מיקרוסקופיה תוך-חיונית דו-פוטונית של גליובלסטומה במודל מורין

Summary

אנו מציגים גישה חדשנית למיקרוסקופ דו-פוטוני של העברת הגידול של ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל עם תווית פלואורסצנטית לגליובלסטומה במודל עכבר.

Abstract

מתן טיפול בסרטן תוך ורידי לגידולי מוח מוגבל על ידי מחסום הדם-מוח. שיטה להדמיה ישירה של הצטברות והפצה של מקרומולקולות בגידולי מוח in vivo תשפר מאוד את יכולתנו להבין ולייעל מתן תרופות במודלים פרה-קליניים. פרוטוקול זה מתאר שיטה למעקב בזמן אמת in vivo של ננו-חלקיקים בעלי תווית פלואורסצנטית תוך ורידית במיקרוסקופ תוך-חיוני של שני פוטונים (2P-IVM) במודל עכברי של גליובלסטומה (GBM).

הפרוטוקול מכיל תיאור רב-שלבי של ההליך, כולל הרדמה ושיכוך כאבים של חיות ניסוי, יצירת חלון גולגולתי, השתלת תאי GBM, הנחת מוט ראש, ביצוע מחקרי 2P-IVM וטיפול לאחר ניתוח למחקרי מעקב ארוכי טווח. אנו מציגים מפגשי הדמיה 2P-IVM מייצגים וניתוח תמונה, בוחנים את היתרונות והחסרונות של טכנולוגיה זו ודנים ביישומים פוטנציאליים.

שיטה זו ניתנת לשינוי והתאמה בקלות לשאלות מחקר שונות בתחום דימות המוח הפרה-קליני in vivo .

Introduction

מיקרוסקופ תוך-ויטלי דו-פוטוני (2P-IVM) היא טכניקת הדמיה פלואורסצנטית המאפשרת הדמיה של רקמה חיה¹.

פותח לראשונה בשנות התשעים, 2P-IVM שימש לניתוח in vivo של הרשתית², כליות³, מעי דק⁴, שבלול⁵, לב⁶, קנה הנשימה^7, והמוח במודלים פרה-קליניים שונים ^8,9. בתחום מדעי המוח, 2P-IVM צברה חשיבות כטכניקה לדימות בזמן אמת של המוח הבריא בחיות ערות¹⁰, כמו גם לחקר מחלות של מערכת העצבים כגון אלצהיימ....

Protocol

נוהל בעלי החיים המתואר בפרוטוקול זה הוא בהתאם לדרישות הפאנל המנהלי לטיפול בחיות מעבדה (APLAC).

1. תרבית תאים

1. הכנת מכסה המנוע
   1. שטפו ידיים, לבשו כפפות ומעיל מעבדה. הפעל את ארון הבטיחות הביולוגי וקבע את מפלס האבנט לגובה פתיחה מתאים. תנו למכסה המנוע להתנקות במשך 3-5 דקות. רססו את אזור מכסה המנוע באתנול 70% ונגבו אותו בנייר טישו.
   2. רססו את כל הריאגנטים באתנול 70% ונגבו בנייר טישו. העבירו את הריאגנטים לתוך מכסה המנוע. אין להניח פריטים על הגריל. אם מתרחשת שפיכה במכסה המנוע, כסו אותו במגבונים, רססו אותו באתנול 70% ונגבו שוב.
   3. לאחר הניסוי, סגרו בזהירות את המכסים של כל פריט, נגבו את כל החומרים, הוצי....

תוצאות

כאן, ביצענו ניתוח חלון גולגולתי והשתלנו תאי C6 במודל עכבר NSG של GBM (n = 5). איטום נכון בין כל הרכיבים המעורבים ביצירת החלון (איור 1A) יבטיח את עמידות החלונות להדמיה ארוכת טווח ובנוסף יפחית את התחלואה. באמצעות השלב שהותאם ל-in vivo 2P-IVM (איור 2), יכולנו לדמיין חיות תח.......

Discussion

אנו מציגים שיטה למעקב בזמן אמת in vivo NP באמצעות 2P-IVM דרך חלון גולגולתי כדי להעריך את העברת הגידול של NPs תחמוצת ברזל עם תווית פלואורסצנטית. הטכניקה הכירורגית להליך זה דורשת יד יציבה ומיומנויות כירורגיות ניסיוניות מתקדמות. מומלץ לתרגל שימוש בפגרים או פנטומים לפני שמתקדמים לחוויה חיה של בע.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride infusion solution	Baxter Corp	533-JB1301P
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Invitrogen	11965-092
1 mL syringes	BD	Luer-Lok syringe, REF309628
10% FBS	Thermo fisher	Cytiva SH30910.03HI
10% DMSO	Sigma-Aldrich	D8418-50ML
2-photon microscope	Prairie Technologies, Bruker	Prairie Ultima IV
Alcohol applicators, 70%	Medline Industries, LP	MDS093810
Alcohol, spray bottle	Decon Labs Inc	Decon SaniHol, 04-355-122
Aluminum foil	Reynold Brands	Reynold Wrap non-stick aluminum foil
Anesthesia machine	Patterson Scientific	SAS3
Anesthesia monitoring	Kent Scientific	MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter
Antibiotic-Antimycotic (100x), liquid	Invitrogen	15240-096
Betadine applicators	Professional Disposables International, Inc	S41125
Biopsy punch, 5 mm	Miltex	Size 5
Buprenorphine sustained release	Zoo Pharm	Bup SR Lab, 1.0 mg/mL	A generic drug can be used instead.
C6 rat glioma cell line	ATCC (American Tissue Culture Collection)	CCL-107
Cannulas	BD	16 G, 1.1/2”, 30 G, 1”
Carprofen	Pfizer	Rimadyl, 50 mg/ml	A generic drug can be used instead.
Cefazoline	Sagent Pharmaceuticals	25021-101-10, 1 g/vial	A generic drug can be used instead.
Cell strainer, 40 µm	Fisher Scientific	87711
Cotton tip applicators, 6”	Dyad Medical Sourcing, LLC	HCS1005
Dental cement	Stoelting Co	51459	Dental cement kit, clear, 2 components
Dexamethasone	Bimeda	138RX, 2 mg/mL	A generic drug can be used instead.
DietGel	ClearH2O	Recovery, 72-06-502
Drape	Cardinal Health	Bio Shield Wrap
Drill	Saeyang Microtech	Escort Pro, B08350
Drill tips	Hager & Meissinger GmbH	REF310104001001005	Size 005, US 1/4
FIJI imaging analysis software	National Institute of Health	https://imagej.net/software/fiji/
Forceps	Fisher Scientific	13-812-41
Gauze	Fisher HealthCare	Sterile Cotton Gauze Pad, 4 x 4”, 22-415-469
Gelfoam	Ethicon Inc.	Surgifoam absorbable gelatin sponge, Ref. 1972
Germinator	Cellpoint Scientific	Germinator 500, No. 11688
Glass coverslips, 5 mm diameter	Fisher Scientific	Menzel Cover glass
Gloves, non-sterile	Fisher Scientific	Nitrile powder-free medical examination gloves
Gloves, sterile	Medline Industries, LP	MDS104070
Hair removal cream	Church & Dwight	Nair Hair remover lotion
Hamilton syringe	Hamilton Company Inc	Gastight #1701, 10 µL
HBSS without Ca, Mg	Fisher Scientific	PI88284
Head bar	Hongway	5 mm inner diameter O-rings
Heating pad	Stoelting Co.	Rodent warmer X2
Insulin syringes	Exel International Medical Products	29G x 1/2″
Iron oxide nanoparticles	Covis Pharma GmbH	Feraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501
Isoflurane	Dechra	26675-46-7
Mice	Jackson Laboratories	NSG, Strain 005557
Microscope (surgery)	Seiler Medical	Seiler IQ Q-100-220
Nanoparticles	Custom		Iron oxide nanoparticles (Ferumoxytol) labeled with fluorescein isothiocyanate
Ophtalmic ointment	Major pharmaceuticals	Lubrifresh P.M. nighttime ointment, 203964
Oxygen	Linde Gas & Equipment Inc.	High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540
Plastic cups	Georgia-Pacirif Consumer Products	Dixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400
Polyethylene tubing	Braintree Scientific	50-195-5494
Scale	Ohaus Corp	CR2200
Scalpel	Integra Life Sciences Production Corp	Integra Miltex Stainless steel disposable scalpel
Scissors	Fisher Scientific	13-804-18
Sealant	Henkel Corp	Loctite 4014
Single use lab gown	High Tech Conversions	17-444-081
Stereotactic frame	Stoelting Co.	Stoelting New Standard TM
Sterile Vacuum Bottle Top Filtration Systems	Fisher Scientific	S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE
Styrofoam box	N/A	N/A
Surgical gloves	Cardinal Health	19-163-108
Surgical glue, 3M Vetbond tissues adhesive	3M Animal Care Prodcuts	1469SB
Tail vein cathether	Custom		Consists of two 30 G cannulas connected with sillicone tubing
TrypLE Express (1x), no phenol red	Invitrogen	12604-039
Ultraviolett torch	Spring sunshine technology	Consciot