מדידת התיישבות חיידקים על שורשי Arabidopsis thaliana במצב הידרופוני

Summary

התיישבות של ריזובקטריה מעודדת גדילה של צמחים (PGPR) בריזוספרה חיונית להשפעתו מעודדת הצמיחה. יש צורך לתקנן את שיטת הזיהוי של התיישבות ריזוספרה חיידקית. במאמר זה אנו מתארים שיטה הניתנת לשחזור לכימות התיישבות חיידקים על פני השטח של השורש.

Abstract

מדידת התיישבות חיידקים על שורש Arabidopsis thaliana היא אחד הניסויים השכיחים ביותר במחקרי אינטראקציה בין צמחים למיקרובים. שיטה סטנדרטית למדידת התיישבות חיידקים בריזוספרה נחוצה כדי לשפר את יכולת הרבייה. תחילה תרבינו A.thaliana סטרילית בתנאים הידרופוניים ולאחר מכן חיסנו את תאי החיידק בריזוספרה בריכוז סופי של OD₆₀₀ של 0.01. יומיים לאחר החיסון, רקמת השורש נקטפה ונשטפה שלוש פעמים במים סטריליים כדי להסיר את תאי החיידקים הלא מיושבים. לאחר מכן נשקלו השורשים, ותאי החיידק שהתיישבו על השורש נאספו על ידי מערבולת. מתלה התא דולל בשיפוע עם חיץ מלח חוצץ פוספט (PBS), ואחריו ציפוי על תווך אגר לוריא-ברטאני (LB). הצלחות הודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 10 שעות, ולאחר מכן, המושבות הבודדות על לוחות LB נספרו ונורמלו כדי לציין את תאי החיידקים שהתיישבו על שורשים. שיטה זו משמשת לזיהוי התיישבות חיידקים בריזוספרה בתנאי מונו-אינטראקציה, עם יכולת שחזור טובה.

Introduction

קיימות שיטות כמותיות ואיכותיות לאיתור התיישבות ריזוספרה על ידי זן חיידק יחיד. בשיטה האיכותית יש להשתמש בזן המבטא פלואורסצנטיות באופן מכונן ולבחון את התפלגות הפלואורסצנטיות ועוצמתה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי או מכשירי לייזר קונפוקליים ^1,2. אסטרטגיות אלה יכולות בהחלט לשקף התיישבות חיידקים באתרו³, אך הן אינן מדויקות כמו שיטות ספירת לוחות מסורתיות בכימות. חוץ מזה, בגלל המגבלה של הצגת אזורי שורש חלקיים בלבד מתחת למיקרוסקופ, לפעמים זה יכול להיות מושפע מהטיה סובייקטיבית.

במאמר זה אנו מתארים שיטה כמותית, הכוללת איסוף תאי החיידק המאוכלסים וספירת ה-CFUs החיידקי....

Protocol

1. הידרופוני סטרילי א. גידול תאליאנה

1. הכינו שתילי A. thaliana .
   1. הכינו תרבית שתילי A. thaliana בינוני, המורכב מ 1/2 MS בינוני (Murashige ו Skoog) עם 2% (wt / vol) סוכרוז ו 0.9% (wt / vol) אגר.
   2. יוצקים את אמצעי העיקור המוכן לכלי פטרי מרובעים סטריליים (13X13 ס"מ) לפני המיצוק. יש להימנע מייבוש באוויר כדי לשמור על לחות.
   3. לטבול זרעי A. thaliana בצינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל מלא 1 מ"ל של מים סטריליים ב 4 ° C במשך יותר מ 12 שעות, ולאחר מכן לעקר את הזרעים עם 1 מ"ל של 2% (vol / vol) NaClO במשך 2 דקות.
   4. שטפו היטב את הזרעים במים סטריליים שש פעמים כדי להסיר את תמיסת Na....

תוצאות

כדי לבדוק את הדיוק של יכולת התיישבות החיידקים שזוהתה בשיטה זו בריזוספרה A. thaliana חיסנו את Bacillus velezensis SQR9 WT ומוטציה נגזרת Δ8mcp לתוך A . thaliana rhizosphere בנפרד. Δ8mcp היא מוטציה שחסרה את כל הגנים המקודדים לכימורצפטור, ויש לה ירידה משמעותית בנשאות⁶. מדדנו את הנשאות שלה.......

Discussion

כדי להשיג יכולת שחזור טובה, ישנם ארבעה שלבים קריטיים לתהליך זיהוי הקולוניזציה של פרוטוקול זה. ראשית, יש לוודא שמספר תאי החיידקים המחוסנים זהה לחלוטין בכל ניסוי. שנית, יש צורך גם בשליטה על עוצמת ניקוי החיידקים הבלתי מיושבים באמצעות מים סטריליים. שלישית, כל תהליך דילול דגימה צריך להיות מערבו.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Corning	3516
Filter cell stainer	Solarbio	F8200-40µm
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO
Murashige and Skoog medium	Hopebio	HB8469-5
NaClO	Alfa	L14709
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
Square petri dish	Ruiai Zhengte	PYM-130
Vortex Genie2	Scientific Industries	G560E