A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
אנו מתארים שיטה לחקור כיצד pH מגיב לרמזים סביבתיים בגליקוזיומים של צורת זרם הדם של טריפנוזומים אפריקאים. גישה זו כוללת חיישן חלבון תורשתי רגיש ל- pH בשילוב עם ציטומטריית זרימה למדידת דינמיקת pH, הן כבדיקת מסלול זמן והן בפורמט מסך בתפוקה גבוהה.
מטבוליזם של גלוקוז הוא קריטי עבור טריפנוזום אפריקאי, Trypanosoma brucei, כתהליך מטבולי חיוני ומווסת של התפתחות טפילים. מעט ידוע על התגובות התאיות שנוצרות כאשר רמות הגלוקוז בסביבה משתנות. הן בטפילים של זרם הדם והן בצורה פרוציקלית (שלב החרקים), גליקוזים מאכלסים את רוב הגליקוליזה. אברונים אלה חומציים במהירות בתגובה למחסור בגלוקוז, מה שככל הנראה גורם לוויסות אלוסטרי של אנזימים גליקוליטיים כגון הקסוקינז. בעבודה קודמת, לוקליזציה של הגשושית הכימית המשמשת לביצוע מדידות pH הייתה מאתגרת, והגבילה את התועלת שלה ביישומים אחרים.
מאמר זה מתאר את התפתחותם והשימוש בטפילים המבטאים pHluorin2 מקומי גליקוסומלי, חלבון תורשתי pH biosensor. pHluorin2 הוא וריאנט pHluorin יחסימטרי המציג ירידה תלוית pH (חומצה) בעירור ב 395 ננומטר ובו זמנית מניב עלייה בעירור ב 475 ננומטר. טפילים טרנסגניים נוצרו על ידי שיבוט מסגרת הקריאה הפתוחה pHluorin2 לתוך וקטור ביטוי טריפנוזום pLEW100v5, המאפשר ביטוי חלבון מושרה בכל אחד משלבי מחזור החיים. Immunofluorescence שימש כדי לאשר את הלוקליזציה הגליקוזומלית של biosensor pHluorin2, השוואת לוקליזציה של biosensor לחלבון תושב glycosomal aldolase. תגובתיות החיישן כוילה ברמות pH שונות על ידי דגירה של תאים בסדרה של מאגרים שנעו ב-pH בין 4 ל-8, גישה בה השתמשנו בעבר כדי לכייל חיישן pH מבוסס פלואורסצאין. לאחר מכן מדדנו פלואורסצנטיות pHluorin2 ב-405 ננומטר וב-488 ננומטר באמצעות ציטומטריית זרימה כדי לקבוע pH גליקזומלי. תיקפנו את הביצועים של הטפילים החיים המבטאים pHluorin2 מהונדס, תוך ניטור pH לאורך זמן בתגובה למחסור בגלוקוז, גורם ידוע להחמצה גליקוזומלית בטפילי PF. לכלי זה יש מגוון יישומים פוטנציאליים, כולל שימוש פוטנציאלי בסינון תרופות בתפוקה גבוהה. מעבר ל-pH גליקזומלי, ניתן להתאים את החיישן לאברונים אחרים או להשתמש בו בטריפנוזומטים אחרים כדי להבין את דינמיקת ה-pH בסביבת התא החי.
קינטופלסטים טפיליים, כמו רוב האורגניזמים החיים, מסתמכים על גלוקוז כמרכיב בסיסי במטבוליזם המרכזי של פחמן. קבוצה זו כוללת אורגניזמים חשובים מבחינה רפואית, כגון טריפנוזום אפריקאי, Trypanosoma brucei; הטריפנוזום האמריקאי, T. cruzi; וטפילים מהסוג לישמניה. מטבוליזם של גלוקוז הוא קריטי לצמיחת הטפילים בשלבי מחזור החיים הפתוגניים. לדוגמה, כאשר נמנע גלוקוז, צורת זרם הדם (BSF) של טריפנוזום אפריקאי מת במהירות. יש לציין כי גליקוליזה משמשת כמקור היחיד ל-ATP בשלב זה של זיהום1. טפילי לישמניה תלויים גם הם בגלוקוז בפונדקאי האנושי, כאשר שלב מחזור החיים של האמסטיגוט השוכן במקרופאגים של הפונדקאי מסתמך על מקור פחמן זה לגדילה
שימוש ב- T. brucei brucei 90-13 BSF trypanosomes, קו טפיל מונומורפי, דורש התחשבות בבטיחות מכיוון שהם נחשבים לאורגניזמים מקבוצת סיכון 2 שיש לטפל בהם במתקני בטיחות ביולוגית ברמה 2.
1. תרבות טריפנוזום וטרנספקציה
pHLuorin2-PTS1 לוקליזציה לגליקוזים ב- BSF T. brucei
כדי להעריך את הלוקליזציה התת-תאית של pHluorin2-PTS1, טפילים היו נתונים לבדיקות immunofluorescence. אות מהטרנסגן שעבר לוקליזציה עם אנטי-סרה שהועלה כנגד חלבון תושב גליקוזיום, אלדולאז (TbAldolase) (איור 2A). מקדם המתאם הממוצע של פירסון בין אנטי-.......
התפיסה הסביבתית ומנגנוני התגובה בטריפנוזום האפריקאי אינם מובנים היטב. ידוע כי שינויים בזמינות החומרים המזינים מעוררים תגובות מגוונות בטפיל, כולל החמצה של גליקוזים. במאמר זה תיארנו שיטה לחקר תגובת pH גליקוזומלית להפרעות סביבתיות בתאים חיים באמצעות חיישן חלבון תורשתי, pHluorin2 וציטומטריית זר.......
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
pHluorin2-PTS1 שוכפל לתוך pLEW100v5 על ידי Twist Bioscience שסיפקה את המבנה בווקטור שיבוט עתיר עותקים; pLEW100v5 היה מתנה מד"ר ג'ורג' קרוס. אנטי-סרום שהועלה נגד T. brucei aldolase זמין מד"ר מרדית ט. מוריס, אוניברסיטת קלמסון, על פי בקשה. העבודה ממעבדות JCM ו- KAC נתמכה חלקית על ידי פרס מהמכונים הלאומיים לבריאות (R01AI156382). SSP נתמך על ידי NIH 3R01AI156382.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile) | VWR | 10861-572 | |
75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile) | Corning | 431464U | |
80 µL flat-bottom 384-well plate | BrandTech | 781620 | |
Amaxa Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
Attune NxT Flow Cytometer | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A24858 | FlowJo software |
BRANDplates 96-Well, flat bottom plate | Millipore Sigma | BR781662 | |
Coloc 2 plugin of ImageJ | https://imagej.net/plugins/coloc-2 | ||
CytKick Max Auto Sampler | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A42973 | |
CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman-Coulter | ||
Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
GraphPad Prism | statistical software | ||
Nigericin (sodium salt) | Cayman Chemical | 11437 | |
Nucleofector 2b | Lonza | Discontinued Product | |
OP2 Liquid Handler | opentrons | OP2 | |
poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O | Sigma Life Science | CAS:25988-63-0 | Pipetting robot for HTS assay |
Thiazole Red (TO-PRO-3) | biotium | #40087 | We machined a custom acrylic plate stand so this brand of plate could be detected and used on our CytKick Max Auto Sampler |
valinomycin | Cayman Chemical | 10009152 | Pipetting robot for HTS assay |
For pH calibration | |||
For pH calibration |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved