פנוטיפ מבוסס תמונה בתפוקה גבוהה לקביעת תגובות מורפולוגיות ופיזיולוגיות ללחצים בודדים ומשולבים בתפוח אדמה

Summary

תכננו פרוטוקול פנוטיפ מבוסס תמונה כדי לקבוע את התגובות המורפולוגיות והפיזיולוגיות לטיפולי חום, בצורת וכריתת מים בודדים ומשולבים. גישה זו אפשרה זיהוי של תגובות מוקדמות, מאוחרות והתאוששות ברמת צמח שלם, במיוחד חלקים מעל פני הקרקע, והדגישה את הצורך בשימוש בחיישני הדמיה מרובים.

Abstract

פנוטיפ מבוסס תמונה בתפוקה גבוהה הוא כלי רב עוצמה לקביעה לא פולשנית של התפתחות וביצועים של צמחים בתנאים ספציפיים לאורך זמן. על ידי שימוש בחיישני הדמיה מרובים, ניתן להעריך תכונות מעניינות רבות, כולל ביומסה של צמחים, יעילות פוטוסינתטית, טמפרטורת חופה ומדדי החזרת עלים. צמחים חשופים לעתים קרובות לעקות מרובות בתנאי שדה שבהם גלי חום קשים, שיטפונות ואירועי בצורת מאיימים באופן חמור על פריון היבול. כאשר לחצים חופפים, ההשפעות הנובעות מכך על צמחים יכולות להיות שונות עקב אינטראקציות סינרגטיות או אנטגוניסטיות. כדי להבהיר כיצד צמחי תפוחי אדמה מגיבים לעקות בודדות ומשולבות הדומות לתרחישי עקה טבעיים, הוטלו חמישה טיפולים שונים על זן תפוחי אדמה נבחר (Solanum tuberosum L., cv. Lady Rosetta) בתחילת השחפת, כלומר בקרה, בצורת, חום, כריתת מים ושילובים של חום, בצורת ועקות מים. הניתוח שלנו מראה כי לעקה של כריתת מים הייתה ההשפעה המזיקה ביותר על ביצועי הצמח, מה שהוביל לתגובות פיזיולוגיות מהירות ודרסטיות הקשורות לסגירת סטומטל, כולל ירידה בתפוקה הקוונטית וביעילות של פוטוסיסטם II ועלייה בטמפרטורת החופה ובמדד המים. תחת חום וטיפולי מאמץ משולבים, קצב הצמיחה היחסי הופחת בשלב המוקדם של הלחץ. תחת בצורת ועקות משולבות, נפח הצמח וביצועי הפוטוסינתזה ירדו עם עלייה בטמפרטורה וסגירת הפיוניות בשלב המאוחר של העקה. השילוב של טיפול אופטימלי בלחץ בתנאים סביבתיים מוגדרים יחד עם פרוטוקולים פנוטיפיים נבחרים איפשר לחשוף את הדינמיקה של תגובות מורפולוגיות ופיזיולוגיות ללחצים בודדים ומשולבים. כאן מוצג כלי שימושי לחוקרי צמחים המעוניינים לזהות תכונות צמחיות המעידות על עמידות למספר לחצים הקשורים לשינויי אקלים.

Introduction

ההשפעות האפשריות של שינויי האקלים, לרבות העלייה בעוצמתם ובתדירותם של גלי חום, שיטפונות ואירועי בצורת, הן בעלות השפעות שליליות על גידול יבולים¹. חשוב להבין את השפעת שינויי האקלים על השתנות היבול ואת התנודות הנובעות מכך בייצור היבול השנתי². עם הגידול באוכלוסייה ובביקוש למזון, שמירה על תנובת צמחי היבול היא אתגר, ולכן מציאת גידולים עמידים לאקלים לרבייה נדרשת בדחיפות ^3,4. תפוח אדמה (Solanum tuberosum L.) הוא אחד מגידולי המזון החיוניים התורמים לביטחון המזון העולמי בשל ערכו התזונתי הגבוה ויעילות השימוש המוגברת במים. עם זאת, ירידה בצמיחה וביבול בתנאים שליליים היא בעיה עיקרית, במיוחד בזנים רגישים ^5,6. מחקרים רבים הדגישו את החשיבות של חקירת גישות חלופיות לשמירה על תפוקת יבולי תפוחי האדמה, כולל שיטות חקלאיות, מציאת גנוטיפים סובלניים והבנת ההשפעה של לחץ על הפיתוח והיבול ^7,8,9, המבוקש מאוד גם על ידי מגדלי תפוחי אדמה אירופיים (או חקלאים)¹⁰.

פלטפורמות פנוטיפ אוטומטיות, כולל פנוטיפ מבוסס תמונה, מאפשרות ניתוחים כמותיים של מבנה הצמח ותפקודו החיוניים לבחירת תכונות רלוונטיות המעניינות^11,12. פנוטיפ בתפוקה גבוהה הוא טכניקה מתקדמת ולא פולשנית לקביעת תכונות מורפולוגיות ופיזיולוגיות שונות המעניינות באופן ניתן לשחזור ומהיר ¹³. למרות שהפנוטיפ משקף הבדלים גנוטיפיים בקשר להשפעות סביבתיות, השוואת צמחים בתנאים מבוקרים עם עקה מאפשרת לקשר את המידע הפנוטיפ הנרחב למצב ספציפי (עקה)¹⁴. פנוטיפ מבוסס תמונה חיוני לתיאור שונות פנוטיפית, והוא גם מסוגל לסנן קבוצה של תכונות לאורך התפתחות הצמח ללא קשר לגודל האוכלוסייה¹⁵. לדוגמה, מדידת תכונות מורפולוגיות, כולל הצורה, הגודל ואינדקס הצבע של עלים באמצעות חיישני הדמיה אדום-ירוק-כחול (RGB), משמשת לקביעת הצמיחה וההתפתחות של צמחים. יתר על כן, מדידות של תכונות פיזיולוגיות, כולל ביצועים פוטוסינתטיים, טמפרטורת חופה והחזרת עלים, מכומתות באמצעות סוגים רבים של חיישנים, כגון פלואורסצנטיות כלורופיל, אינפרא אדום תרמי (IR) והדמיה היפרספקטרלית¹⁶. מחקרים שנערכו לאחרונה בסביבות מבוקרות הראו את הפוטנציאל של שימוש בפנוטיפ מבוסס תמונה בהערכת מנגנונים שונים ותגובות פיזיולוגיות של צמחים תחת עקה אביוטית כגון חום בתפוח אדמה¹⁷, בצורת בשעורה¹⁸, אורז¹⁹, וטיפול משולב בצורת וחום בחיטה²⁰. אף על פי שחקר תגובותיהם של צמחים לאינטראקציות עקה מרובות הוא מורכב, הממצאים חושפים תובנות חדשות בהבנת מנגנוני צמחים בהתמודדות עם שינויים מהירים בתנאי אקלים²¹.

תגובות פיזיולוגיות ומורפולוגיות של צמחים מושפעות ישירות מתנאי עקה אביוטיים (טמפרטורה גבוהה, גירעון מים והצפות), וכתוצאה מכך ירידה ביבול²². למרות שלתפוחי אדמה יש יעילות שימוש גבוהה במים בהשוואה לגידולים אחרים, גירעון המים משפיע לרעה על כמות היבול ואיכותו בשל ארכיטקטורת השורשים הרדודים⁵. בהתאם לעוצמת ומשך הבצורת, מדד שטח העלה מצטמצם, ופיגור בצמיחת החופה עם עיכוב היווצרות עלים חדשים בולט בשלבים מאוחרים יותר של עקה המוביל לירידה בקצב הפוטוסינתזה²³. רמת הסף של המים היא קריטית עם עודף מים או תקופות בצורת ממושכות, וכתוצאה מכך השפעה שלילית על גדילת הצמח והתפתחות פקעות עקב הגבלת חמצן, ירידה במוליכות הידראולית השורש והגבלת חילופי הגזים^24,25. יתר על כן, תפוחי אדמה רגישים לטמפרטורות גבוהות שבהן טמפרטורות מעל רמות אופטימליות גורמות לעיכוב בהתחלת פקעות, צמיחה ושיעורי הטמעה²⁶. כאשר מופיעים לחצים בשילוב, התקנות הביוכימיות והתגובות הפיזיולוגיות שונות מתגובות העקה האינדיבידואליות, מה שמדגיש את הצורך לחקור את תגובות הצמחים לשילובי עקה²⁷. לחצים משולבים יכולים לגרום (אפילו יותר) להפחתה חמורה בצמיחת צמחים ולהשפעות דטרמיננטיות על תכונות הקשורות למערכת הרבייה²⁸. ההשפעה של שילוב עקה תלויה בדומיננטיות של כל עקה על פני האחרות, מה שמוביל לתגובה משופרת או מדוכאת של הצמח (למשל, בצורת בדרך כלל מובילה לסגירת הפיוניות בעוד הפיוניות פתוחות כדי לאפשר קירור של פני השטח של העלים תחת עקת חום). עם זאת, מחקר הלחץ המשולב עדיין מתפתח, ונדרשות חקירות נוספות כדי להבין טוב יותר את הרגולציה המורכבת המתווכת את תגובות הצמחים בתנאים אלה²⁹. לפיכך, מחקר זה שואף להדגיש ולהמליץ על פרוטוקול פנוטיפ באמצעות חיישני הדמיה מרובים שיכולים להתאים להערכת תגובות מורפו-פיזיולוגיות ולהבין את המנגנונים הבסיסיים של הביצועים הכוללים של תפוחי אדמה תחת טיפולי לחץ בודדים ומשולבים. כפי ששוער, שילוב חיישני הדמיה מרובים התגלה ככלי רב ערך לאפיון האסטרטגיות המוקדמות והמאוחרות במהלך תגובת העקה של צמחים. אופטימיזציה של פרוטוקול פנוטיפ מבוסס תמונה תהיה כלי אינטראקטיבי עבור חוקרי צמחים ומגדלים כדי למצוא תכונות מעניינות עבור עמידות לעקה אביוטית.

Protocol

1. הכנת חומר צמחי ותנאי גידול

1. השתלת תפוח אדמה במבחנה (Solanum tuberosum L., cv. Lady Rosetta) ייחורים מתרבית רקמה לתוך סירים 250 מ"ל.
2. מלאו את העציצים במצע Klasmman 2 רווי לחלוטין ושמרו אותם בתא הגידול בתנאי תאורה חלשה למשך שבוע.
3. כוונן את תנאי התאורה ברמת החופה ל- 160 μmol·^m-2·^s-1 עם שילוב של 25% אור לבן ו- 35% אינפרא אדום באמצעות מד אור.
4. השתילו את הצמחים לאחר 10 ימים של גידול ייחורים חוץ גופיים באדמה לתוך 3 ליטר עציצים (15.5 ס"מ קוטר, 20.5 ס"מ גובה).
5. ממלאים סיר 3 ליטר עם 1850 גרם של 3:1 מצע קלסמן 2: חול.
6. הניחו את הצמחים בתא הגידול בתנאי אור של 320 μmol·^m-2·^s-1 עם שילוב של 55% אור לבן ו-81% אינפרא אדום והגדירו אותו למשטר יום ארוך (16 שעות פוטופריוד).
7. הגדר את הטמפרטורה בתא הגידול ל- 22 ° C / 19 ° C ליום / לילה וללחות יחסית (RH) ל -55% לכל הניסוי.
8. שמור על משקל העציץ ב 60% תכולת מים יחסית לקרקע (SRWC) כרמת הבקרה המתאימה לשמירה על הצמיחה והתשואה ^30,31.
   הערה: בהתבסס על ניסויים קודמים, שמירה על תכולת מים נפחית מעל 60% קידמה את צמיחת הטחב על פני הקרקע והעלתה את הסיכון למחלות צמחים. בנוסף, נוכחותו של טחב עלולה ליצור אותות חיוביים מטעים מהדמיית כלורופיל פלואורסצנטית, שקשה לסנן אותה. השתמש במשוואה הבאה: SRWC% = (FW-DW)/(TW-DW) × 100, כאשר FW הוא משקל טרי הקרקע, TW הוא משקל טורגור, ו- DW הוא המשקל היבש³².
   1. בחרו את דגימות הקרקע (100 גרם) משלוש שקיות תערובת שונות של מצע Klasmman Substrate 2 כשוכפלות ושקלו את המשקל הטרי של הקרקע.
   2. יש להרוות את הקרקע במים עד שהעציצים מחזיקים מים ללא טפטוף ושוקלים את משקל טורגור הקרקע.
   3. מכניסים את הדגימה לתנור ב-80 מעלות למשך 3 ימים עד שדגימות הקרקע מתייבשות לחלוטין ושוקלים את הקרקע במשקל יבש³³.
9. הניחו את המחצלות הכחולות על משטח הסיר כדי להפחית את האידוי.
   הערה: צבע כחול נחוץ כדי להחסיר את רקע הקרקע מפיקסלים של צמחים בסגמנטציה של התמונה.
10. בחר עשרה שכפולים ביולוגיים לכל טיפול.
11. חלקו את העציצים באופן אקראי במהלך ההשקיה (בסך הכל, 50 עציצים).
12. הוסף את המחזיקים הכחולים כדי לתמוך בצמחים ולמנוע נזק מכני בעת הצבתם במערכת הפנוטיפ.

2. יישום מתח

1. בשלב השחפת המוקדם (28 יום לאחר השתלת הייחורים במבחנה ), חלקו את הצמחים לחמש קבוצות טיפול ופנוטיפ עשרה צמחים בכל טיפול (איור 1).
2. לגרום ללחץ יחיד ומשולב לרמה שאינה מזיקה כדלקמן:
   1. בתא הגידול, שמור על הצמחים תחת שליטה, בצורת וטיפולי כריתת מים ב 22 ° C / 19 ° C יום / לילה (שלב 1.7), עם אחוזים שונים של SRWC:
      בקרה (C) עם 60% SRWC לכל הניסוי.
      בצורת (D) עם 20% SRWC בהדרגה במשך 7 ימים, ואחריו יום אחד של התאוששות.
      Waterlogging (W) עם 160% SRWC במשך 5 ימים, ולאחר מכן 10 ימים של התאוששות.
   2. כדי לשמור על מפלס המים מעל פני הקרקע בטיפול בסתימת המים, הכניסו שקית ניילון לסיר הריק ולאחר מכן הכניסו את הסיר הראשי עם האדמה לסיר השני שהוכן.
   3. הניחו את הצמחים בכמוסת צמיחה בטמפרטורה של 30/28 מעלות צלזיוס ביום/לילה ו-55% לחות יחסית לטיפולי חום. להטיל עומסי חום בודדים ומשולבים כדלקמן:
      1. עבור חום (H), לשמור על הטמפרטורה 30-28 ° C עם 60% של SRWC במשך 15 ימים.
      2. עבור חום + בצורת + Waterlogging (HDW) מתח משולש, לחשוף את הצמחים לטיפול בחום ב 30 ° C / 28 ° C טמפרטורת יום / לילה במשך 7 הימים הראשונים (שמירה על 60% SRWC), ולאחר מכן בצורת + טיפול משולב חום במשך 7 ימים אחרים (20% SRWC ו 30 ° C / 28 ° C) ולבסוף לחשוף את הצמחים ללחץ waterlogging במשך יום אחד. עבור האחרון, החזירו את הצמחים לתא הגידול (ראו שלב 1.7 לתנאים) וגרמו לכריתת מים ל-160% SRWC למשך יום אחד.
         הערה: משכי הזמן שנבחרו של העקה המושרה התבססו על ניסוי פיילוט שהראה השפעות עקה ללא השפעות מזיקות עם 100% הישרדות של הצמחים המטופלים. בסביבת תא הגידול, השונות של תנאי הסביבה הייתה בטווח ± 0.2 מעלות צלזיוס לטמפרטורה ו -± 3% ללחות.

3. הכנת צמחים לפנוטיפ

1. לאחר הדלקת האורות בשעה 6:00 בבוקר בתאי הגידול, אפשרו לצמחים להתאקלם בתנאי אור הצמיחה הקבועים (320 μmol·^m-2·^s-1) במשך 2-3 שעות לפחות לפני תחילת פרוטוקול הפנוטיפ. זה מבטיח כי פוטוסינתזה וויסות stomatal נמצאים במצב יציב³⁴.
2. לפני המדידה, העבירו את הצמחים ממקום הגידול שלהם לאזור חיץ הצמיחה של מערכת הפנוטיפ המשמשת להעמסה ידנית של צמחים לתוך המערכת, כאשר הניקוד האוטומטי נמצא במצב המתנה וממוקם בתוך החממה (איור משלים 1, איור משלים 2 ואיור משלים 3).
   הערה: צמחים נשמרו באזור חיץ הצמיחה במהלך תקופת הפנוטיפ שנמשכה 3.5 שעות. בחממה, השונות של תנאי הסביבה הייתה בטווח של ± 2 °C (75 °F) עבור טמפרטורה, ± 5% עבור לחות, ו 20% תנודות בעוצמת האור. לכן, לשקול כי המדידות צריך להתחיל מיד להיות קצר, הימנעות ההשפעה של תנאי החממה על הצמחים.
3. בפלטפורמת הפנוטיפ, הניחו את הסירים בדיסקים הנעים אוטומטית על מסוע במרווחי זמן נתונים לחיישן ההדמיה בהתאם לפרוטוקולי המדידה המפורטים בסעיף 4.
4. תייגו כל צמח/מגש במזהה ייחודי כדי להבטיח שהנתונים הנמדדים מוקצים לצמח הנכון לאורך כל הניסוי.

4. פרוטוקול פנוטייפ

1. מטבו את פרוטוקול הפנוטיפ באמצעות חיישני הדמיה מרובים (כלורופיל פלואורסצנטי, IR תרמי, RGB והדמיה היפרספקטרלית), ובכך אפשרו מדידה סימולטנית של הפרמטרים הפיזיולוגיים והמורפולוגיים של צמחים (איור 2).
   הערה: מאחר שתגובות הצמחים משקפות את התנאים הסביבתיים ואת ההשפעות היומיות, חשוב לשקול אקראיות של העציצים וביצוע פנוטיפ באותה תקופה ביום.
2. בפלטפורמת הפנוטיפ, ודאו שהצמחים נכנסים למערכת דרך מנהרת הסתגלות (איור 2A) שבה גובה הצמח נלכד תחילה, ולאחר מכן הגובה של כל חיישן מותאם בהתבסס על מרחק עבודה קבוע.
3. בצע את המדידות בשני סבבים כפי שמוצדק בפרוטוקול המדידה באמצעות התוכנה.
   1. בסבב הראשון נכללו מדידות של תגובות פיזיולוגיות שכומתו כ"תגובות מהירות" באמצעות כלורופיל פלואורסצנטי והדמיה תרמית.
   2. התחל במדידת הפרמטרים הפיזיולוגיים תחת טיפולי לחץ חום ולאחר מכן את שאר הטיפולים.
   3. בסבב השני, המשיכו עם מדידות אחרות להערכת תגובות איטיות יותר, כולל RGB מבני והדמיה היפרספקטרלית, ולאחר מכן הערכת משקל והשקיה.
4. בשלב השקילה וההשקיה הגדירו את משקל הייחוס של כל צמח כדי לאפשר השקיה ושקילה אוטומטיות לטיפול הנתון.
   1. ודא שמשקל הייחוס הכולל כולל את משקל הדיסק, הכנס הממוקם על המסוע, מחזיק כחול תומך, מחצלת כחולה, עציץ, אדמה וביומסה צמחית בפרוטוקול המוגדר.
   2. למדידה מדויקת של האידוי בשלב השקילה וההשקיה, הכינו סירים ריקים כנקודת התייחסות. בנוסף, הכינו עציצים נוספים לתיקון משקל הביומסה של הצמח.
5. כדי למדוד 50 צמחים, משך פרוטוקול הפנוטיפ כולו אורך 215 דקות (85 דקות בסבב^הראשון ו-130 דקות^בסבב השני).
6. פנוטיפ יומי כל הצמחים בתנאי בקרה (יום אחד לפני הטיפול) ולאחר מכן לגרום לטיפולי הלחץ כדי לפקח על התגובות הדינמיות ולהעריך את השלבים המוקדמים והמאוחרים של העקה המושרה.

5. התאמת הגדרות עבור כל חיישן הדמיה

1. הדמיית כלורופיל פלואורסצנטית קינטית
   הערה: פלואורסצנטיות כלורופיל קינטית משמשת לחקר היכולת הפוטוסינתטית של צמחים בתגובה לתנאים סביבתיים שונים, כולל עקה אביוטית, ולספק מידע רב ערך על היעילות הקוונטית של פוטוכימיה ופיזור חום (תהליך לא פוטוכימי).
   1. בצע מדידת פלואורסצנטיות של כלורופיל על צמחים מותאמים לאור באמצעות פרוטוקול אור קצר כדי להבחין בתגובות של צמחים תחת טיפולים שונים.
   2. התאקלם³⁵ הצמחים במשך 5 דקות תחת האור במנהרת ההסתגלות המצוידת בנורות LED לבנות קרירות (6500 K) ב 500 μmol·^m-2·^s-1.
      הערה: הדמיית כלורופיל פלואורסצנטית היא המדידה הראשונה לאחר הסתגלות האור המשמשת לניטור שינויים ביכולות הפוטוסינתטיות של צמחים.
   3. בחר ובצע אופטימיזציה של הפרוטוקול שהוגדר מראש בהתאם לגודל הצמח ועוצמות האור הנדרשות.
   4. מטב את הגדרות המדידה, כולל הגדרות המצלמה ועוצמת האור כדי להבטיח קבלת אות חזק עם יחס אות לרעש אופטימלי.
      1. התאם הגדרות מצלמה כגון תריס (זמן חשיפה, משך מדידת פלאשים) ורגישות (רווח חשמלי של המצלמה). השתמש בתריס במהירות של 2 אלפיות השנייה וברגישות של 12%.
         הערה: ערכים אלה מותאמים בהתבסס על גודל העלה וצורתו והמרחק המוגדר בין החלק העליון של החופה לבין חיישן ההדמיה.
      2. כוונן את עוצמת האור האקטינית על 500 μmol·^m-2·^s-1 והגדר את פולס הרוויה על 3200 μmol·^m-2·^s-1, שהוא לפחות פי 6-7 גבוה יותר מאשר האור האקטוני.
   5. כדי למדוד פרמטרים במצב יציב של אור (Lss) (מתואר להלן), צמחים מתאימים לאור במשך 5 דקות לפני המדידות במנהרת הסתגלות האור.
   6. כדי להעריך את התפוקה הקוונטית של מערכת פוטוסיסטם יציבה II (PSII) של צמחים המותאמים לאור, בחרו את פרוטוקול האור הקצר (איור 3) והגדירו את הפרוטוקול באופן הבא.
      הערה: משך הפרוטוקול היה 10 שניות לצמח.
      1. התחל את המדידה על ידי הפעלת האור האקטין הלבן-קריר ב- 500 μmol·^m-2·^s-1 למשך 3 שניות כדי למדוד את הפלואורסצנטיות במצב יציב באור (F_t_Lss aka. פ_ט')
      2. החל פולס רוויה ב- 3200 μmol·^m-2·^s-1 במשך 800 אלפיות השנייה כדי למדוד את הפלואורסצנטיות המרבית במצב יציב באור (F_m_Lss aka. פ_מ')
      3. כבה את האור האקטיני, ולאחר מכן הפעל את האור האדום הרחוק (735 ננומטר) כדי לאפשר ל-PSII להירגע בחושך למשך 800 אלפיות השנייה ולמדוד את הפלואורסצנטיות המינימלית במצב יציב באור (F_o_Lss aka. פ_טו').
   7. כדי לחשב את הפרמטרים היחסיים, השתמש בתוכנת מנתח נתונים המחסירה את הרקע ומחלצת את הפרמטרים הרלוונטיים.
      הערה: הפרמטרים שחולצו מהפרוטוקול המשומש הם: יעילות מרבית של פוטוכימיה PSII של דגימה מותאמת אור במצב יציב של אור שנקבעה כ- F_v/F_m_Lss aka. F_v'/F_m', תפוקה קוונטית של פוטוסיסטם II או יעילות תפעולית של פוטוסיסטם II במצב יציב של אור המוגדר כ-QY_Lss aka. φ_PSII = F_q'/F_m', ושבר מרכזי התגובה הפתוחים ב-PSII (QA מחומצן) נקבע כ-qL_Lss = (F_q'/F_v') x (F₀'/F_t').
2. דימות אינפרא אדום תרמי (IR)
   הערה: הדמיית IR תרמית משמשת למדידה לא פולשנית של טמפרטורת החופה בפועל, ובכך קובעת את תקנות הסטומטליות השונות. ביחידת ההדמיה התרמית IR, מצלמה תרמית מותקנת לרוחב על הזרוע הרובוטית כדי למדוד את טמפרטורת החופה ממבט מהצד.
   1. כדי להגדיל את הניגודיות של טמפרטורת הרקע על פני הטמפרטורה של האובייקט המצולם במהלך עיבוד התמונה, השתמש בקיר מחומם הנשלט אוטומטית בצד הנגדי של המצלמה התרמית כדי להגדיל את הניגודיות. לווסת את טמפרטורת הקיר ב-8°C מעל טמפרטורת האוויר ביחידת ההדמיה.
      הערה: התמונות התרמיות נרכשו בחשיכה באמצעות מצב סריקת קו³⁵.
   2. לאחר רכישת תמונה, צרו מסיכת צמח המבוססת על נתוני תצוגת צד RGB והשתמשו בה כדי לבצע רישום משותף עם נתונים תרמיים בניתוח התמונה. זה מבטיח זיהוי מדויק של האובייקט הסרוק תוך ביטול הפרעות רקע כגון מחזיק הצמח.
   3. כדי למנוע את ההשפעה של תנאי סביבה משתנים לאורך כל הניסוי, חשב את הפרש הטמפרטורה של הפרמטר (דלתא T או ΔT).
      הערה: Delta T (ΔT) מוגדר כהפרש בין הטמפרטורה הנמדדת של פני השטח של העלה (הממוצע של כל הפיקסלים מכל פני השטח שזוהו של הצמח) לבין טמפרטורת האוויר בסביבה בתוך תיבת ההדמיה.
3. הדמיית RGB
   הערה: דימות RGB מבוסס על מצלמות מערכת אינרציאלית חזותית (VIS) המזהות אור בטווח הנראה בין 400-700 ננומטר, שם הוא משמש לניתוח מעמיק של מורפולוגיה של צמחים, ארכיטקטורה ומיצוי תכונות אינדקס צבע.
   1. יחידת ההדמיה מכילה טבלה מסתובבת למיקום מדויק של המגש ומאפשרת בו זמנית הדמיה מרובת זוויות לתצוגות צד.
   2. הגדר דימות RGB בהתבסס על הדמיה צידית כדי ללכוד את הצמח משלוש זוויות (0°, 120° ו- 240°), המצולמת במצב סריקה קווית (RGB1) והדמיה בתצוגה עליונה במצב תצלום בזק (RGB2).
   3. לשתי המצלמות מקור אור מבוסס LED, המבטיח תאורה הומוגנית של הצמח המצולם, ובכך קובע במדויק תכונות מורפולוגיות וצבעיות.
   4. חלץ פרמטרים מחושבים באמצעות תוכנת מנתח נתונים.
   5. עבור פרמטרים נוספים המבוססים על מבט צדדי ועליון, חשב את נפח הצמח (ביומסה דיגיטלית)³⁶:
      
   6. חישוב קצב הצמיחה היחסי (RGR)³⁷:
      
      כאשר T_n ו- T_n+1 מציינים את מרווח הזמן (ימים).
4. הדמיה היפרספקטרלית
   הערה: הדמיה היפרספקטרלית משמשת להדמיה של ההשתקפות הספקטרלית של הצמחים. השינויים בהחזרת העלים הם אינדיקטורים למצב הפיזיולוגי השונה של הצמח הנתון.
   1. השתמש בחיישן ההדמיה ההיפרספקטרלית כדי לכמת את החזרת החופה בחלק הנראה של ספקטרום האור, עם מצלמה היפרספקטרלית נראית כמעט אינפרא אדום (VNIR) בטווח 380-900 ננומטר ומצלמת אינפרא אדום באורך גל קצר (SWIR) בטווח 900-1700 ננומטר.
   2. המצלמות מותקנות על זרוע רובוטית עם מקור אור צינור הלוגן מיושם (600 W) להארה הומוגנית וספקטרלית מתאימה במהלך רכישת תמונה הנעה על פני אזור XZ.
   3. שתי המצלמות פועלות במצב סריקה קווי וממוקמות בקופסת הדמיה מבודדת אור.
   4. לפני כל סבב מדידה, בצעו שתי מדידות כיול (אוטומטיות): כיול זרם כהה וכיול רדיומטרי באמצעות תקן טפלון החזרה ספקטרלית.
   5. תמונת הכיול הכהה מופחתת מתמונת הכיול הגולמית והלבנה כדי להסיר את רעשי הזרם הכהה. לאחר מכן, צור את ההיפרספקטרל הסופי על-ידי חלוקת התמונה הגולמית לאחר החיסור בתמונת הכיול הלבנה.

6. ייצוא נתונים וניתוח תמונות

1. השתמשו בתוכנת מנתח הנתונים לחילוץ אוטומטי, חיסור רקע וסגמנטציה של מסיכת צמחים של צינור עיבוד התמונה (איור 2B).
2. התוכנה מבצעת ניתוח אוטומטי לחלוטין שבו יישום מסיכה, חיסור רקע שבו צמחים מבודדים מהרקע שלהם, וחישוב פרמטרים מעובדים כמתואר עבור הדמיה RGB³⁸ והדמיה תרמית²⁰.
3. חלצו את הפרמטרים הנמדדים והמחושבים מהפיקסלים הספציפיים לצמח, כפי שהוגדרו על-ידי מסיכת הצמח והמגש שנוצרו בתמונת RGB.
4. אם התמונות לא נבחרו במלואן, דבר שיכול להתרחש עקב שינויים בירוק הצמחייה בשלבי התפתחות מאוחרים יותר או השפעת טיפול בעקה, פתחו את חלק ניתוח הנתונים המקומי בתוכנה והתאימו מחדש את הגדרות מסכת הצמחים בתוכנת מנתח הנתונים בהתאם לכל חיישן.
5. בעיבוד תמונה פלואורסצנטית של כלורופיל, התאימו את פרמטרי ניתוח הגדרות מסכת הצמחים של כלורופיל פלואורסצנטי (איור משלים 4).
   1. הגדר את הסף כ - True, כלומר פילוח הצמחים מתבצע באופן אוטומטי.
   2. הגדר את אינדקס מסגרת המסכה כ - False, כלומר לזיהוי מסיכת צמחים , מסגרת הזמן-ראייה משמשת כמוגדר בפרוטוקול פלואורסצנטיות כלורופיל.
6. בעיבוד תמונה תרמית, קבעו את הפרמטרים לניתוח מסכת צמחים (איור משלים 5).
   1. קבעו את הסף האוטומטי ליצירת מסיכת עצם כ - False.
   2. קבעו את המסיכה מתמונת הצד RGB כ - True לשימוש לניתוח.
7. בעיבוד תמונה RGB, התאימו את פרמטרי הניתוח של הגדרות מסיכת הצמח (איור משלים 6 ואיור משלים 7) בהתאם למין ולשלב ההתפתחותי.
   1. בחר את הנוסחה 4*G-3*B-R, שהיא ההגדרה ליצירת מסיכת אובייקט ומגדירה את רכיב הצבע המשמש (רכיב אדום, ירוק, כחול).
      הערה: נוסחה סטנדרטית זו והגדרות אחרות עשויות להשתנות בהתאם לסוג המצלמה שבה נעשה שימוש (תצוגה עליונה או גודל), טיפול יישומי וזנים שונים.
   2. התאימו את הסף המשמש להמרה של תמונה בגווני אפור עם ערוץ ירוק משופר לתמונה בינארית – כדי לקבוע את פני השטח המכוסים על-ידי הצמח.
   3. התאם את גודל המסנן החציוני המשמש להפחתת הרעש והפיקסלים הלא חוקיים והשלם פיקסלים חסרים.
   4. התאם את הגודל המינימלי של האובייקט בפיקסלים כדי שייכלל בניתוח.
   5. התאימו את הגודל המינימלי של חורים בעצם המסיכה בפיקסלים, בדרך כלל עשרות פיקסלים. החורים הקטנים מערך זה נסגרים ונלקחים לפיקסלים של האובייקט.
   6. קבעו את 'השתמש בהפחתת השתקפות ' כ- True לנרמול ערכי RGB בכל פיקסל.
   7. הגדר את האפשרות דלג על נקודות חשופות רעות כ - True לחיתוך מעל/מתחת לפיקסלים חשופים ממסיכת הצמח (לדוגמה, השמטת השתקפויות פני השטח או פיקסלים כהים שבהם הרעש גדול מהאות).
8. צבעו את הגדרות הסגמנטציה שנותחו מ-RGB באמצעות תוכנת מנתח הנתונים כדי לספק מידע על שינויי צבע הקשורים לתגובות עקה ולהזדקנות צמחים.
   הערה: הירוקות נאמדת באמצעות טווח מוגדר מראש של צבעים המייצגים את כל שלבי התפתחות הצמח. העוצמה בערוצי הצבע מכל הפיקסלים המתאימים לפני השטח של הצמח קובצה וקובצה כדי לשמש כמפת צבע מקור לפילוח צבעים.
   1. ספק את תמונת RGB המעובדת (רקע שהוסר), מפת צבעים - רשימת גוונים לניתוח ספציפי, כקלט בתוכנה.
   2. כדי לקבל תוצאות בלתי משוחדות, בצעו בחירת גוונים באמצעות מערך נתונים של "אימון" ובחרו שלבים התפתחותיים וטיפולים שונים.
      הערה: ניתוח שומר ערכי R, G ו- B של כל פיקסל בכל תמונה מתוך ערכת נתוני אימון זו.
   3. הגדר את מספר הגוונים (בחר 6 גוונים) באמצעות התוכנה לפלט הגדרת הצבע, הנע בין 0-255 לכל ערוץ.
   4. ספק את רשימת הגוונים שנוצרו בתוכנת מנתח הנתונים (צבעים).
9. בעיבוד תמונה היפרספקטרלי, עבד את הנתונים ההיפרספקטרליים שנרכשו באמצעות ניתוח פיקסל אחר פיקסל המיושם בתוכנת המנתח ההיפרספקטרלי, הכולל כיול רעש רדיומטרי וכהה, חיסור רקע ופילוח מסיכות צמחים. השתמש במדדי הספקטרום והצומח הממוצעים לניתוח נוסף.
10. צור את המסיכה לחילוץ נתונים מהתמונה ההיפרספקטרלית מתמונת VNIR שצולמה על-ידי המצלמה ההיפרספקטרלית VNIR. עבור סריקה היפרספקטרלית SWIR, צור מסיכת צמח המבוססת על ניתוח SWIR.
    1. במסיכת צמחים VNIR, השתמש בנוסחה 1.2*(2.5*(R740-R672)-1.3*(R740-R556)) להמחשת התמונות שבהן R מייצג ערך החזרה באורך גל מסוים (איור משלים 8).
    2. ב - SWIR Plant Mask, השתמש בנוסחה (R960-R1450)-(R960-R1200) בעיבוד תמונה להמחשת התמונות (איור משלים 9).

7. שקילה והשקיה

1. יש לאחסן את המשקל (לפני) ההשקיה במהלך הליך השקילה וההשקיה. לאחר מכן יש למרוח את ההשקיה, ולשמור על המשקל גם לאחר ההשקיה.
2. השקו את המגשים במצב התייחסות - לכל מגש היה ערך התייחסות המאוחסן במסד הנתונים, אליו הוא הושקה תמיד. לקבוע את ההתייחסות על סמך הטיפול.

8. ניתוח נתונים

1. נתח את הנתונים באמצעות מבחן ANOVA ומבחן שפירא.
2. ביצוע השוואות זוגיות בין טיפולים שונים על ידי בדיקת Pairwise Wilcox בסטודיו R (גרסה 4.2.3) באמצעות חבילות (dplyr), (tidyverse), (rstatix) ו- (ggpubr).
   הערה: ניתוח התמונה נעשה באופן אוטומטי באמצעות תוכנת מנתח נתונים. לניתוח נוסף של רכישת התמונה, השתמש בתוכנת מנתח נתונים ספציפית לחיישן.

תוצאות

במחקר זה, נעשה שימוש בפנוטיפ אוטומטי מבוסס תמונה כדי לחקור את התגובות המורפולוגיות והפיזיולוגיות של תפוח אדמה (cv. Lady Rosetta) תחת לחץ יחיד ומשולב. הגישה היישומית הראתה את התגובות הדינמיות של צמחים ברזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה כאשר נוצר לחץ בשלב התחלת הפקעת. כדי להעריך את השלבים המוקדמים והמאוחרים של סטרס, התוצאות הוצגו כ-3 פרקי זמן ([0-5 ימים של פנוטיפ (DOP)], [6-10 DOP] ו-[11-15 DOP]) (איור 1). עד 0 DOP, כל הצמחים גודלו בתנאי בקרה (C), ולאחר מכן מ 1-5 DOP, שבו מתח כריתת מים (W) ועקה חום (H) יושמו. לפיכך, התגובות נצפו כדלקמן: (i) ב 0-5 DOP, ציין את החום הראשוני ואת waterlogging; (ii) ב-6-10 DOP, שיקף את הבצורת המוקדמת (D) ונצפו חום ובצורת משולבים (HD) ו-(iii) ב-11-15 DOP, הראה את החום המאוחר, הבצורת והחום המשולב + בצורת + כריתת מים (HDW). ההתאוששות מכריתת מים נצפתה ב 6-10 DOP ו 11-15 DOP.

תכונות מורפולוגיות
הדמיית RGB יושמה כדי לקבוע את ההשפעה של לחצים ושילובים שונים על צמיחת צמחים מעל פני הקרקע. התוצאות באיור 4 מראות שטיפול בחום ועקה של כריתת מים (0-5 DOP) כבר גורמים לירידה בנפח הצמח וב-RGR בהשוואה לביקורת. במהלך 6-10 DOP, נפח הצמחים וה-RGR של מפעלי הבקרה גדלו ברציפות, בעוד שתחת חום, בשילוב חום, בצורת וכריתת מים, הגידול הזה בנפח הצמחים הופחת בבירור (איור 4A). מאחר שצמחים רגישים מאוד לעקה של כריתת מים, נצפתה ירידה ב-RGR (איור 4B). במהלך לחץ בצורת מאוחר (11-15 DOP), שבו SRWC נשמר על 20%, נצפתה ירידה ברורה ב- RGR בהשוואה לביקורת. עם זאת, בשלב המאוחר של HDW משולב, היישום של טיפול waterlogging גרם לעלייה RGR ביום האחרון של מתח.

תכונות פיזיולוגיות
השילוב של פנוטיפ מבני ופיזיולוגי יושם כדי לחשוף תגובות נוספות ללחץ. שימוש בחיישני הדמיה מרובים מאפשר לקבוע את התגובות הפיזיולוגיות בשלב המוקדם של הלחץ. ניתוח נוסף של נתוני כלורופיל פלואורסצנטי הראה כי כריתת המים השפיעה לרעה על יעילות הפוטוסינתזה כאשר F_v'/F_m' (F_v/F_m_Lss) ירדה באופן דרמטי ב-0-5 DOP וב-6-10 DOP, אך תגובת התאוששות נצפתה ב-11-15 DOP שבו F_v'/F_m' עלה מעט (איור 5A). במהלך שלב העקה המאוחרת (11-15 DOP), נצפתה ירידה של F_v'/F_m' בבצורת בשילוב חום ובצורת. במפעלים ספוגי מים, יעילות ההפעלה של צמחים (QY_Lss aka φ_PSII) הייתה נמוכה משמעותית בהשוואה לטיפולים אחרים ב-0-5 DOP וב-6-10 DOP, אך עלייה קלה ב-11-15 DOP, מה שמצביע על התאוששות הצמח (איור 5B). יתר על כן, המנגנונים השונים בוויסות היעילות התורמת להגנה על PSII נקבעו על-ידי חישוב החלק של מרכזי התגובה הפתוחים ב-PSII במצב יציב קל (qL_Lss) (איור 5C). רק תחת בצורת נצפתה עלייה ב-qL, כנראה בגלל פוטואינהיביציה.

ממצאים אלה היו בהתאם לנתוני IR ששיקפו מנגנונים בסיסיים שונים תחת לחצים (איור 6). עלייה בדלתא T (ΔT) נצפתה בכריתת מים, מה שהפחית את שער החליפין של הגז. תחת בצורת מאוחרת ועקות משולבות של חום ובצורת, עלייה ב-ΔT נבעה מסגירת פיוניות, שנחשבה לאחת התגובות העיקריות למניעת אובדן מים עודף. מצד שני, נצפתה ירידה ב- ΔT תחת טיפולי חום כאשר הפיוניות נפתחות כדי לשפר את יעילות השעתוק ולקרר את פני העלה.

על ידי חקירת הנתונים ההיפרספקטרליים, נבחרו שני פרמטרים מתוך נתוני VNIR היפרספקטרליים כדי להעריך את מדדי החזרת העלים, כולל NDVI כאינדיקטור לתכולת הכלורופיל ו- PRI כאינדיקטור ליעילות הפוטוסינתזה. התוצאות הראו ירידה ב-NDVI וב-PRI רק תחת כריתת מים בקשר לירידה שנצפתה בתכונות המורפולוגיות (איור 7A,B). יתר על כן, מהנתונים ההיפרספקטרליים של SWIR המשמשים להערכת תכולת המים בצמחים, נצפתה עלייה במדד המים בכריתת מים במהלך 0-5 DOP (איור 7C). עם זאת, תחת טיפולי חום, נצפתה תגובה הפוכה כאשר מדד המים היה נמוך יותר מהביקורת. ממצאים אלה היו בהתאם לבחינת צמחייה מפילוח הצבעים של מבט RGB למעלה. השינויים בשיעור הגוונים מצביעים על תגובות הלחץ לאורך זמן (איור 8). מדד הירוק הראה ירידה בתכולת הפיגמנטים תחת בצורת ושילב HDW בשלב הלחץ המאוחר והתאוששות הדרגתית מטיפול בכריתת מים. לפיכך, השימוש בחיישני הדימות המרובים שיקף את המתאם בין תכונות מורפו-פיזיולוגיות ואיפשר להעריך את הביצועים הכוללים של הצמח תחת עקה אביוטית.

איור 1: ציר הזמן של יישום הטיפולים השונים, כולל גיל הצמחים בימים שלאחר השתלת הייחורים במבחנה . יום 0 של פנוטיפ (DOP) נמדד בתנאי בקרה (C), ואז הלחצים השונים הושרו עם משכי זמן שונים. מ 1-5 DOP waterlogging (W) מתח הוחל ואת התגובה הראשונית של טיפול בחום (H). בימים שלאחר מכן 6-10 DOP, שם הוצג השלב הראשוני של עקת בצורת (D) ועקה משולבת של חום ובצורת (HD). במהלך 11-15 DOP, התגובה של צמחים לשלב המאוחר של בצורת וטיפולי חום ויישום של כריתת מים ל- HD (HDW) ליום אחד השתקפה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: סכימה המסכמת את פרוטוקול הפנוטיפ וניתוח הנתונים. (A) סקירה כללית של פרוטוקול הפנוטיפ. צמחים מועברים למערכת הפנוטיפ מהתנאים המבוקרים בתא הגידול FS-WI (PSI). הצמחים התאקלמו באור בתא הסתגלות האור במשך 5 דקות ^{בטמפרטורה} של 500 μmol.m-2.s-1 לפני המדידות. חיישני הדמיה מרובים שימשו לקביעת תכונות מורפולוגיות ופיזיולוגיות, ולאחר מכן תחנת השקלול וההשקיה. בהתאם לטיפול, הצמחים הוחזרו בתנאים מבוקרים, בטמפרטורה של 22°C/19°C או 30°C/28°C. (B) חילוץ וסגמנטציה אוטומטיים של צינור עיבוד התמונה מכל חיישן הדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: סקירה כללית של פרוטוקול אור קצר עבור דימות פלואורסצנטי של כלורופיל. פרוטוקול המדידה החל בהפעלת אור אקטיני לבן-קר כדי למדוד את פלואורסצנטיות המצב היציב באור (F_t_Lss) ולאחר מכן הפעלת פולס רוויה כדי למדוד את הפלואורסצנטיות המרבית באור במצב יציב (F_m_Lss). האור האקטין כובה, והאור האדום הרחוק הופעל כדי לקבוע את הפלואורסצנטיות המינימלית במצב יציב באור (F_o_Lss). משך הפרוטוקול היה 10 שניות לכל מפעל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: דימות RGB המשמש להערכה מורפולוגית. (A) נפח הצמח מחושב מאזור התצוגה העליונה והצידית של RGB. (B) קצב גדילה יחסי (RGR) בשלב התחלת הפקעת. הנתונים מייצגים ערכים ממוצעים ± סטיית תקן (n = 10). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: דימות פלואורסצנטי של כלורופיל בצמחים מותאמי אור. (A) יעילות מרבית של פוטוכימיה PSII של דגימה מותאמת אור במצב יציב של אור (F_v/F_m_Lss). (B) תפוקה קוונטית או יעילות תפעולית של פוטוסיסטם II במצב יציב של אור (QY_Lss). (C) חלק ממרכזי התגובה הפתוחים ב-PSII במצב יציב של אור (QA מחומצן) (qL_Lss). הנתונים מייצגים ערכים ממוצעים ± סטיית תקן (n = 10). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: הדמיית IR תרמי שימשה לחישוב ההבדל בין הטמפרטורה הממוצעת של החופה שחולצה מתמונות IR תרמיות לבין טמפרטורת האוויר (ΔT). הנתונים מייצגים ערכים ממוצעים ± סטיית תקן (n = 10). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: הדמיה היפרספקטרלית לקביעת מדדי צמחייה ותכולת מים. (A) מדד צמחייה הפרשי מנורמל (NDVI). (B) אינדקס החזרה פוטוכימית (PRI) המחושב מהדמיית VNIR. (C) מדד מים המחושב מהדמיית SWIR. הנתונים מייצגים ערכים ממוצעים ± סטיית תקן (n = 10). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשים 8: מדד הירוק לצמחים בטיפולים שונים. עיבוד התמונה מבוסס על שינוי צורה של תמונת RGB המקורית במפת צבע הכוללת 6 גוונים מוגדרים. הנתונים מייצגים ערכים ממוצעים ± סטיית תקן (n = 10). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: עוצמת האור שנמדדה במהלך ימי הפנוטיפ (DOP). משך המדידות בין השעות 9: 00-12: 35. LI_Buff מתייחס לנתונים החציוניים מ -5 חיישני אור המופצים בחממה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: לחות יחסית (RH) שנמדדה בימי הפנוטיפ (DOP). משך המדידות בין השעות 9: 00-12: 35. RH_Buff מתייחס לנתונים החציוניים מ -5 חיישני לחות המופצים בחממה. RH2 מתייחס ללחות היחסית בתא ההסתגלות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

תרשים משלים 3: הטמפרטורה שנמדדה בימי הפנוטיפ (DOP). משך המדידות בין השעות 9: 00-12: 35. T_Buff מתייחס לנתונים החציוניים מ -5 חיישני טמפרטורה המופצים בחממה. T2 מתייחס לטמפרטורה בתא ההסתגלות. T3 מתייחס לטמפרטורה של קיר החימום. T4 מתייחס לטמפרטורה ביחידת ההדמיה התרמית IR. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 4: צילום מסך מתוכנת Data Analyzer המציג את הפרמטרים שהותאמו לניתוח מסכות צמחים בחיישני הדמיה פלואורסצנטית של כלורופיל. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

תרשים משלים 5: צילום מסך מתוכנת מנתח נתונים המציג את הפרמטרים המותאמים לניתוח מסכות צמחים בחיישני הדמיה תרמית אינפרא אדום. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

תרשים משלים 6: צילום מסך מתוכנת מנתח נתונים המציג את הפרמטרים המותאמים לניתוח מסיכות צמחים בחיישני הדמיה של תצוגת RGB בצד אחד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

תרשים משלים 7: צילום מסך מתוכנת מנתח נתונים המציג את הפרמטרים המותאמים לניתוח מסיכות צמחים בחיישני הדמיה מסוג RGB2-top. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

תרשים משלים 8: צילום מסך מתוכנת ניתוח נתונים המציג את הפרמטרים המותאמים לניתוח מסכות צמחים בחיישני הדמיה VNIR. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

תרשים משלים 9: צילום מסך מתוכנת Data Analyzer המציג את הפרמטרים המותאמים לניתוח מסכות צמחים בחיישני הדמיה SWIR. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

כלי הדמיה מתקדמים משופרים ברזולוציה גבוהה וטכניקות ראייה ממוחשבת אפשרו את הפיתוח המהיר של פנוטיפ צמחים כדי לקבל נתונים כמותיים מתמונות צמחים מסיביות באופן הניתן לשחזור³⁹. מחקר זה נועד להתאים ולמטב מתודולוגיה מבוססת תמונה בתפוקה גבוהה באמצעות מערך של חיישני הדמיה הזמינים כיום כדי לנטר את התגובות הדינמיות של צמחים תחת עקה אביוטית יחידה ומשולבת. מספר שלבים קריטיים של הגישה היישומית דורשים התאמות, כולל הפעלת לחץ ובחירת פרוטוקול הדמיה מתאים למדידות. שימוש בחיישנים מרובים לרכישת תמונה מאפשר לכמת תכונות פנוטיפיות מרכזיות (כגון גדילת צמחים, יעילות פוטוסינתטית, ויסות סטומטאלי, החזרת עלים וכו'). בנוסף, משפר את ההבנה של האופן שבו צמחי תפוחי אדמה מגיבים לעקות אביוטיות שונות. זהו תנאי מוקדם מרכזי להאצת פרויקטים של גידול צמחים לפיתוח גנוטיפים עמידים לאקלים⁴⁰. התגובות המורפולוגיות ללחץ המושרה תלויות בשלב ההתפתחות. לדוגמה, הפעלת לחץ בשלב התחלת הסטולון או הפקעת מעכבת את התפתחות העלים והצמחים ומגבילה את מספר הסטולונים, ובכך מפחיתה את היבול הסופי⁴¹. עם זאת, בתנאים שליליים, צמחים משתמשים בתגובות עקה כתגובה אדפטיבית כדי למנוע ולתקן נזק תאי הנגרם על ידי עקה⁴². לצמחים יש מנגנוני הסתגלות כדי להימנע ולסבול תנאי עקה בהתאם לרמת החומרה⁴³.

כדי להבין את המנגנונים של צמחים, גרימת משך ועוצמת העקה המתאימים וקביעת תגובות הצמח לעקה באמצעות חיישני הדמיה נחשבים לאחד השלבים הקריטיים. כאשר מספר לחצים חופפים, העוצמה של מתח אחד יכולה לבטל את ההשפעה של האחרים בהתאם לשילוב, עוצמה ומשך של הלחצים. לכן, השפעות העקה יכולות להצטבר, או שתגובות מנוגדות יכולות (חלקית) לבטל זו את זו, ובסופו של דבר לגרום להשפעות חיוביות או שליליות על צמחים. הפרוטוקול שנבחר במחקר זה התבסס על ניסיון קודם כדי להבטיח שיושמו רמות מתח מספיקות. לדוגמה, היישום של עקה בצורת הותאם לרמה מתונה כמו בניסוי קודם, התגובה לא הייתה שונה מטיפולי ביקורת בשלב מוקדם של לחץ המבוססים על הדמיית כלורופיל פלואורסצנטית. זאת בשל התרחשות של photorespiration המשמש כיור חלופי עבור אלקטרונים בקרום thylakoid ומנגנון הגנה עבור photosystem II^44,45. תחת תגובת העקה המשולבת, חשיפה צמחית לגורם עקה ראשוני מתון עשויה להגביר את הסבילות לגורם עקה עוקב, דבר שיכול להיות בעל השפעה מועילה או מזיקה⁴⁶. במחקר זה נצפתה תגובה חזקה יותר תחת לחץ משולב בהשוואה לעקה אישית של בצורת. על ידי חקירת תגובות פיזיולוגיות אחרות, התוצאות הראו עלייה ב- ΔT (דלתא) תחת בצורת כמו פיוניות קרובות כדי למנוע אובדן מים עודף. לעומת זאת, התגובה ההפוכה נצפתה תחת עקת חום שבה ΔT היה נמוך יותר בהשוואה לביקורת המשקפת פתח פיוניות כדי להגביר את קירור העלים בהתאם לממצאים בחיטה תחת לחץ משולב של חום ובצורת²⁰. במהלך כריתת מים, העלייה ב-ΔT עקב סגירה סטומטית נבעה ממחסור בחמצן בקרקע ומהפרעה בהומאוסטזיס של מי השורש, ובכך הורידה את זרם השעתוק עם עלייה ב-ABA, הורמון מפתח בתגובות לעקה במים⁴⁷.

במחקרי עקה צמחית, משך הסטרס וטיפולי ההתאוששות שלאחריו עומדים ביחס ישר לעוצמת העקה. לדוגמה, עקת בצורת מתונה, כגון שמירה על לחות הקרקע בקיבולת שדה של 20% (FC), גורמת לשינויים פנוטיפיים הפיכים שבדרך כלל מתאוששים לאחר יום אחד של השקיה מחדש. לעומת זאת, תנאי עקה חמורים כמו כריתת מים גורמים לנזק פנוטיפי נרחב, המחייב תקופת החלמה ארוכה יותר. למרות שסטנדרטיזציה של משכי הטיפול היא אידיאלית, יש לקחת בחשבון את השונות האינהרנטית בעוצמות הלחץ בתכנון הניסוי.

השלב הקריטי השני הוא לבחור פרוטוקול מתאים ולמטב את ההגדרות עבור כל חיישן. כלורופיל פלואורסצנטי הוא כלי רב עוצמה בקביעת הביצועים של מכשיר פוטוסינתטי תחת לחץ⁴⁸. ניתן לבחור פרוטוקולים שונים למדידת פלואורסצנטיות של כלורופיל עם צמחים מותאמים לאור או כהה, בהתאם לשאלת המחקר ולתכנון הניסוי⁴⁹. במחקר זה, הפרוטוקול שנבחר (תגובת אור קצרה) מאפשר לקבוע תכונות שונות, כולל F_v'/F_m', φ_PSII ו-qL, המציינות את ביצועי הפוטוסינתזה בתנאים שונים⁵⁰. מחקרים קודמים הראו כי הפרוטוקול המשמש בפנוטיפ בתפוקה גבוהה יעיל בחקירת יעילות הפוטוסינתזה של צמחים תחת יישומים שונים של טיפולי עקה והבחנה בין צמחים בריאים לצמחים בסטרס^14,20. בהתבסס על תכנון הניסוי, קריטי מאוד לקחת בחשבון את משך הזמן של הפרוטוקול שנבחר בעת מדידה במערכת תפוקה גבוהה עם אוכלוסיית צמחים גבוהה. לפיכך, מדידת פלואורסצנטיות כלורופיל על צמחים מותאמים לאור באמצעות פרוטוקול זמן קצר נבחרה כדי להבחין בתגובות תחת טיפולים שונים. אינטראקציות גנוטיפ-סביבה יכולות להשפיע על תכונות פנוטיפיות רבות, וזה קריטי במהלך מדידה¹². חשוב לקחת בחשבון כי יש להשלים את משך המדידה בזמן קצר כדי למזער את ההשפעה היומית על מגבלות פוטוסינתטיות⁵¹.

הדמיית IR תרמית שימשה לקביעת טמפרטורת החופה ולהבנת ויסות הסטומטלית תחת טיפולים שונים⁵². ראוי להזכיר כי אופטימיזציה טכנולוגית שימשה כאשר קיר החימום היה ממוקם בצד הנגדי של המצלמה, ואת הטמפרטורה של הקיר היה נשלט באופן דינמי לתכנות. לפיכך, התאמת הקיר המחומם ברקע עם חיישנים סביבתיים משולבים נחוצה כדי לבחור כראוי צמחים מהרקע על ידי הגדלת הניגודיות של טמפרטורת הרקע על טמפרטורת האובייקט המצולם.

למרות שניתוח התמונה הוא אוטומטי, עדיין נדרשת התאמת אינדקסי סף RGB כדי לקבל מסיכה בינארית מתאימה בהדמיית RGB כדי לבחור במדויק צמחים⁵³. בנוסף, בחירת זוויות מרובות חשובה להערכה נכונה של פרמטרים כמותיים, כולל ביומסה דיגיטלית וקצב צמיחה. במחקר זה נבחרו שלוש זוויות (0°, 120° ו-240°) בתצוגת הצד של RGB כדי לחשב את נפח הצמח ואת קצב הצמיחה היחסי במדויק.

בהתאם לטווח הספקטרלי, תכונות פיזיולוגיות רבות ניתן לחקור באמצעות הדמיה היפרספקטרלית⁵⁴. יש לקבוע איזה ממדדי ההשתקפות מספק את המידע הדרוש ומראה את תגובת הצמחים בתנאים שונים¹⁴. הוא נדרש מאוד בסינון זנים סבילים ופנוטיפ צמחים כדי לקבוע את המתאם בין המדדים ההיפרספקטרליים לבין תכונות פיזיולוגיות אחרות⁵⁵. במחקר זה, צמחים תחת טיפול בכריתת מים הראו תגובה בולטת בתכולת הכלורופיל וביעילות הפוטוסינתטית מהדמיית VNIR. יתר על כן, נצפו תגובות שונות במדד המים שחושב מהדמיית SWIR תחת טיפולי חום וסתימת מים עקב תקנות סטומטליות שונות ותכולת המים בעלים.

לפיכך, ממצאים אלה מדגישים את התועלת של גישה כזו לאחר אופטימיזציה של ההגדרות ואת הפוטנציאל של שימוש בחיישנים מרובים כדי למצוא תכונות לחץ רלוונטיות לסובלנות אקלימית. הערכת הדינמיקה של התגובות באמצעות חיישני הדמיה מרובים יכולה לשמש כאחד הכלים רבי העוצמה בשיפור תוכניות הרבייה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.1” CMOS Sensor with RGB camera	PSI, Drásov, Czech Republic	https://psi.cz/	The sensor delivers a resolution of 4112 × 4168 pixels for side view and 2560 × 1920 pixels for top view. The sensor is extremely sensitive and is a real megapixel CCD replacement and produces sharp, low-noise images
FluorCam	PSI, Drásov, Czech Republic	FC1300/8080-15	Pulse amplitude modulated (PAM) chlorophyll fluorometer
Fluorcam 10 software	PSI, Drásov, Czech Republic	Version 1.0.0.18106	For Chlorophyll fluorescence images visualization and analysis
GigE PSI RGB – 12.36 Megapixels Camera	PSI, Drásov, Czech Republic	https://psi.cz/	For the side view projections, line scan mode was used with a resolution of 4112 px/line, 200 lines per second. The imaged area from the side view was 1205 × 1005 mm (height × width), while the imaged area from the top view position was 800 × 800 mm.
Hyperspectral Analyzer software	PSI, Drásov, Czech Republic	Version 1.0.0.14	For hyperspectral images visualization and analysis
Hyperspectral camera HC-900 Series	PSI, Drásov, Czech Republic	https://hyperspec.org/products/	Visible-near-infrared (VNIR) camera 380-900 nm with a spectral resolution of 0.8 nm FWHM
Hyperspectral camera SWIR1700	PSI, Drásov, Czech Republic	https://hyperspec.org/products/	Short-wavelength infrared camera (SWIR) camera 900 - 1700 nm with a spectral resolution of 2 nm FWHM
InfraTec thermal camera (VarioCam HEAD 820(800))	Flir,  United States	https://www.infratec.eu/thermography/infrared-camera/variocam-hd-head-800/	Resolution of 1024 × 768 pixels, thermal sensitivity of < 20 mK and thermal emissivity value set default to 0.95.  with a scanning speed of 30 Hz and each line consisting of 768 pixels. The imaged area was 1205 × 1005 mm (height × width).
LED panel	PSI, Drásov, Czech Republic	https://led-growing-lights.com/products/	Equipped with 4 × 240 red-orange (618 nm), 120 cool-white LEDs (6500 K) and 240 far-red LEDs (735 nm) distributed equally over an imaging area of 80 × 80 cm
Light, temperature and relative humidity sensors	PSI, Drásov, Czech Republic	https://psi.cz/	Sensors used to monitor controlled conditions in greenhouse
MEGASTOP Blue mats	Friedola	75831	To cover soil surface
Morphoanalyzer software	PSI, Drásov, Czech Republic	Version 1.0.9.8	For RGB images visualization and analysis and color segmentation analysis
PlantScreen Data Analyzer software (Version 3.3.17.0)	PSI, Drásov, Czech Republic	https://plantphenotyping.com/products/plantscreen-modular-system/	To visualize and analyze the data from all imaging sensors,  watering-weighing unit and environmental conditions in greenhouse
PlantScreen Modular system	PSI, Drásov, Czech Republic	https://plantphenotyping.com/products/plantscreen-modular-system/	Type of phenotyping platform
Plantscreen Scheduler software	PSI, Drásov, Czech Republic	Version 2.6.8368.25987	To plan the experiment and set the measuring protocol
SpectraPen MINI	PSI, Drásov, Czech Republic	https://handheld.psi.cz/products/spectrapen-mini/#details	Light meter to adjust light level on a canopy level
TOMI-2 high-resolution camera	PSI, Drásov, Czech Republic	https://fluorcams.psi.cz/products/handy-fluorcam/	Resolution of 1360 × 1024 pixels, frame rate 20 fps and 16-bit depth) with a 7-position filter wheel is mounted on a robotic arm positioned in the middle of the multi-color LED light panel with dimensions of 1326 x 1586 mm.
Walk-in FytoScope growth chamber	PSI, Drásov, Czech Republic	https://growth-chambers.com/products/walk-in-fytoscope-fs-wi/	Type of chambers used to grow the plant