שיטה פשוטה, מהירה ויעילה לניתוח השתלת גידול בעוברים שקופים של דגי זברה

Summary

אנו מתארים פרוטוקול להשתלת קסנו בחלמון של עוברי דגי זברה שקופים המותאם בשיטת היערכות פשוטה ומהירה. ניתוחים לאחר הזרקה כוללים הישרדות והערכת נטל המחלה של תאים מושתלים על ידי ציטומטריית זרימה.

Abstract

מחקרי In vivo של התנהגות גידולים הם מצרך עיקרי בחקר הסרטן; עם זאת, השימוש בעכברים מציב אתגרים משמעותיים בעלות ובזמן. כאן, אנו מציגים את דגי הזברה הזחלים כמודל השתלה שיש לו יתרונות רבים על פני מודלים מורינים, כולל קלות טיפול, הוצאות נמוכות ומשך ניסוי קצר. יתר על כן, היעדר מערכת חיסון נרכשת בשלבי הזחל מייתר את הצורך לייצר זנים מדוכאי חיסון ולהשתמש בהם. בעוד פרוטוקולים מבוססים להשתלת קסנו בעוברים של דגי זברה קיימים, אנו מציגים כאן שיטה משופרת הכוללת היערכות עוברים להעברה מהירה יותר, ניתוח הישרדות ושימוש בציטומטריית זרימה להערכת נטל המחלה. עוברים מבוימים כדי להקל על הזרקת תאים מהירה לחלמון הזחלים וסימון תאים כדי לפקח על עקביות בולוס התא המוזרק. לאחר ההזרקה, ניתוח הישרדות העובר מוערך עד 7 ימים לאחר ההזרקה (dpi). לבסוף, נטל המחלה מוערך גם על ידי סימון תאים מועברים עם חלבון פלואורסצנטי וניתוח על ידי ציטומטריית זרימה. ציטומטריית זרימה מתאפשרת על ידי שיטה סטנדרטית להכנת תרחיפים של תאים מעוברי דגי זברה, אשר יכולה לשמש גם בביסוס התרבית הראשונית של תאי דגי זברה. לסיכום, ההליך המתואר כאן מאפשר הערכה מהירה יותר של התנהגות תאי הגידול in vivo עם מספר גדול יותר של בעלי חיים לכל זרוע מחקר ובאופן חסכוני יותר.

Introduction

ניתוח התנהגות גידולים בתגובה לשינוי גנטי או טיפול תרופתי in vivo הוא מרכיב חיוני בחקר הסרטן 1,2,3,4. מחקרים כאלה כוללים לרוב שימוש במודלים של עכבר מדוכא חיסון (Mus musculus)⁵; עם זאת, מחקרי השתלת קסנו בעכברים מוגבלים במובנים רבים, כולל קיבולת מוגבלת, משך זמן ממושך, הוצאות משמעותיות והדרישה לציוד הדמיה מתוחכם למעקב אחר התקדמות גידולים פנימיים ^6,7. לעומת זאת, מודל דגי הזברה (Danio rerio) מאפשר קיבולת גדולה יותר, משך זמן קצר יותר, הוצאו....

Protocol

תחזוקה, האכלה וגידול של דגי זברה התרחשו בתנאי חקלאות ימית סטנדרטיים של 28.5 מעלות צלזיוס, כמתואר³¹. כל הניסויים הקשורים לדגי זברה נעשו בטמפרטורה זו; עם זאת, לאחר השתלת קסנו, בעלי החיים גודלו בתרבית בטמפרטורה של 34 מעלות צלזיוס למשך הניסוי, בהתאם לנהלים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC).

1. רבייה (3 ימים לפני ההזרקה)

1. לספק מזון יבש (מזון נוסף; 5-6 גרגירים לכל דג) לזוגות דגים שבוע לפני הרבייה כדי למקסם את בריאות בעלי החיים ולהגדיל את מספר העוברים המיוצרים על ידי זוגות רבייה.
2. בערב שלפני קציר העוברים, הקימו חיות רבייה במכלי רבייה עם מחיצה המפרידה בין דגים זכ....

תוצאות

השתלת קסנו
מבט מקיף על כל הניסוי והניתוח מתואר באיור 1, החל מייצור עוברים ועד להערכת התקדמות המחלה הן על ידי הישרדות והן על ידי ניתוח נטל המחלה באמצעות ציטומטריית זרימה. גישה זו מביאה מספר שיפורים המשפרים את יכולת השחזור והמדרגיות של השתלת קסנו, כמו גם הוספת דרך ח.......

Discussion

השתלת שדגי זברה התגלתה כחלופה מהירה, חזקה וחסכונית למחקרי עכברים¹². למרות שדווחו מספר גישות להשתלת קסנו של דגי זברה, ההסתגלות שלנו הביאה לשיפור משמעותי. בנוסף לסטנדרטיזציה של הפרמטרים סביב ההליך, שיפורים אלה מתמקדים באופן ספציפי בהאצת הקצב שבו ניתן לבצע זריקות גידול, ובכך מאפ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-phenyl 2-thiourea (PTU)	Sigma	P7629
70 micron cell strainer	Corning	CLS431751-50EA
90 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	S43565
Agarose	Apex bioresearch	20-102GP
APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody	Biolegend	109814
BD FACSymphony A5 Cell Analyzer	BD Biosciences	BD FACSymphony A5
calibration capillaries	Sigma	P1424-1PAK
Cell tracker CM-dil dye	Invitrogen	C7001
Collageanse IV	Gibco	17104019
Dumont forceps number 55	Fine science tools	11255-20
FBS	Corning	35-015-CV
Fluorescence microscope	Nikon	model SMZ1500
Glass capillaries (Borosilicate)	World precision instruments	1B100-4
HBSS	Corning	21-023-CV
Helix NP Blue	Biolegend	425305
Instant Ocean Sea Salt	Instant ocean	SS15-10
Light microscope	Nikon	model SMZ1000
Methylene blue	Sigma	M9140-100G
Microloader (long tips for laoding cells)	eppendorf	930001007
P1000 micropipette puller	Sutter instruments	model P-97
PM 1000 cell microinjector	MicroData Instruments, Inc. (MDI)	PM1000
Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate)	Sigma	E10521-10G
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Gibco	15400054
Zebrafish adult irradiated diet (dry feed)	Zeigler	388763