מודל קסנוגרפט אורגנואיד שמקורו בחולי סרטן הכבד כדי לחקור את ההשפעה של התחדשות הכבד על צמיחת הגידול

Summary

אורגנואידים הנוצרים מגידולי חולים מוזרקים אורתוטופית לכבד העכבר. כריתה של רקמת כבד לא גידולית מובילה לסביבה רגנרטיבית ברקמת הכבד בה נמצא הגידול.

Abstract

הישנות מהווה אתגר בולט לאחר טיפול בקרצינומה של הכבד (HCC), ומשפיעה על יותר מ-70% מהחולים שעוברים כריתה כירורגית. הישנות נובעת ממיקרו-גרורות שלא זוהו או מסרטן דה נובו , שעלול להיות מופעל על ידי התחדשות כבד לאחר ניתוח. מחקר קודם השתמש בקווי תאי HCC במודלים אורתוטופיים כדי לחקור את ההשפעה של התחדשות הכבד, אך תוקפם המוגבל עורר את הצורך במודל מייצג יותר. כאן, אנו מציגים גישה חדשה המשתמשת באורגנואידים HCC שמקורם בחולה כדי לחקור את ההשפעה של התחדשות הכבד על HCC.

רקמות הגידול של המטופל מעובדות ליצירת אורגנואידים של גידול, משובצות במטריצת קרום בסיס תלת מימדית, ומתורבתות במדיום ספציפי לכבד. מיליון אורגנואידים מוזרקים לאונה העליונה הימנית (RSL) של עכברים חסרי חיסון, המאשרים צמיחת גידול מקרוסקופי באמצעות סונוגרפיה. קבוצת ההתערבות עוברת כריתה של האונה הצידית השמאלית (LLL) (30% מנפח הכבד הכולל) או בנוסף, האונה האמצעית (ML) (65% מנפח הכבד הכולל) כדי לגרום להתחדשות הכבד בתוך אתר הגידול. קבוצת הביקורת חווה לפרוטומיה מחדש ללא כריתת רקמת כבד. לאחר שבועיים, שתי הקבוצות עוברות גידול והוצאת רקמות רגילות.

לסיכום, מודל אורגנואיד HCC זה שמקורו בחולה מציע פלטפורמה חזקה לחקירת ההשפעה של התחדשות הכבד לאחר כריתת סרטן. ההרכב הרב-תאי שלו, המגוון הגנטי ויכולות התרבית הממושכות שלו הופכים אותו לכלי רב ערך לחקר מנגנוני הישנות HCC והתערבויות פוטנציאליות.

Introduction

הישנות לאחר טיפול בקרצינומה של הכבד (HCC) היא אתגר משמעותי, המשפיע על למעלה מ-70% מהחולים שעוברים כריתה כירורגית ^1,2,3. הישנות זו עלולה לנבוע ממיקרו-גרורות שלא זוהו (גידול רב-מרכזי) או מהתפתחות סרטן דה נובו ⁴. מחקרים קליניים וניסויים מצביעים על כך שתהליך התחדשות הכבד המופעל על ידי כריתה כירורגית יכול להפעיל מיקרו-גרורות סמויות, ולתרום להישנות הגידול.

יש צורך במחקר נוסף כדי להשוות את ביטוי הגנים והחלבונים בתאי כבד נורמליים וממאירים בסביבת כבד מתחדשת. בנוסף להבהרת המנגנונים העומדים בבסיס הישנות, זיהוי מסלולי איתות ממוקדים ספציפיים לתאים סרטניים טומן בחובו פוטנציאל להתקדמות טיפולית משמעותית. גישה זו שואפת ליישב את הרעיונות הסותרים לכאורה של מיקרו-סביבה אנטי-גידולית ותנאים נוחים להתחדשות הכבד.

מודלים קודמים השתמשו בהזרקה אורתוטופית של קווי תאי HCC כדי לחקור את ההשפעה של התחדשות הכבד⁵. מודל חלוצי זה משתמש באורגנואידים HCC שמקורם בחולה, ומציע מספר יתרונות על פני קווי תאים מסורתיים. אורגנואידים שומרים על אוכלוסיות תאים מגוונות, המשקפות את המבנה והתפקוד של תבנית המודל, בניגוד לקווי תאים וספרואידים. המגוון הגנטי שלהם מגביר את הייצוגיות. בנוסף, אורגנואידים מספקים יציבות לתרבית ממושכת, ומאפשרים מחקרי התערבות ממושכים. אנו ממליצים על הזרקת RSL בשל פוטנציאל ההתחדשות המעולה שלה בהשוואה לאונה התחתונה הימנית (RIL). השיטה המתוארת כאן מספקת פלטפורמה המשתמשת באורגנואידים סרטניים עם יתרונות בולטים בהשוואה לקווי תאים סרטניים כדי לחקור את שאלת המחקר הנ"ל.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

דגימות כבד המשמשות ליצירת אורגנואידים התקבלו ממטופלים שנותחו בבית החולים האוניברסיטאי של באזל (USB) לאחר הסכמה מדעת בכתב באישור הוועדה האתית של צפון-מערב ומרכז שוויץ (מספר BASEC 2019-02118). כל הניסויים בעכברים אושרו ובוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות של הוועדה לטיפול בבעלי חיים של קנטון בזל-שטאדט, שוויץ (3123-33896). כל העכברים היו מזן עכבר גמא SCID שאינו סוכרתי (NOD) ולכן הונדס גנטית לדיכוי חיסוני; נעשה שימוש רק בבעלי חיים זכרים. ראה טבלה 1 וטבלת חומרים לפרטים הקשורים לפתרונות, ריאגנטים, חומרים ומכשירים המשמשים בפרוטוקול. ראה איור 1 לסקירה כללית של הניסוי.

1. גידול עכברים

1. לגדל ולתחזק עכברים במתקן בעלי החיים בתנאים ספציפיים נטולי פתוגנים בלוח זמנים של 12 שעות ביום ו-12 שעות בלילה עם גישה חופשית למזון ולמי שתייה.
   הערה: השתלת האורגנואידים מתבצעת בגיל 6-8 שבועות.

2. דגימות מטופלים וקליניות

1. מניחים צלחות של 12, 24 ו-6 בארות בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני שמתחילים. במידת האפשר, עשו זאת יום אחד מראש.
   1. אסוף את הרקמה תוך שעה לאחר הכריתה במדיום RPMI 1640 והעבר אותה למעבדה כדי להתחיל בתהליך הדיסוציאציה באופן מיידי. מניחים את הטישו בצלחת פטרי בגודל 10 ס"מ (צלחת מחוממת מראש) ומוסיפים כמות מספקת של מי מלח סטריליים כדי למנוע התייבשות של הרקמה.
2. דיסוציאציה של רקמת סרטן הכבד ליצירת אורגנואידים
   1. טוחנים את הרקמה לשברים קטנים של 1-2 מ"מ² בעזרת אזמלים. השתמש במלקחיים נוספים של רקמות כדי לייצב את הרקמה למקרה שהחיתוך קשה.
   2. הנח את חלקי הרקמה בשפופרת של 15 מ"ל עם 5 מ"ל של מאגר דיסוציאציה (pH פיזיולוגי). מניחים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (ארון חימום/אינקובטור) במכשיר סיבוב.
   3. מערבבים על ידי פיפטה כל 10 דקות ומשאירים למשך כ-1-1.5 שעות, וחוזרים על תהליך הערבוב כל 10 דקות.
      הערה: ערבוב עשוי לדרוש חיתוך של קצה הפיפטה כדי להגדיל את קוטר הפתח, ובכך למנוע מרקמה גדולה מדי להיתקע בקצה הפיפטה.
   4. אסוף 10 מיקרוליטר של תערובת חיץ דיסוציאציה תאית משלב 2.2.3 בצינור פלסטיק של 0.5 מ"ל, הוסף 10 מיקרוליטר של טריפאן כחול והשתמש במונה התאים האוטומטי כדי להעריך את כדאיות התאים ואשכולות התאים. אם נראים אשכולות, חזור על תהליך הערבוב (שלב 3.3.); אחרת, המשך לשלב הבא.
   5. קחו צינור של 50 מ"ל, הניחו מסננת תאים של 100 מיקרומטר בחלק העליון והעבירו את התערובת דרכה. בעזרת הבוכנה של מזרק 5 מ"ל, מרסקים את כל שברי הרקמות שנותרו דרך המסנן. שטפו הכל עם 5 מ"ל Ad-DF+++ והקפידו לאסוף את הטיפה מתחתית המסנן.
   6. העבירו את המסנן לצינור חרוטי של 15 מ"ל. צנטריפוגה למשך 15 דקות במשקל 300 × גרם.
   7. שאפו את הסופרנטנט בזהירות, הקפד לא לגעת בכדור. הוסף 5 מ"ל של מאגר ליזה של תאי דם אדומים. דגירה למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר.
   8. צנטריפוגה למשך 5 דקות במשקל 300 × גרם. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש ב-1 מ"ל של מדיום מתקדם.
3. ספירת תאים והערכת כדאיות התאים
   1. הוסף 10 מיקרוליטר טריפן כחול לצינור של 1.5 מ"ל וערבב עם 10 מיקרוליטר מתרחף התא. מניחים 10 מיקרוליטר מהתערובת על שקופיות הספירה וסופרים את התאים.
   2. הפרד את מספר התאים הדרוש ליצירת האורגנואידים והצנטריפוגה למשך 5 דקות ב -300 × גרם. בדרך כלל, זרע 80,000 תאים לכיפה ו -20 מיקרוליטר של מטריצת קרום הבסיס לכל כיפה (10 טיפות לבאר לכל צלחת של 6 בארות).
   3. אם נותרו תאים עודפים בתרחיף, השעו את הגלולה במדיום הקפאת תרחיף תאים (10% DMSO ב-FBS), העבירו אותה לתוך צינור קריוטיוב והניחו אותה במיכל הקפאה. מעבירים מיד את הצינור למקפיא של -80 מעלות למשך הלילה. למחרת מעבירים לחנקן נוזלי עד הצורך.
4. ציפוי ליצירת אורגנואידים
   1. הסר את ה-supernatant. הניחו את הצינור על קרח והשעו מחדש את הגלולה בעזרת מטריצת קרום מרתף.
   2. הוציאו את הצלחת המחוממת מראש מהחממה (מחוממת מראש למשך הלילה). צור טיפות קטנות בצלחת (20 מיקרוליטר של מטריצת קרום הבסיס לכל כיפה [10 טיפות לבאר]). הפוך את הצלחת והשאיר את הצלחת למשך 5 דקות בארון הזרימה.
   3. לאחר 5 דקות, העבירו את הצלחת לחממה של 37 מעלות צלזיוס והשאירו את הצלחת למשך ~20 דקות, מה שמאפשר למטריצה להתמצק. הוסף 2 מ"ל מדיום תרבית אורגנואידים ^6,7.
5. שמירה על תרבית אורגנואידים
   1. החלף את המדיום כל יומיים. לאחר שהאורגנואידים מתכנסים בכיפת מטריצת הממברנה הבסיסית ומוכנים להתרחבות, חשב את יחס הפיצול, למשל, פי 2 או פי 3 בהתאם.
      הערה: רשום מידע זה; זה יהיה נחוץ בשלבים הבאים.
   2. הסר את המדיום מפינת הבאר בעזרת קצה P1000, הקפד לא לגעת בכיפות המטריצה.
   3. הוסף 100 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין-EDTA לכיפה, גרד אותו, אסוף אותו לצינור של 15 מ"ל והוסף שוב כמות קטנה של טריפסין לבאר כדי לאסוף הכל. פיפטה זה ~ פי 10.
   4. דגירה למשך 3 דקות באמבט המים של 37 מעלות צלזיוס ופיפטה פי 10 כדי לנתק את התאים עם קצה P1000. חזור על שלב זה כל 3 דקות למשך 10 דקות לכל היותר.
   5. הוסף לפחות את אותו נפח של מדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM)/10% סרום בקר עוברי (FBS)/1% פניצילין-סטרפטומיצין (Pen-Strep) וערבב למעלה ולמטה לאט פי 2. מלא ב- DPBS.
   6. צנטריפוגה בחום של 300 × גרם למשך 5 דקות והסר בזהירות את הסופרנטנט. השעו מחדש בהתאם ליחס הפיצול שנקבע על סמך מפגש האורגנואידים, למשל, פי 2 או פי 3 מהכמות הראשונית של מטריצת קרום הבסיס.
   7. הוציאו את הצלחת המחוממת מראש מהחממה (מחוממת מראש למשך הלילה). צור טיפות קטנות בצלחת (20 מיקרוליטר של מטריצת קרום הבסיס לכל כיפה [10 טיפות לבאר]). הפוך את הצלחת והשאיר את הצלחת למשך 5 דקות בארון הזרימה.
   8. לאחר 5 דקות, העבירו את הצלחת לחממה של 37 מעלות צלזיוס. השאירו את הצלחת למשך ~20 דקות, ואפשרו למטריצה להתמצק. הוסף 2 מ"ל של מדיום תרבית אורגנואידים.
6. הכנת אורגנואידים להכנת בלוק משובץ פרפין קבוע פורמלין (FFPE)
   1. הסר את המדיום מפינת הבאר בעזרת קצה P1000, הקפד לא לגעת בכיפות המטריצה. הוסף 200 מיקרוליטר של Dispase (2 מ"ג/מ"ל) ושבש את הטיפות עם קצה פיפטה P1000. השאירו בחממה למשך 80 דקות.
   2. הוסף לבאר 2 מ"ל של מי מלח חוצץ פוספט (DPBS) של Dulbecco, העביר אותו לצינור חרוטי של 15 מ"ל ומלא אותו ב-DPBS. צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות, שואבים את הסופרנטנט ומשהים מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד. מכניסים למקרר לשעה לפחות.
   3. צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות, שואבים את הפרפורמלדהיד ומשהים מחדש את הגלולה עם הג'ל לעיבוד הדגימה ליצירת טיפה. יש להמתין 40 דקות עד שהטיפות יתמצקו. מניחים את טיפת הג'ל המכילה את התאים בקלטת היסטולוגית. העבר את הקסטה לייבוש ולאחר מכן הטמיע אותה בפרפין לחיתוך וצביעה H/E ^8,9.
7. הכנת אורגנואידים להזרקה
   1. הוציאו את הצלחת המכילה את האורגנואיד הגדל מהחממה והניחו אותה בארון הזרימה.
   2. בצע את שלבים 2.5.2 עד 2.5.4.
   3. מוסיפים 2 מ"ל DMEM ומערבבים.
   4. הוסף 10 מיקרוליטר של טריפן כחול לצינור של 1.5 מ"ל וערבב עם 10 מיקרוליטר של תרחיף תאים.
   5. מניחים 10 מיקרוליטר מהתערובת על שקופיות הספירה וסופרים את התאים. חשב את ספירת התאים הממוצעת של שני הבתים. אם ההבדל גדול מדי בין שני הבתים, שקול לבצע מחדש את הספירה.
   6. חשב את נפח תרחיף התאים הנדרש עבור 10⁶ תאים והחלק נפח זה לצינורות של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה בחום של 300 × גרם למשך 5 דקות והניחו את הצינורות על קרח.
   7. הסר בזהירות את הסופרנטנט והוסף 5 מיקרוליטר DMEM ו -5 מיקרוליטר מטריצת קרום המרתף. מערבבים בזהירות את המתלים על ידי פיפטינג תוך שמירה על המתלה קר במהלך התהליך.
   8. הניחו את הצינורות בנפח 1.5 מ"ל המכילים את האורגנואידים על קרח במהלך ההובלה לעכברים והמשיכו בהזרקה.

3. הזרקת אורגנואיד לעכבר

1. צעדים פריאופרטיביים
   1. הוציאו את חיית הניסוי מהכלוב הראשי והכניסו אותה לכלוב מבודד וטרי עם מים.
   2. הרדמו את העכבר עם 1.5% עד 2.5% איזופלורן.
   3. יש לבצע הזרקה תת עורית לצוואר עם 10 מיקרוליטר בופרנורפין (0.3 מ"ג/מ"ל) 30 דקות לפני תחילת הניתוח.
   4. מיד לפני תחילת הניתוח, צבעו בזהירות את עיניהם של בעלי חיים בקרבומרום (למשל, לקרינורם) כדי למנוע יובש בעיניים במהלך הניתוח. אין לגעת בקרנית במהלך המריחה כדי למנוע שחיקה של הקרנית.
   5. הניחו את החיות על משטח נקי וסטרילי וטפלו בהן עם כפפות פלסטיק טריות, רשת שיער וחלוק עבודה מיוחד במעבדה המשמש רק במתקן העכברים.
   6. השתמש בשני פנסים פולטי חום קרוב לבעל החיים כדי לספק ראייה מספקת. אם יש ספק או חשש להיפותרמיה במהלך הניתוח, השתמש במנורת חימום אחרת או בשטיחון חימום.
2. לפרוטומיה
   הערה: לפני תחילת ההליך הכירורגי, עומק ההרדמה נבדק על ידי בדיקת צביטת הבוהן. במהלך ההליך ניתנה הרדמה נאותה באמצעות בדיקות שגרתיות וניטור קצב הנשימה והותאם אם הייתה עלייה רלוונטית. הציוד הניתוחי נוקה וחוטא בהתאם להנחיות הבית של מתקן בעלי החיים שלנו.
   1. הניחו את העכבר המורדם במצב שכיבה, הרחיבו את ארבע הגפיים וקבעו אותם בעזרת סרט. הסר את הפרווה על ידי מריחת קרם אפילציה והשתמש ברקמה רטובה כדי להסיר את עודפי הקרם והפרווה.
      הערה: אפילציה עובדת בצורה הטובה ביותר אם משתמשים בצמר גפן כדי לעסות את הקרם לתוך הפרווה כנגד הגרגר.
   2. לוקליזציה של הלינאה אלבה, שהיא היעד ללפרוטומיה. זהה גם את העורקים האפיגסטריים העליונים והתחתונים. הקפד לא לפגוע בכלים כדי למנוע פציעות.
   3. בצע חתך לאורך הלינאה אלבה בעזרת מלקחיים ומספריים מיקרו-כירורגיים מהבטן התחתונה לסחוס ה-xiphoid.
   4. הכנס את המחזירים והתאם את כיוון המתיחה לחשיפה אופטימלית של הבטן העליונה (איור 2A,B).
      הערה: אנו משתמשים במהדק נייר מכופף כמחזירים עם גומיות מחוברות לקיבוע.
3. הזרקת אורגנואידים
   1. הניחו מפית נקייה ממש ליד החתך והניחו עליה כמה טיפות מי מלח. הוצא את המעי הדק ואת הצקום והניח אותו על המפית הרטובה.
   2. חשוף את האונה העליונה הימנית (RSL) עד לאפשרות הזרקה.
   3. הכן את מזרק המילטון, שטוף אותו במים והניח סימן 2-3 מ"מ מהקצה כהתייחסות להזרקה.
   4. משכו את המזרק עם תערובת האורגנואידים המוכנה והזריקו את המחט עד לסימן. הזרקו לאט את האורגנואידים במצב יציב; אל תזיז את המחט במהלך תקופה זו.
   5. המתן 15-20 שניות כדי למנוע זרימה חוזרת של התערובת. הסר את המחט ולחץ מעט עם צמר גפן על מקום ההזרקה. בדוק אם יש קרע בבטן של אונת הכבד וזרימה חוזרת. שטפו את הבטן עם 0.5 מ"ל מי מלח סטריליים וסגרו את הבטן בתפר זורם בעזרת תפר נספג.
      הערה: אתר הניתוח היה מכוסה בווילון סטרילי. המכשירים הכירורגיים ששימשו במהלך ההליך נוקו בעיקר במים וחומרי ניקוי להסרת שאריות מקרוסקופיות. לאחר מכן המכשירים עובדו בתמיסת עיקור. חומרים מתכלים כמו חוטים, כפפות או צמר גפן שימשו רק פעם אחת מסיבות היגייניות והיו סטריליים.

4. כריתה קלה (30% מרקמת הכבד)

1. בצע את הלפרוטומיה כאמור לעיל בשלב 3.2.
2. השתמש במקלוני צמר גפן לחים ודחף את ה-ML בצורה גולגולתית כדי ליצור יותר מקום בתחום הכירורגי של ה-LLL.
3. הפוך את ה-LLL בצורה גולגולתית וחשוף את האונה הזנבית (CL) והרצועה, שנמצאת באופן קבוע בין ה-CL ל-LLL (איור 2C).
4. חותכים את הרצועה לחלוטין ומכניסים את הקשירה (חוט דק שאינו נספג, למשל פרולן 5-0) מתחת ל-LLL. כדי להבטיח שהוא יישאר במצב זה, הרטיבו את הקשירה והזיזו אותה לכיוון הרבע העליון הימני.
5. הפוך את ה-LLL בזנב. הנח את הקצה החופשי השמאלי של הקשירה סביב הקצה השמאלי של ה-LLL. הנח את הקצה החופשי הימני של הקשירה סביב הקצה הימני של ה-LLL. יש למרוח מתיחה זנבית על ה-LLL בעזרת צמר גפן ולהבטיח את המיקום הנכון והמרכזי של הקשירה.
6. קשרו חצי קשר כפול. אבטח את הקשר עם קשר חצי שני קשור בכיוון השני מבלי להדק אותו במלואו. הדק מעט את הקשרים, בדוק את המיקום הנכון של הקשירה ומקם אותה מחדש כדי להבטיח מיקום טוב.
7. הדק את הקשר לחלוטין על ידי החזקת הקצה החופשי של הגולגולת במקומו עם מלקחיים קהים ומשוך את הקצה החופשי הזנב עם זוג מלקחיים נוסף (איור 2D). אבטח את הקשר עם קשר חצי שני קשור בכיוון ההפוך.
8. כריתה את אונת הכבד. חותכים קרוב לקשירה מבלי לחתוך אותה.

5. כריתה גדולה (65% מרקמת הכבד)

1. בצע את הכריתה הקלה של ה-LLL כאמור לעיל (שלבים 3.4.1-3.4.8).
2. לחצות את הרצועה הפלציפורמית כדי לגייס את ה-ML. הפוך את האונה בגולגולת. הכנס את הקשירה מתחת לאונה והפוך את האונה בזנב.
3. סובב את הקצוות החופשיים סביב האונה. חזור על מיקום הקשירה במקרה של מיקום לא נכון במהלך המניפולציה. לאחר מיקום הקשירה כהלכה, הנח חצי קשר כפול, קשר אותו לאט ומקם מחדש את הקשירה במידת הצורך.
4. קושרים קשר חצי שני בכיוון ההפוך ומהדקים אותו לחלוטין. הוסף חצי קשר שלישי בכיוון ההפוך.
5. כריתה את האונה.
6. יש לשטוף את הבטן בתמיסת מלח סטרילית ולהניח את המעיים במקומם האנטומי.

6. סגירת הבטן

1. תפסו את העור והצפק בעזרת מלקחיים וצרו תפר עם תפר נספג (למשל, מונוקריל 5-0) בקצה העליון של קו החתך. הקפד לצאת בצד הצפק.
2. בצע את התפר השני על המקביל לחתך, ויצא בצד העור. קושרים את הקשר בחוזקה תוך השארת הקצה החופשי ללא המחט קצרה והקצה עם המחט ארוך. חותכים את הקצה הקצר לאורך של 2 מ"מ.
3. המשיכו בתפר הריצה וסיימו עם קשר בקצה התחתון של החתך.
4. נקה את בטן העכבר מכל הדם שנותר.

7. טיפול לאחר הניתוח

1. לאחר סגירת הבטן, יש להזריק עוד 10 מיקרוליטר של בופרנורפין (0.3 מ"ג/מ"ל) תת עורית לתוך הצוואר. הניחו את בעלי החיים בכלוב המבודד ששימש בעבר, המונח בחלקו על מחצלת חימום. ספקו אוכל נגיש בקלות על רצפת הכלוב.
   הערה: אין להשאיר את בעל החיים ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה.
2. בצע בקרות לאחר הניתוח שעתיים ו -6 שעות לאחר הניתוח. התבונן מקרוב בהתנהגות עם תשומת לב מיוחדת לכל סימן של כאב; יש לתת עוד 10 מיקרוליטר של Bupivacaine במידת הצורך.
3. לאחר שהעכבר מתאושש במלואו, אך לא לפני 6 שעות לאחר הניתוח ולא יאוחר מ-24 שעות לאחר הניתוח, הכניסו אותו שוב לכלוב הראשי. עקוב מקרוב אחר התנהגותם של כל בעלי החיים המעורבים בכל הנוגע לכל תוקפנות או התנהגות חשודה אחרת. כאשר יש ספק לגבי חולשה כלשהי של בעל החיים לאחר הניתוח, השאירו אותו מבודד למשך הלילה כדי להתאושש עד להחדרה מחדש סופית.
4. לאחר הבקרה הסופית לאחר הניתוח יום אחד לאחר הניתוח, המשך בשקילה הרגילה של בעלי החיים.
   הערה: משככי כאבים ניתנו 4 ו-8 שעות לאחר הניתוח. ניטור נוסף בוצע ב-12, 24 ו-48 שעות לאחר הניתוח, והעכברים נבדקו לאיתור כאב או מצוקה מכל סוג שהוא. אם נצפו סימני כאב כלשהם, ניתנה מנה נוספת של בופרנורפין.

8. מעקב אחר צמיחת הגידול

1. קבעו את העכברים באמצעות הרדמה איזופלורן והשתמשו בסונוגרפיה כדי לדמיין השתלת גידול החל משבועיים לאחר ההזרקה¹⁰.
2. המתת חסד של העכברים באמצעות CO₂.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בדקנו את התרומה של אונות הכבד הבודדות לנפח הכבד הכולל ומצאנו שה-LLL מייצג 33% מנפח הכבד הכולל. ה-ML מייצג 32% מנפח הכבד הכולל, ה-RSL 13%, ה-RIL 10% וה-CL 10% (טבלה 2). תרשימי הקופסה מראים שהתרומה היחסית של אונות הכבד ניתנת להשוואה בין העכברים השונים של אותו הזן (איור 3B

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

שלבים קריטיים בפרוטוקול
הרדמת עכבר
מטרת ההרדמה היא להמיר את העכבר בבטחה למצב בו הוא יסבול מניפולציה כירורגית. יחד עם זאת, השפעת ההרדמה לא צריכה להיות חזקה מדי, כדי למנוע דום לב ריאה ומוות כתוצאה מכך. הרדמה ממלפת קלה יותר למינון, ומאפשרת לחוקר להתאים ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F12 (adDMEM/F12)	Life Technologies	12634-034
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3733-50G
Bupaq Buprenorphinum 0.3 mg pro 1 mL	Streuli Tiergesundheit AG	1121915AB
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Collagenase IV	Worthington	LS004189
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (10 mL)	Corning (Merk)	CLS356231-1EA
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher
Deoxyribonuclease I Type IV from Bovine (DNAse)	Sigma-Aldrich	D5025-150KU
DMEM (1x)	Gibco	41965-039
DPBS, no calcium, no magnesium (500 mL)	Gibco	14190-094
Fetal Bovine Serum (FBS) (South America). Heat Inactivated – (500 mL)	Lubio Science	S181H-500
Glutamax (100x)	Gibco	9149793
Grant SUB Aqua Pro Water Bath	Grant Instruments
HEPES (1 M)	Thermo Fisher	15630056
Histogel	Thermo Fisher	R904012	specimen-processing  gel
Hyaluronidase Type IV from sheep (Tested)	Sigma-Aldrich	H6254-500MG
Inverted Microscope Olympus CKX53	Olympus
MacsMix Tube Rotator	Miltenyi Biotec
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
Red Blood Cell Lysis	Roche	11814389001
RPMI 1640 Medium	Gibco	72400-021
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red (100 mL)	Gibco	25200-056
Vitaris CO2 Incubator	Vitaris AG
Y-27632 dihydrochloride (Rock Inhibitor)	Abmole Bioscience	M1817