מודל כוויות חזירים לחקר תהליך הריפוי בפצעי כוויות עומק מרובים

Summary

פרוטוקול זה מתאר מודל של פצע כוויה רב-עומקי הניתן לשחזור במיני-חזירים מיוקטן.

Abstract

ריפוי פצעי כוויות הוא תהליך מורכב וארוך. למרות הניסיון הרב, מנתחים פלסטיים וצוותים מומחים במרכזי כוויות עדיין מתמודדים עם אתגרים משמעותיים. בין האתגרים הללו, היקף הרקמה הרכה שנשרפה יכול להתפתח בשלב המוקדם, וליצור איזון עדין בין טיפולים שמרניים לבין הסרת רקמות נמקיות. כוויות תרמיות הן הסוג הנפוץ ביותר, ועומק הכוויה משתנה בהתאם למספר פרמטרים, כגון טמפרטורה וזמן חשיפה. עומק הכוויה משתנה גם הוא עם הזמן, וההחמרה המשנית של "אזור הצל" נותרה תופעה לא מובנת. כמענה לאתגרים אלה, נחקרו מספר טיפולים חדשניים, וטיפולים נוספים נמצאים בשלב הפיתוח המוקדם. ננו-חלקיקים בחבישות פצעים מודרניות ובעור מלאכותי הם דוגמאות לטיפולים מודרניים אלה שעדיין נמצאים בהערכה. יחד, הן אבחון כוויות והן טיפול בכוויות זקוקים להתקדמות משמעותית, וצוותי מחקר זקוקים למודל אמין ורלוונטי כדי לבחון כלים וטיפולים חדשים. בקרב מודלים של בעלי חיים, חזירים הם הרלוונטיים ביותר בגלל הדמיון הרב שלהם במבנה העור עם בני אדם. באופן ספציפי יותר, מיני-חזירים יוקטן מראים תכונות מעניינות כגון פיגמנטציה של מלנין וצמיחה איטית, מה שמאפשר לחקור פוטוטיפים גבוהים וריפוי לטווח ארוך. מאמר זה נועד לתאר פרוטוקול אמין וניתן לשחזור לחקר פצעי כוויות רב-עומקיים במיני-חזירים ביוקטן, המאפשר מעקב ארוך טווח ומספק מודל רלוונטי לאבחון ומחקרים טיפוליים.

Introduction

כוויות הן בעיה מרכזית בבריאות הציבור ומשפיעות על יותר מ -480,000 חולים בארה"ב מדי שנה, על פי מאגר הכוויות הלאומי ^1,2. זה מוביל ליותר מ -50,000 אשפוזים בשנה במקרים מורכבים שאינם קטלניים הדורשים טיפול מעמיק². יתר על כן, כוויות הן גורם בסיסי לתמותה ותחלואה צבאית והן אחראיות ל-10% עד 30% מהנפגעים הצבאיים ^3,4. הטיפול בכוויות נותר כמעט ללא שינוי במשך זמן רב, למרות השפעותיה העצומות והמגוונות על החולים, החל מפיזיות ועד פסיכולוגיות ורגשיות⁵.

אבחון ראשוני והערכה של פגיעות כוויות מובילים לסיווג בסיסי לפי סוג הכוויות (ראשונה, שנייה ושלישית) או עומק הרקמה הפגועה (שטחית, עובי חלקי וכוויות עמוקות)^6,7,8. כוויות בעובי חלקי (דרגה ראשונה ושנייה) מערבות את האפידרמיס ובעומקים שונים של הדרמיס (דרמיס שטחי או עמוק, כלומר כוויות שטחיות ועמוקות מדרגה שנייה)⁹. בפרט, נזק לנספח בדרמיס העמוק שולל את האפשרות של אפיתל מחדש מהאפיתל האדנקסלי¹⁰. בהגדרה, כוויות בעובי מלא מגיעות לשומן התת עורי, הפאשיה ו/או לשריר הבסיסי (כוויות מדרגה שלישית), ולעיתים לעצם (המכונה גם כוויות מדרגה רביעית)^11,12.

לאחר האשפוז, חולי כוויות מקבלים טיפול מיוחד הכולל אסטרטגיה המורכבת מאיזון עדין בין הטריה לשימור רקמות. יש להסיר בהדרגה את הרקמה הרכה הפגועה ו/או הנגועה משנית עד לחשיפת רקמה בריאה, מה שמאפשר שימוש בחבישות ושתלי עור ספציפיים לשיפור תהליך הריפוי 13,14,15,16. עם זאת, נדרשת זהירות במהלך הניתוח כדי למנוע הסרה לא מכוונת של רקמת ריפוי ולהפחית סיבוכים להחלמה אופטימלית. מבחינה ביולוגית, כוויות מציגות אזור נמק מרכזי המוקף באזור "צל" או "קיפאון", דבר המצביע על איסכמיה הפיכה. אזור זה יכול להידרדר, וכתוצאה מכך אזור נמק מורחב, או לרפא על ידי היפוך התהליך אפופטוטי^17,18. חומרת כוויות משתנה זו מציבה אתגרים למנתחים להעריך במדויק, ומסבכת את האיזון בין טיפולים שמרניים לבין כריתה כירורגית¹⁹. נכון להיום, אין כלי יעיל זמין שיעזור לאפיין את "אזור הצל" הזה לפני המרת הצריבה. פיתוח כלים כאלה הוא חיוני למיטוב האיזון העדין הזה.

מספר טיפולים נבדקו כדי לסייע בהפחתת המרת כוויות משנית. עם זאת, אין כיום טיפול ספציפי זמין במרפאה¹⁸. דוגמאות נוספות להתקדמות בטיפול בכוויות כוללות פיתוח תחבושות פצעים מודרניות וננו-חומרים^20,21, עור מהונדס רקמות^22,23 וגישות תרבית אפידרמיס חדשניות^24,25. כמו כן, ניתוחי שחזור מודרניים ודשים פאשיוקוטניים שיפרו את ניהול תופעות הלוואי ארוכות הטווח, במיוחד התכווצויות כוויות לאחר ריפוי פתולוגי של אזורי קיפול^26,27. התקדמות זו מעניקה סיכויים מבטיחים לחולי כוויות, ומשפרת את אסטרטגיות הטיפול שלהם ואת איכות חייהם, אך התוצאות האחרונות מראות כי ההשפעה התפקודית עדיין ניכרת, הן בתחום הפיזי והן בתחום הפסיכולוגי²⁸. יחד, הדרישה לפיתוחים חדשניים הן באבחון כוויות והן בטיפול בכוויות היא משמעותית.

ככלל, גישות רבות מכוונות לשיפור האבחון, הניהול והטיפול במקרי כוויות מורכבים, והחוקרים זקוקים למודל רלוונטי וניתן לשחזור כדי לבחון גישות חדשות אלה. בשל מורכבותו הביולוגית, המערבת מספר איברים ותגובות מערכתיות, אף מודל במבחנה לא הוכיח את עצמו כרלוונטי לחקר תהליך פצע הכוויה²⁹. מודלים של מכרסמים הראו פערים גדולים עם בני אדם בשל הבדלים גדולים בביולוגיה, ארכיטקטורת העור, גמישות וחוסר היצמדות למבנים הבסיסיים²⁹. לעומת זאת, מודל החזירים הוכח כרלוונטי בשל הדמיון המבני בין עור החזיר^{לעור האדם} 30,31,32. הוא מציג כלי דם דומים, הרכב סיבים אלסטיים, ותזמון חידוש. יתר על כן, זקיק השערה ונספחים אפוקריניים מאפשרים אפיתל מחדש אי, כפי שניתן לראות בכוויות שטחיות קליניות^33,34. באופן ספציפי יותר, מודלים מיני-חזירים של יוקטן מספקים תכונות מעניינות, מה שהופך אותם לרלוונטיים לחקר עור פיגמנטי³⁵ ותוצאות ארוכות טווח עם שינויים פיזיים מינימליים³⁶.

מטרת מאמר זה היא לתאר מודל כוויות רב-דרגתי אמין בחזירי יוקטן, המאפשר לחקור מספר כוויות מדרגה שנייה ושלישית באותו נושא. זה מספק מודל רלוונטי וניתן לשחזור לחקר חידושים אבחוניים וטיפוליים לניהול כוויות. יתר על כן, מודל זה כולל סוגים שונים של כוויות וחומרתן, מעקב ארוך טווח המאפשר לחקור את התכווצות הכוויה וריפוי פתולוגי, והתנהגות דיפרנציאלית של עור פיגמנט, אשר ידוע שיש לו מאפיינים ספציפיים.

Protocol

כל העבודה בבעלי חיים בוצעה בהתאם לרשימת התיוג ARRIVE (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments)³⁷ והייתה תואמת לוועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית של בית החולים הכללי של מסצ'וסטס (IACUC) תחת פרוטוקול #2021N000271. טיפול אנושי ניתן לבעלי החיים, בעקבות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה³⁸. חמישה מיני-חזירים יוקטנים במשקל 30 ק"ג שימשו לניסויים אלה. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).

1. טיפול טרום ניתוחי והרדמה

1. צום החיות במשך 12 שעות לפני הרדמה כללית.
2. יש להתחיל בהרדמה על ידי הזרקה תוך שרירית של 2-4 מ"ג/ק"ג של טילטמין הידרוכלוריד וזולאזפאם הידרוכלוריד ו-1-2 מ"ג/ק"ג קסילזין, ולאחר מכן שאיפת איזופלורן (2-3% בחמצן) (ראה טבלת חומרים) לשמירה על הרדמה במהלך ההליך.

2. עיצוב פצע כוויה ואקראיות

1. על מנת לחקור כוויות בעובי חלקי ומלא עם בקרה שלילית על אותו בעל חיים (ללא שונות בין אינדיבידואלית), ליצור שמונה פצעים על גבי כל חזיר באזור paravertebral. בצעו שלושה פצעים בעובי מלא, שלושה פצעים בעובי חלקי ושני פצעי בקרה.
2. מספר את הפצעים מ-1 עד 8, ובצע אקראיות כדי להקצות דרגות כוויה שונות (עובי חלקי, עובי מלא, בקרה) למיקומים אנטומיים שונים בגב.
   הערה: אקראיות של כל פצע (עומק ומיקום) מבוצעת כדי לשפר את המשמעות: דרמיס חזיר ידוע להשתנות מבחינת עובי והרכב קולגן³⁹. לכן, אקראיות על כל חיה משמשת כדי להפחית הטיות פוטנציאליות.

3. תיחום פצע קעקוע

הערה: ההליך הראשון מורכב מיצירת קעקועים עגולים על גבי החזיר כדי למקם ולספור את הפצעים האקראיים (איור 1). זה מבוצע יומיים לפני הליך הכוויה הראשוני כדי לאפשר התאקלמות טובה יותר, אך ניתן לבצע אותו ביום הליך הכוויה.

1. לאחר הרדמה (ראה שלב 1) ואינטובציה אורוטרכאלית במצב שכיבה⁴⁰, מניחים את החזיר במצב נוטה, ומניחים טריזים רכים (סדינים) מתחת לחיה לנוחותו וייצובו (מתחת לגפיים הקדמיות, אזור הטבור והגפיים האחוריות)⁴¹. הניחו שמיכה לחימום אוויר מאולץ על ראשו וצווארו של בעל החיים כדי לשמור על טמפרטורת גוף נאותה.
2. הניחו קו ישר במרכז גב החזיר כדי לאפשר סימטריה של הציורים.
3. ציירו שני קווים אנכיים באמצעות עט דרמוגרפי (ראו טבלת חומרים) משני צידי הקו המרכזי, הממוקמים 6.5 ס"מ לרוחב ממנו. שני הקווים הרוחביים ישמשו למיקום מרכז המעגלים.
4. ציירו כל זוג עיגולים בקוטר 4.5 ס"מ באופן סימטרי, תוך שמירה על מרחק מינימלי של 4 ס"מ בין שני עיגולים נפרדים (איור 1A).
5. לאחר ביצוע השרטוטים, בצע הכנת עור בצעד אחד (פובידון-יוד 7.5%) כדי להפחית את פלורת חיידקי העור.
6. בצע את הליך הקעקוע⁴² מתוך שמונה עיגולים בקוטר 4.5 ס"מ באמצעות מכונת קעקוע מחט, דיו שחור סטרילי ומחט מעוקרת בעלת 5 נקודות (ראה טבלת חומרים). התוצאה הסופית מוצגת באיור 1B.
7. במקרה של עיכוב בהליך יצירת הכוויה, יש למרוח משחה אנטיביוטית משולשת על הקעקועים ולכסות אותה בחבישות דבק שקופות.

4. יצירת פצע כוויה וחבישת פצע מתקדמת

הערה: כוויות ייווצרו על ידי הנחת בלוק הפליז במגע עם העור על הנקודה הייעודית (אקראיות) למשך 30 שניות (בלתי משתנה). הטמפרטורה תקבע את עומק הכוויה.

1. ביום הליך הכוויה, לאחר שהחיה מורדמת ומונחת במצב נוטה כפי שנדון בשלב 1, הניחו קוביות פליז גליליות במיכלי נירוסטה מלאים בחרוזי אלומיניום (ראו טבלת חומרים). הניחו את המיכלים על פלטה חמה מבוקרת טמפרטורה. כוונו פלטה חמה אחת ל-65°C (עבור כוויות בעובי חלקי), ואת השנייה ל-93°C (עבור כוויות בעובי מלא, איור 2).
   הערה: ניתן לשמור את המיכל יבש כדי למנוע כוויות צורבות (דרושות 2-3 שעות כדי להגיע לשיווי משקל הטמפרטורה) או מלא למחצה במים (30 דקות כדי להגיע לשיווי משקל הטמפרטורה). אם משתמשים במים, יש לייבש היטב את קוביות הפליז לפני שלב 4.5 על מנת למנוע כוויות נוספות עקב צריבה.
2. הכנס מדחום לתוך גליל הפליז דרך הפתח המרכזי שלו כדי לפקח על טמפרטורת הליבה שלו, ולאשר את טמפרטורת פני השטח עם אקדח טמפרטורה. במידת הצורך, העלו את טמפרטורת הפלטה החמה ל-65°C או 93°C בגליל למרות פיזור חום קל.
   הערה: ניתן להשתמש ברדיד אלומיניום כדי לכסות את המיכל ולמזער עוד יותר את פיזור החום, ולהגיע לטמפרטורה הרצויה מהר יותר.
3. במקביל, מקם את בעל החיים במצב נוטה להליך הצריבה, בדומה להליך הקעקוע (שלב 3.1).
4. ברגע שהחיה מוכנה במצב נוטה, להכין את העור בשלושה שלבים (פובידון-יוד 7.5%, תמיסת מלח 0.9%, ייבוש).
5. אחזו בבלוק הפליז בכפפות עמידות בחום והניחו אותו על נקודת הקעקוע הייעודית, בהתאם לאקראיות. הפעל את הטיימר ברגע שגוש הפליז נוגע בעור. היזהרו לא להפעיל לחץ רב יותר על העור מאשר משקלו של גוש הפליז עצמו.
6. לאחר 30 שניות, הסירו את בלוק הפליז מהעור והחזירו אותו למיכל החימום הייעודי שלו. עקוב אחר הטמפרטורה עד שהיא מגיעה למטרה, וחזור על ההליך עבור כל הפצעים.
7. בצעו חבישה רב-שכבתית מתקדמת כדי להבטיח יציבות חבישה לאחר שבעל החיים החלים.
   1. הניחו גזה ספוגה בנפט על כל מקום כוויה, כולל בקרות, וכסו אותה בגזה יבשה לא ארוגה וברוטב דבק גדול ושקוף.
   2. יש לרסס תמיסה של תמיסת בנזואין על העור שמסביב להיצמדות טובה יותר של התחבושות השקופות לעור.
   3. לעטוף את החיה ברוטב עטיפת דבק עצמית תוך שימת לב לא להדק אותו יתר על המידה (הגבלת נפחים ריאתיים).
   4. השלימו את ההלבשה על ידי הוספת שכבה סופית של גרגיר צינורי (גודל מותאם לחיה) (ראו טבלת חומרים). לחלופין, ניתן להשתמש במעילי חזירים מותאמים אישית אם בעל החיים אינו מסוגל לשמור על ההלבשה נקייה למשך כל המחקר
   5. להבטיח שיכוך כאבים נכון על ידי הנחת מדבקת אופיואיד טרנסדרמלי (פנטניל) על צוואר החיה לאחר הזרקת מנה אחת של buprenorphine (0.05-0.1 מ"ג / ק"ג, IM) ומנה אחת של carprofen (2-4 מ"ג / ק"ג, IM).
   6. לאחר כל הרדמה, יש לעקוב מקרוב אחר בעלי החיים עד שעתיים לאחר ההתאוששות. השתמשו בכרית חמה במידת הצורך, וספקו מזון באופן חופשי לאחר עמידה מלאה.

5. עובי מלא לשרוף escharotomy

הערה: בין יום לשלושה ימים לאחר הניתוח, בעלי החיים יקבלו כריתה כירורגית בעובי מלא של האשכר לאחר כוויות מדרגה שלישית.

1. לאחר הכנה דומה של בעל החיים כולל הרדמה, אינטובציה, והנחת בעל החיים במצב שכיבה, להכין את העור באמצעות הכנת העור בשלושה שלבים, לבצע גרירה סטרילית של גב החיה.
2. בצע ביופסיות ניקוב 4 מ"מ (ראה טבלת חומרים) על הפצע כדי לאשר את סוג הפציעה.
3. בצע את escharotomy^43,44 על ידי חתך עגול של eschar עם להב אזמל סטרילי (n°15) עד הגעה הדרמיס העמוק.
4. אחזו היטב בצד אחד של האשכר בעזרת זוג מלקחיים סטריליים של רקמת אדסון (עם 2/1 שיניים) (ראו טבלת חומרים) ותפסו אותו כלפי מעלה כדי לחשוף את הגבול העמוק של האשכר.
5. המשך את האסכרוטומיה באמצעות להב האזמל תוך שהייה באותו מישור בתוך הדרמיס העמוק / הפאשיה הבסיסית. דרמיס מדמם נחשב סימן לכדאיות רקמות.
   1. אם חותכים עורק במהלך התהליך, יש לבצע צריבה מינימלית באמצעות מלקחיים קרישה דו קוטבית (ראה טבלת חומרים). זהירות: צריבה נרחבת של מיטת הפצע שנוצרה עלולה לגרום לריפוי מאוחר ויש להימנע ממנה לחלוטין.
6. שים סט ראשון של guaze יבש על מיטת הפצע במשך 5 דקות כדי לשפר hemostasis המקומי לפני הנחת ההלבשה הסופית.
7. הלבישו את הפצעים באופן דומה לקודם (שלב 4.7), בתוספת של כמה גזה יבשה כדי למלא את החלל. יש למרוח את אותן שכבות שהוזכרו קודם לכן: תרסיס בנזואין תמיסה, הלבשה שקופה דביקה, עטיפה בהדבקה עצמית, גרגיר צינורי.
8. לספק שיכוך כאבים על ידי שינוי המדבקה הטרנסדרמלית אופיואידים והזרקת קפרופן (2-4 מ"ג / ק"ג, IM).

6. חבישות פצע מעקב

הערה: תחבושות עוקבות מבוצעות כל 2 עד 7 ימים, בהתאם לתכנון הטיפול הניסיוני ואת הסבילות של החיה. תחבושות פצע ניתן להפסיק לאחר 21 ימים כדי לאפשר epithelialization מחדש בסביבה יבשה ולשפר את הסבילות של החיה. לחלופין, אם קבוצת הטיפול זקוקה לסביבה לחה או רטובה, ניתן להאריך את החבישות עד סוף המחקר. תקופת המעקב הוארכה עד 10 שבועות על מנת ללמוד הן את תהליכי הריפוי החריפים והן את תהליכי הריפוי הממושכים.

1. מרדימים את בעל החיים לתקופה קצרה ומניחים במצב שכיבה עם חרוט אף (איזופלורן 2-5 ליטר/דקה).
2. יש להסיר את התחבושות הקודמות ולנקות את הפצעים באמצעות 0.9% מלוחים סטריליים וגזה סטרילית.
3. החל את הטיפול הניסיוני אם רלוונטי.
4. באופן דומה, בצע ביופסיות עוקבות במהלך הליך זה במידת הצורך על ידי המחקר. לאחר מכן בעל החיים צריך לקבל תרופות כאב כגון carprofen (2-4 מ"ג / ק"ג, IM, 24 שעות אפקט).
5. יש לכסות את כל מקומות הפצעים, כולל פצעי בקרה, בגזה ספוגה בנפט או שווה ערך, גזה יבשה, לא ארוגה וחבישה שקופה דביקה.

תוצאות

איור 2A,B מציג את התוצאות של כוויות מרובות על גבי הגב של מיני-חזיר מיוקטן. פצעים (I) ו-(VII) הם פצעי בקרה (37°C). פצעים מדרגה שנייה (II; III ו- VIII) נוכחים באדמומיות עזה ובשלפוחיות. לעומת זאת, פצעים מדרגה שלישית (IV; V; ו-VI) הם חיוורים ונוטים למישוש. יש לציין כי פצע VI...

Discussion

ריפוי פצעים לאחר פציעות כוויות הוא תהליך ארוך שיכול להימשך עד מספר חודשים, עם אפשרויות טיפול שונות ושיקולים לטיפול בחולה ^2,13. כדי ללמוד אותו, יש צורך במודל אמין וניתן לשחזור. תוארו מספר דגמים של בעלי חיים, בעיקר מכרסמים 29,45,46 וחזירים

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adson tissue forceps	Jarit	130-234
Aluminum beads	Lab Armor	42370-002	Lab Armor Beads
Buprenorphine hydrochloride	Ranbaxy Pharmaceuticals	NDC:12469-0757-01	Buprenex Injectable
Carprofen	Pfizer	NADA 141-199	Rymadyl 50mg/ml injectable
Cylindric brass block	Hand-made	N/A	Engineering drawing included in the manuscript
Dermographic pen	McKesson	Surgical Skin Marker Sterile
Disposable #15 surgical scalpels	Medline	MDS15315	Scalpel blades
Fentanyl patch	Mylan	NDC:60505-7082	Fentanyl Transdermal System
Isoflurane	Piramal	NDC:66794-013-25	Isoflurane, USP
McPherson Bipolar coagulation forceps	Bovie	A842	Reusable, autoclavable
Miltex assorted biopsy punches (3,4 and 5 mm)	Integra	33-38	Biopsy punches- size to adapt to the study
Non woven gauze	Starryshine	GZNW22	2 x 2" non woven 4 ply medical gauze pads
Povidone-Iodine	Betadine	NDC:0034-9200-88	Surgical scrub 7.5%
Sterile isotonic sodium chloride solution 0.9%	Aqualite System	RL-2095	Sterile saline solution
Tattoo ink	Spaulding & Rogers	Black - 2 oz - #9053
Tattoo marker	Spaulding & Rogers	Special Electric Tattoo Marker
Tattoo needle	Spaulding & Rogers	1310251	Tattoo 5 point needle
Tegaderm Transparent Film Dressing	3M	1.628	Large transparent adhesive dressing
Temperature-controlled hot plate	Cole-Parmer	03407-11	StableTemp hot plate stirrer
Thermometer	American Scientific	U14295	Tube mercury thermometerr
Tiletamine and zolazepam hydrochloride	Zoetis	NDC:54771-9050	Telazol
Tincture of Benzoin Spray	Smith&Nephew	407000	Adhesive layer spray
Triple Antibiotic ointment	Fougera	NDC 0168-0012-31	Triple antibiotic ointment
Tubular stockinette	Medline	NONNET02	Curad Medline Latex Free Elastic Nets
Warming blanket	3M	Bair Hugger 750 warming unit
Xeroform Occlusive Gauze Strip	Covidien	8884433301	Xeroform petrolatum wound dressings
Xylazine	Vetone	NDC:13985-704-10	AnaSed LA
Yucatàn minipigs (female, 30 kg)	Sinclair Bio Resources	N/A	Full pigmentation