערה: הרמה זו כלפי מעלה עלולה לטשטש את שדה הראייה של הרשתית, מה שמקשה על קביעת ההתמצאות.
7. כדי לקבוע טוב יותר את כיוון העין, אחוז בזהירות את הקרום ההיאלואידי האחורי קדמית ונסה לקלף אותו עם מלקחיים כדי לחשוף את הרשתית הבסיסית בזמן OCT.
   הערה: לפעמים התעלה ההיאלואידית נראית לעין, אשר מתחברת לראש עצב הראייה ויכולה לשמש למטרות התמצאות מאחר שראש עצב הראייה ממוקם בחלק העליון של הרשתית (איור 2A). אין צורך להסיר לחלוטין את הקרום ההיאלואידי האחורי מאחר ש-OCT כבר חדר לגוף הזגוגית כדי לרפד את הרשתית הפנימית, וכל קרום שנותר לא ישפיע על הקפאה (איור 2B). יש להסיר את הקרום ההיאלואידי האחורי רק לצורך התמצאות, במידת הצורך. אפשרויות אחרות לקביעת כיוון כוללות הנחת תפר או סוג אחר של סימן לפני השאיבה.
8. העבירו את העין לתבנית הטבעה חדשה עם OCT חדש במילוי לעומק של 0.5-1.0 ס"מ ולאחר מכן מלאו ב-OCT חדש כמו בשלבים 6.3-6.5 כדי להבטיח שאמצעי ההטבעה הסופי נקי מלכלוך ו/או פגמים אחרים שאולי הצטברו במהלך הלילה. אם אפשר, להסיר בעדינות OCT עם מגבון מתוך העין גם כן, אם כי זה לא הכרחי.
9. תייגו את התבנית למטרות התמצאות (איור 2C). כיוון העין כשהעין פונה כלפי מעלה בתבנית הקריו מבטיח כי OCT ירפד את הרשתית הפנימית. התעלה ההיאלואידית, המתחברת לראש עצב הראייה, היא נקודת ציון חשובה לקביעת החלק העליון של העין (איור 2A).
10. מניחים את תבנית ההטבעה המסומנת המכילה את העין ב-OCT על גבי קרח יבש. יש לוודא שהעין אינה נוגעת באף אחד מהמשטחים הפנימיים של העובש המוטבע או חשופה לאוויר. ודאו שהעובש נוגע ישירות בקרח היבש כדי להאיץ את תהליך ההקפאה (איור 2D).
11. העבירו את העין המשובצת למקפיא בטמפרטורה של -80°C או ישירות להקפאה לצורך חתך (איור 2E).

7. Cryosectioning

1. הרכיבו את הגוש כאשר החלק העליון של העין פונה למעלה והחלק התחתון של העין פונה בצורה נחותה, כאשר הקרנית והקשתית הנותרות פונות ימינה (כמו באיור 2E) או שמאלה (לא מוצגות). לחלופין, טען את הבלוק בכיוון שונה, לפי הצורך. במידת הצורך, שברו את התבנית כדי לגייס את הבלוק על ידי שבירה זהירה של כל צד של התבנית אחד בכל פעם וסימון הבלוק ישירות כדי לא לאבד את כיוון העין.
2. לאפשר את הבלוק כדי לאזן את הטמפרטורה בתוך cryostat במשך 30-60 דקות; -20 °C היא נקודת התחלה טובה.
3. לאחר ההרכבה, הניחו להב חדש בזווית הרצויה, בדרך כלל במקביל לציר האנכי של העין.
4. הגדר את עובי המקטע כרצונך: חתכים בעובי 10-20 מיקרומטר הם נקודת התחלה טובה. דוגמה לחתך בעובי 14 מיקרומטר מודגמת באיור 3A-C.
   1. באופן איטי ומבוקר, התחילו לחתך דרך הבלוק. ודא שהלהב חותך את הבלוק במקביל לציר האנכי של העין. אם לא, התאימו בהתאם את זווית מגע הלהב עם הבלוק או כיוון הבמה.
   2. בעת חיתוך הבלוק יש למנוע קמטים או סלסולים של הקטע בעזרת מברשת. הפכו במהירות את החלק והפעילו לחץ עדין כלפי מטה בעזרת מברשת בעלת שיער ארוך כדי לשטח את המקטע ולמזער קמטים או סלסולים. עצבו מברשת נפרדת עם קצה מחודד כדי לסייע במניפולציה של המקטע.
5. חבר את המקטע לשקופית זכוכית טעונה על-ידי הזזת השקופית באיטיות הפונה כלפי מטה לכיוון המקטע. מנעו מהמקטע להתקפל על עצמו או לעוות את עצמו בדרך אחרת במהלך החיבור על ידי גלגול עדין של מגלשת הזכוכית מעל המקטע.
   הערה: אל תרחף עם השקופית ישירות מעל המקטע ואל תלחץ עליה כנגד המקטע, מכיוון שהדבר עלול לגרום נזק או לעוות את המקטע.
6. הניחו לשקופיות להתייבש למשך הלילה לפני העברתן למקפיא בטמפרטורה של -80°C או המשיכו ישירות לפרוטוקול אימונופלואורסנציה סטנדרטי.

תוצאות

לאחר עיבוד רקמות, ניתן להשתמש בפרוטוקול אימונופלואורסנציה סטנדרטי כדי לחקור כל מספר של תהליכים ביולוגיים בתוך הרשתית. איור 3A-C ממחיש תמונות פלואורסצנטיות מייצגות של חתך רשתית המתקבל באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. קטע הרשתית היה מוכתם חיסון על פי פרוטוקול

Discussion

לפני יישום הפרוטוקול הנ"ל, נתקלנו באופן עקבי בקשיים בעיבוד רקמות של עיני ארנב עבור IHC. התאמנו כמה פרוטוקולים מעיניהם של בעלי חיים קטנים יותר, כגון עכברים, אך מצאנו שהם מובילים לקיבוע לקוי ולקושי בחיתוך רקמות. ישנם מספר שיקולים חשובים המאפשרים חלקים עקביים ואיכותיים של רשתית הארנבת.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm culture dish	Corning	353025	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
50 mL tube	Genesee Scientific	28-106	For fixation and cryoprotection (step 1)
Cryostat	Leica	CM1850	For cryosectioning (step 7)
Curved scissors	Fine Science Tools	91500-09	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
DAPI	Fisher Scientific	D3571	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000-C	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Donkey anti-Goat 488	Fisher Scientific	A-11055	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Donkey anti-Mouse 555	Fisher Scientific	A-31570	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Glass Slide Cover	VWR	48404-453	For cryosectioning (step 7)
Goat anti-SOX2	R&D Systems	AF2018	Diluted 1:100 in blocking buffer
High-profile disposable cryostat blades	Leica Microsystems Inc.	14035838926	For cryosectioning (step 7)
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666-A	Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6)
Mouse anti-RPE65	Novus Bio	NB100-355SS	Diluted 1:100 in blocking buffer
OmniPur Sucrose	Millipore	167117	Used for cryoprotectant (step 1.2)
Paraformaldehyde 20% solution	Electron Microscopy Sciences	15713	Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1)
Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep)	Polysciences, Inc.	18646A	Used as embedding mold (step 6)
Phosphate buffered saline, 1x	Corning	21-030-CV	Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2)
Scalpel blade no. 15	Feather	08-916-5D	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	For cryosectioning (step 7)
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Used as embedding media (step 6)