JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מחקר זה בוחן את הקשר בין ביטוי הגן MLH1 בדם היקפי ובסרטן המעי הגס, תוך שימוש בגישת מקרה-ביקורת כדי להשוות את רמות הביטוי בחולים ולהתאים בקרות בריאות.

Abstract

הומולוג MutL 1 (MLH1) הוא מרכיב של הקומפלקס ההטרודימרי MutLα המזהה ומתקן אי התאמות בסיס ולולאות הכנסה/מחיקה הנגרמות על ידי שילוב שגוי של נוקלאוטידים. בהיעדר חלבון MLH1, תדירות אי ההתאמות הלא מתוקנות עולה, וכתוצאה מכך סרטן איברים. המחקר הנוכחי ביקש לכמת את ביטוי הגן MLH1 ואת הקשר שלו עם פלישת הגידול (T) ופלישת בלוטות הלימפה (N) בדגימות דם של חולים עם סרטן המעי הגס (CRC). דגימות דם נלקחו מ-36 חולי CRC. RNA חולץ, ו-cDNA סונתז באמצעות ערכה. הפריימרים נבנו בגישת צומת אקסון-אקסון, והגנים MLH1 ו-β-actin נבדקו פי 3 באמצעות תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (Real-Time PCR). תוכנת ניתוח ביטוי גנים שימשה לניתוח הנתונים, ומבחן t שימש לבחינת הביטוי של MLH1 והקשר שלו למשתני T ו-N. במחקר זה נכללו 36 חולים עם סרטן המעי הגס, כולל 15 (41.6%) נשים ו-21 (58.4%) גברים, עם גיל ממוצע של 57.35 ±-4.22 שנים ובטווח הגילאים של 26-87 שנים. התוצאות הראו כי היחס בין ביטוי הגן MLH1 בחולים ירד בהשוואה לזה של אנשים בריאים, והירידה בביטוי הגנים בשלבים שונים של המחלה הייתה משמעותית. תוצאות מחקר זה הראו כי להפחתת ביטוי הגן MLH1 יש תפקיד יעיל בהתפתחות CRC.

Introduction

סרטן המעי הגס (CRC) הוא אחד מסוגי הסרטן הנפוצים ביותר. זהו הגורם הרביעי המוביל למוות הקשור לסרטן ברחבי העולם1. CRC שכיח יותר אצל גברים מאשר אצל נשים, והוא נפוץ פי שלושה עד ארבעה במדינות מתועשות מאשר במדינות מתפתחות. שיעור ההיארעות המתוקנן לגיל (גלובלי) לכל 1 x 105 ממקרי CRC הוא 19.7 בשני המינים, 23.6 בגברים ו-16.3 בנשים2. מחקרים אפידמיולוגיים הראו קשרים סביבתיים ואורח חיים חזקים עם CRC. השמנת יתר, בשר אדום/מעובד, טבק, אלכוהול, טיפול במניעת אנדרוגנים וכריתת כיס המרה קשורים כולם לעלייה מתונה בסיכון ל-CRC 2,3.

חוסר יציבות כרומוזומלית, חוסר יציבות מיקרו-לוויין ופנוטיפ מתילטור של אי CpG (CIMP) ממלאים תפקיד חשוב בגידול של CRC4. על פי מחקרים קודמים, זוהו כ-250 מוטציות שונות בחולים עם CRC, שווה ערך לכ-55% מהמוטציות הידועות הקשורות לגנים לתיקון אי התאמה של DNA (MMR). פגמים בחלבוני תיקון אי התאמה יכולים להיגרם על ידי מוטציות בקו הנבט בגנים MSH6, MLH1, PMS2 ו-MSH2, ורוב המוטציות הללו נמצאות בגנים MLH1 ו-MSH2 4,5. החלבון החשוב ביותר במערכת ה-MMR, המעורב בדרך כלל ב-CRC, הוא MLH1. מחקרים אחרונים הראו כי כל שינוי בביטוי MLH1 עלול להגביר את הסיכון ל-CRC. מוטציות בקו הנבט ב-MLH1 אחראיות לתסמונת לינץ', סוג תורשתי של CRC. בנוסף, 13%-15% ממקרי סרטן המעי הגס המפושט נגרמים על ידי מחסור ב-MLH1 על בסיס היפרמתילציה של מקדם סומטי 6,7,8.

גן MLH1 ממוקם על הזרוע הקצרה של כרומוזום 3 במיקום 22.2 ומכיל 21 אקסונים9. החלבון המקודד על ידי הגן MLH1 יכול לשתף פעולה עם אנדונוקלאז המעורב בתיקון אי התאמה, PMS2, כדי ליצור MutLα, שהוא חלק ממערכת ה-MMR. MutLα מעורב בעיקר בתיקון אי התאמות בסיס-בסיס ולולאות מחיקה וחיבור כתוצאה משכפול DNA לא שלם. בנוסף, החלבון המקודד מעורב באיתות נזק ל-DNA וניתן להמיר אותו לצורת ɣMutL עם חלבון MLH3, המעורב בתיקון אי התאמה של DNA שנצפה במיוזה 10,11,12. מחקרים הראו כי MLH1 מעורב בפעילויות תאיות עיקריות אחרות, כולל ויסות נקודות ביקורת של מחזור התא, אפופטוזיס, רקומבינציה מוצלבת ואי התאמה מיטוטית13.

הגן MLH1 ממלא תפקיד מפתח במערכת תיקון אי התאמה של DNA (MMR). פגם בתפקוד גן זה יכול להוביל להצטברות מוטציות גנטיות וכתוצאה מכך להתפתחות סרטן המעי הגס14. מחקרים קודמים הראו כי כ-55% מהמוטציות הקשורות לגנים MMR בחולים עם CRC קשורות למוטציות בגן MLH1. בנוסף, ירידה בביטוי הגן MLH1 עלולה להוביל לתסמונת לינץ', שהיא צורה תורשתית של סרטן המעי הגס15,16. כמו כן, פגם בגן MLH1 המבוסס על היפרמתילציה של מקדם סומטי נצפה ב-13%-15% ממקרי סרטן המעי הגס הספורדיים17. ראיות מדעיות אלו מראות כי הגן MLH1 פועל כסמן ביולוגי חשוב בסרטן המעי הגס, וניתוח הביטוי שלו יכול לספק מידע רב ערך על תפקוד מסלול ה-MMR והסיכון הגנטי ל-CRC18. מדידת רמות ביטוי MLH1 בדם ההיקפי של חולים עם סרטן המעי הגס יכולה לספק מידע רב ערך על הפונקציונליות של מסלול ה-MMR, שלעתים קרובות מופרע בסרטן המעי הגס. ניתן להשתמש בשיטה זו למטרות פרוגנוסטיות ולהבנת הרגישות הגנטית לסרטן המעי הגס19,20. מחקר על הקשר בין מוטציה MLH1 415 לוקוס G ל-C וסרטן המעי הגס הספורדי בחולים סיניים מצא כי שכיחות הגנוטיפ MLH1 C/C הייתה גבוהה משמעותית בחולי CRC ספורדיים מאשר בביקורת, מה שמצביע על רגישות גנטית ל-CRC ספורדי בחולים סינים21. מחקר אחר השווה את ביטוי הגנים של סמנים ביולוגיים גנטיים של CRC בדגימות דם היקפיות וביופסיה של חולי מחלות מעי דלקתיות (IBD), והדגיש את הפוטנציאל של ניתוח ביטוי גנים בדם היקפי להבנת סמנים ביולוגיים הקשורים לסרטן המעיהגס 22.

בהתחשב בתפקיד החשוב של הגן MLH1 ומחקרים שנערכו בעשורים האחרונים עם ניתוח מולקולרי על ידי פרופיל ביטוי mRNA, סרטן סווג בדיוק גבוה יותר. מטרת מחקר זה הייתה לחקור כמותית את ביטוי MLH1 בדגימות דם היקפיות של חולי CRC באמצעות PCR בזמן אמת, ולחקור את הקשר שלו עם גורמים פתולוגיים, שלבי התקדמות הגידול לשכבות דופן המעי (T) ושלבי הפלישה לבלוטות הלימפה (N). מחקר זה בוצע ב-36 חולי CRC כדי לבסס שינויים כמותיים בביטוי גנים כסמנים ביולוגיים לבדיקת CRC, פרוגנוזה ואבחון באמצעות דגימות דם היקפיות.

Protocol

מחקר מקרה-ביקורת נערך בבית החולים המסונף 2 של אוניברסיטת ננטונג בין אפריל 2021 למאי 2023. צור קשר עם המחלקה האדמיניסטרטיבית של בית החולים כדי להקים את מסגרת המחקר. אישור אתי הושג על ידי הגשת הצעת המחקר לוועדת האתיקה של אוניברסיטת ננטונג. ההנחיות האתיות בוצעו כדי להבטיח סודיות והסכמה מדעת.

1. גיוס מטופלים ועיצוב מחקר

  1. דגימה להכללת משתתפים במחקר
    1. לחקור את ביטוי הגן MLH1 בדם ההיקפי של 36 אנשים עם סרטן המעי הגס וקבוצת ביקורת. לפתח קריטריונים ברורים להכללה ואי-הכללה לבחירת המשתתפים.
    2. לגייס אנשים שאובחנו עם סוגים ספציפיים של סרטן המעי הגס (סרטן המעי הגס, סרטן המעי הגס, סרטן עולה, רוחבי ויורד שנחשבו כבעלי גידולים במעי הגס) ויש להם הסכמה מדעת.
    3. אל תכלול אנשים עם אבחנות סרטן אחרות או מצבים שעלולים לבלבל את ניתוח ביטוי הגנים. בנוסף, אל תכלול משתתפים עם היסטוריה של עירוי דם בשלושת החודשים האחרונים, היסטוריה של כימותרפיה או הקרנות בששת החודשים האחרונים, היסטוריה של שימוש באלכוהול או בסמים, והיסטוריה של מחלות אוטואימוניות או מחלות מעי דלקתיות.
  2. לסווג גורמי סיכון קליניים לפי מערכת השלבים של TNM (גידול, צמתים וגרורות), בהתחשב במסת הסרטן, גודל הגידול ופלישה לאיברים סמוכים23,24.
    1. חלקו שלבי סרטן שונים (0-4) על סמך נתוני קובץ פתולוגיה זמינים.
    2. פלח את קצב צמיחת הגידול והתקדמותו בשכבות דופן המעי (אינדקס T) לארבע קבוצות נפרדות (T1-4, T0-TX) ופלישת בלוטות הלימפה (אינדקס N) לארבע קבוצות (N1-3, N0-NX).
  3. הכינו קבוצת ביקורת עם אנשים בריאים.
    1. התאימו את קבוצת הביקורת לקבוצת המטופלים מבחינת גיל ומין. אסוף נתונים דמוגרפיים מפורטים עבור כל משתתף כדי להבטיח השוואה.
  4. תהליך הסכמה מדעת
    1. הכינו מסמכי הסכמה מדעת המסבירים את מטרת המחקר, הנהלים והסיכונים הפוטנציאליים.
    2. צור קשר עם המשתתפים, וספק להם מספיק זמן לשאול שאלות. אסוף טפסי הסכמה מדעת חתומים לפני שתמשיך באיסוף הדגימות.

2. מיצוי וטיהור RNA

  1. איסוף דגימות דם היקפיות
    1. השג צינורות מצופים EDTA זמינים מסחרית המאושרים לשימוש קליני או מעבדתי. ודא את תאריך התפוגה של הצינורות. בדוק את תקינות אריזת הצינור.
    2. הנחו את המשתתף לשבת בנוחות. בעזרת מזרק סטרילי, שאבו 5 מ"ל דם מהווריד הקדמי. ודא שהמשתתף רגוע, כשהזרוע מושטת כדי לחשוף את הווריד. העבירו מיד את דגימות הדם לצינורות המוכנים, והבטיחו חשיפה מינימלית לאוויר.
    3. שמור על הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך ההובלה למעבדה כדי לשמור על שלמות ה-RNA.
  2. השתמש בערכת מיני דם RNA לבידוד RNA בהתאם להוראות היצרן.
    1. בקצרה, ליזה של כדוריות דם אדומות על ידי דגירה של כל דגימת הדם עם Buffer EL על קרח. צנטריפוגה כדי לגלול את הלויקוציטים ולהשליך את הסופרנטנט. ליז את הלויקוציטים עם Buffer RLT והומוגניזציה של הליזאט באמצעות עמודת מגרסה.
    2. הוסף אתנול לליזאט ההומוגני והעביר לעמוד ספין. שטפו את העמודה עם Buffer RW1 ו-Buffer RPE. לחסל את ה-RNA המטוהר על ידי הוספת מים נטולי RNase לעמוד וצנטריפוגה.
  3. הערכת כמות ואיכות ה-RNA
    1. כימות RNA: השתמש בספקטרופוטומטר כדי למדוד את ריכוז ה-RNA והטוהר. פתח את התוכנה במחשב המחובר. בחר באפשרות חומצת גרעין מהתפריט הראשי. מרחו 1 מיקרוליטר של דגימת RNA על אזור הדגימה.
    2. בדיקת טוהר ושלמות ה-RNA
      הערה: ניתן לבדוק את השלמות והתפלגות הגודל של סך ה-RNA המטוהר עם ערכת המיני של דם RNA על ידי ספקטרופוטומטריה ואלקטרופורזה של ג'ל. RNA ריבוזומלי צריך להופיע כרצועות חדות או פסגות. היחס לכאורה בין 28S rRNA ל-18S rRNA צריך להיות בערך 2:1. אם הרצועות הריבוזומליות או הפסגות של דגימה ספציפית אינן חדות אלא מופיעות כמריחה לעבר RNA בגודל קטן יותר; סביר להניח שהדגימה סבלה מפירוק משמעותי לפני או במהלך טיהור ה-RNA.
      1. למדידת ספקטרופוטומטריה, הורד את זרוע המכשיר ולחץ על מדידה כדי לקבל את יחס A260/A280. הערך את טוהר דגימת ה-RNA, במטרה להגיע ליחס A260/A280 בין 1.8 ל-2.0.
      2. בצע אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז 1% כמתואר להלן.
        1. הכן את תמיסת האגרוז 1% על ידי חימום אבקת אגרוז במאגר TAE עד להמסה. הוסף אתידיום ברומיד לתמיסת האגרוז כדי להשיג ריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם/מ"ל. יוצקים את תמיסת האגרוז-אתידיום ברומיד למגש יציקת ג'ל ומאפשרים לו להתמצק.
          הערה: אתידיום ברומיד הוא צבע פלואורסצנטי המשתלב עם RNA כדי לאפשר הדמיה באור UV.
        2. מערבבים את דגימות ה- RNA עם צבע טעינה וטוענים אותן בזהירות לבארות הג'ל המוצק. הפעל את אלקטרופורזה הג'ל ב-100 וולט למשך כ-30 דקות כדי להפריד את שברי ה-RNA לפי גודל. דמיין את רצועות ה-RNA על ידי הנחת הג'ל על טרנס-מאיר UV או מערכת הדמיה, מה שגורם ל-RNA המוכתם באתידיום ברומיד להאיר.
  4. אחסון RNA מופק
    1. קח את דגימות ה-RNA שחולצו. הציגו את ה-RNA לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגות סטריליים, תוך שימוש בנפחים של 10 מיקרוליטר לכל אליקוטה. אחסן את מחירי ה-RNA בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס ומטה.
  5. שעתוק הפוך של RNA ל-cDNA
    1. עקוב אחר פרוטוקול ערכת התמלול ההפוך. להפשיר ולהכין את הריאגנטים הדרושים על קרח ובטמפרטורת החדר.
    2. בצע תגובת חיסול DNA גנומית כדי להסיר כל זיהום DNA גנומי.
    3. הכן את תערובת מאסטר התמלול ההפוך על קרח, המכילה את כל הרכיבים למעט ה-RNA של התבנית.
    4. הוסף את ה-RNA של התבנית משלב חיסול ה-DNA לתערובת המאסטר של השעתוק ההפוך. דגרו את תגובת השעתוק ההפוך ב-42 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    5. השבת את אנזים הטרנסקריפטאז ההפוך על ידי דגירה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. השתמש בכמות של ה-cDNA המוגמר ל-PCR מיידי בזמן אמת או אחסן את ה-cDNA ב-20 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.

3. עיצוב פריימר ל-PCR בזמן אמת

  1. בחירת גני יעד ובקרות פנימיות
    1. בחר בגן MLH1 כיעד לכימות בשל הקשר שלו לסרטן המעי הגס. בחר β-actin כבקרה הפנימית לנורמליזציה של נתוני ביטוי גנים.
  2. תהליך עיצוב פריימר
    1. הפעל את תוכנת עיצוב הפריימר והזן את רצף הגנים של MLH1 שהתקבל מדפדפן הגנום של Ensemble או UCSC.
    2. הגדר את טמפרטורת ההיתוך (Tm) עבור פריימרים בין 58-60 מעלות צלזיוס, תכולת GC אופטימלית ב-40%-60%, ואורך פריימר בין 18-24 נוקלאוטידים.
    3. הזן את רצפי הפריימר המעוצבים למסד הנתונים של NCBI BLAST כדי לאשר את הספציפיות.
      1. עבור אל אתר האינטרנט של BLAST, בחר Nucleotide BLAST. הדבק את רצפי הפריימר בתיבת החיפוש ולחץ על BLAST.
      2. נתח את התוצאות כדי להבטיח שלא צפויה הגברה מחוץ למטרה. ראה טבלה 1 לפרטים.

4. PCR בזמן אמת

  1. הגדרת תגובת PCR בזמן אמת. ראה טבלה 2 לפרטים.
    1. צנטריפוגה את הריאגנטים ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב-10,000 x גרם כדי לאסוף תוכן בתחתית הצינורות.
    2. הכן תערובת מאסטר על פי פרוטוקול הערכה המסחרית, הכולל את SYBR Green, buffer, dNTPs, MgCl2 ו-Taq polymerase.
    3. הקצו את תערובת המאסטר לצינורות PCR מסומנים, מה שמבטיח עקביות בנפח על פני הדגימות.
    4. הוסף את הנפח המתאים של פריימרים קדימה ואחורה עבור MLH1 ו-β-actin לתוך הצינורות שלהם.
    5. לדלל את דגימות ה-RNA לריכוז עקבי של 100 ננוגרם/מיקרוליטר לפני שעתוק הפוך ותמלול הפוך ל-cDNA באמצעות ערכת שעתוק הפוך.
  2. הגברה ואיסוף נתונים
    1. הנח את צינורות ה-PCR במערכת ה-PCR בזמן אמת.
    2. תכנת את המחזור התרמי עם תנאי הרכיבה האופטימליים: 95 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות לדנטורציה, 54 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות לחישול ו-72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות להארכה. ראה טבלה 3 לפרטים.
    3. הגדר את המכונה לפעול במשך 45 מחזורים.
    4. עקוב אחר התגובה בזמן אמת בממשק התוכנה של המערכת, תוך התבוננות בעקומות ההגברה של כל דגימה.
    5. כלול בקרה שלילית ללא cDNA כדי לבדוק אם יש זיהום. חזור על הפעלת ה-PCR 3x עבור כל דגימה כדי להבטיח את אמינות הנתונים.
  3. ניתוח נתונים
    1. לאחר השלמת המחזורים, השתמש בתוכנת המערכת כדי לנתח את ערכי מחזור הסף (Ct). ייצא את ערכי ה-Ct לתוכנית גיליון אלקטרוני להמשך ניתוח.
    2. חשב את ביטוי הגנים היחסי בשיטת 2-ΔΔCt 25, תוך נורמליזציה של הנתונים לבקרת β-actin.

5. אימונוהיסטוכימיה ואנליזות גנטיות

  1. לבצע אימונוהיסטוכימיה על קטעי רקמה כדי לתאם את ביטוי חלבון MLH1 עם רמות ביטוי הגנים.
    1. הכן שקופיות רקמה והחל נוגדן נגד MLH1.
    2. השתמש בנוגדנים משניים מצומדים HRP ובערכת מצע DAB (3,3'-Diaminobenzidine). פתח שקופיות לפי הוראות הערכה ונתח אותן במיקרוסקופ אור.
  2. בצע בדיקת PCR ספציפית למתילציה ואי יציבות מיקרו-לוויין כדי להבדיל בין תסמונת לינץ' ל-CRC ספורדי.
    1. השתמש בערכת מיצוי DNA מסחרית. עקוב אחר פרוטוקול הערכה הן עבור רקמות הדם והן עבור רקמות הגידול.
    2. טפל ב-DNA עם ערכת המרה של ביסולפיט. השתמש בפריימרים ספציפיים למתילציה המיועדים לאזור מקדם MLH1. בצע PCR לפי פרוטוקול הערכה.
    3. הפעל אלקטרופורזה של ג'ל על מוצרי ה-PCR כדי להמחיש את מצב המתילציה.
    4. לבדיקת חוסר יציבות מיקרו-לוויין (MSI), אלקטרופורזה נימית באמצעות מנתח גנטי. השווה אורכי מיקרו-לוויין על ידי ניתוח מוצרי PCR עם תווית פלואורסצנטית.

6. ניתוח סטטיסטי

  1. השתמש בתוכנת ניתוח סטטיסטי מסחרית לניתוח נתונים.
    1. פתח את התוכנה וצור מערך נתונים חדש לביטוי גנים ונתונים דמוגרפיים.
    2. הזן את ערכי ביטוי הגנים היחסיים והנתונים הדמוגרפיים המתאימים למערך הנתונים.
    3. השתמש במבחן קולמוגורוב-סמירנוב כדי להעריך את תקינות הנתונים.
      1. בחר נתח מהתפריט העליון, בחר בדיקות לא פרמטריות ולאחר מכן תיבות דו-שיח מדור קודם.
      2. לחץ על מבחן קולמוגורוב-סמירנוב והזן את המשתנה לביטוי גנים. בצע את הבדיקה ופרש את הפלט עבור המשמעות של נורמליות ההפצה.
    4. ערכו בדיקות T להשוואת ביטוי הגן MLH1 בין קבוצות המטופלים לקבוצת הביקורת.
      1. בחר ניתוח, לאחר מכן השווה אמצעים, ובחר מבחן T מדגמים בלתי תלויים.
      2. הקצה חברות בקבוצה (מטופל או ביקורת) כמשתנה הקיבוץ וביטוי גנים כמשתנה הבדיקה. הפעל את הבדיקה ופרש את רמת המובהקות הדו-זנבית.
    5. חשב שינויי קיפול בביטוי גנים בשיטת 2-ΔΔCt 25.

תוצאות

במחקר זה נבדקו 36 חולים עם סרטן המעי הגס לביטוי הגן MLH1 בדם ההיקפי והקשר שלו לסרטן המעי הגס. ניתוח משתנים דמוגרפיים הראה כי 15 חולים (41.6%) היו נשים, ו-21 חולים (58.4%) היו גברים. הגיל הממוצע של החולים היה 57.35 ±-4.22 שנים, וטווח הגילאים היה 26-87 שנים. מצב מדד מסת הגוף (BMI) של החולים הרא?...

Discussion

מחקר זה נערך במטרה לחקור את ביטוי הגן MLH1 . במחקר זה הוכח כי רמת ביטוי הגן MLH1 ירדה אצל אנשים חולים בהשוואה לאנשים בריאים. בהתבסס על מחקרי שינוי קפלים, הוכח כי הביטוי של הגן MLH1 בשלב II, שלב III ושלב IV באנשים חולים בהשוואה לאנשים בריאים היה בעל ירידה משמעותית.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

Acknowledgements

ברצוננו להביע את תודתנו והערכתנו לכל מי שעזר לנו להשלים את מאמץ המחקר הזה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose Gel Electrophoresis EquipmentBio-RadMini-Sub Cell GT SystemsUsed to check RNA quality
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-AldrichE9884Used as an anticoagulant for blood samples
NanoDropThermoFisher ScientificND-2000Spectrophotometer used to determine RNA purity
Real-time PCR MachineApplied BiosystemsA34322Used for RT-PCR reactions
RNA Extraction KitIntron Biotechnology Co#Cat 17061Used for RNA extraction from blood samples
SYBR Green PCR KitThermo Fisher Scientific4309155Reagents used for RT-PCR experiments

References

  1. Favoriti, P., et al. Worldwide burden of colorectal cancer: a review. Updates Surg. 68 (1), 7-11 (2016).
  2. Lotfollahzadeh, S., Recio-Boiles, A., Cagir, B. Colon cancer. StatPearls. , (2024).
  3. Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors. Prz Gastroenterol. 14 (2), 89-103 (2019).
  4. Woischke, C., Michl, M., Neumann, J. Molecular pathology of colorectal cancer. Pathologie. 44 (5), 279-286 (2023).
  5. Lachit, K., Vinita, P. Study of mismatch repair protein expression by using immunohistochemistry in various carcinomas with special reference to colorectal adenocarcinomas-at a tertiary referral laboratory in India. Asian Pacific J Cancer Biol. 7 (4), 341-347 (2022).
  6. Cerretelli, G., Ager, A., Arends, M. J., Frayling, I. M. Molecular pathology of Lynch syndrome. J Pathol. 250 (5), 518-531 (2020).
  7. Tiwari, A. K., Roy, H. K., Lynch, H. T. Lynch syndrome in the 21st century: clinical perspectives. QJM. 109 (3), 151-158 (2016).
  8. Hinrichsen, I., et al. Reduced migration of MLH1 deficient colon cancer cells depends on SPTAN1. Mol Cancer. 13 (1), 1-12 (2014).
  9. Nissar, B., Shah, I. A., ul Afshan, F., Ganai, B. A. A decade in unravelling the etiology of gastric carcinogenesis in Kashmir, India - A high risk region. Gene Rep. 21 (1), 100832 (2020).
  10. Reyes, G. X., Schmidt, T. T., Kolodner, R. D., Hombauer, H. New insights into the mechanism of DNA mismatch repair. Chromosoma. 124 (4), 443-462 (2015).
  11. Rogacheva, M. V., et al. Mlh1-Mlh3, a meiotic crossover and DNA mismatch repair factor, is a Msh2-Msh3-stimulated endonuclease. J Biol Chem. 289 (9), 5664-5673 (2014).
  12. Martin, S. A. The DNA mismatch repair pathway. DNA Repair Cancer Ther. , 151-177 (2016).
  13. Fukuhara, S., et al. DNA mismatch repair gene MLH1 induces apoptosis in prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (22), 11297-11307 (2014).
  14. Boland, C. R., Goel, A., Patel, S. G. The genetic and epigenetic landscape of early-onset colorectal cancer. Colorectal Cancer. 9 (3), (2020).
  15. Özdemir, Z., et al. Uncommon variants detected via hereditary cancer panel and suggestions for genetic counseling. Mutat Res. 827, 111831 (2023).
  16. Sinicrope, F. A. Lynch syndrome-associated colorectal cancer. New Engl J Med. 379 (8), 764-773 (2018).
  17. Westwood, A., et al. Additional loss of MSH2 and MSH6 expression in sporadic deficient mismatch repair colorectal cancer due to MLH1 promoter hypermethylation. J Clin Pathol. 72 (6), 443-447 (2019).
  18. Chung, C. Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in colorectal cancer: A 2021 update on current development, evidence, and recommendation. J Oncol Pharm Pract. 28 (4), 850-869 (2022).
  19. Yu, H., et al. The mRNA level of MLH1 in peripheral blood is a biomarker for the diagnosis of hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Am J Cancer Res. 6 (5), 1135-1140 (2016).
  20. Kasprzak, A. Prognostic biomarkers of cell proliferation in colorectal cancer (CRC): From immunohistochemistry to molecular biology techniques. Cancers. 15 (18), 4570 (2023).
  21. Tao, W., Xie, Y. Study on relationship between NILH1 gene 415 locus G→G mutation and sporadic colorectal cancer in Chinese patients. Chinese J Exp Surg. 26 (6), 752-754 (2009).
  22. Martinez, E. C., Zevallos-Delgado, C., Joseph, M. Analysis of the genetic expression of colon cancer genetic biomarkers on inflammatory bowel disease on blood and biopsy samples. Genomics Gene Func. 164, S49 (2023).
  23. Rahiminejad, S., Maurya, M. R., Mukund, K., Subramaniam, S. Modular and mechanistic changes across stages of colorectal cancer. BMC cancer. 22 (1), 436 (2022).
  24. Alrushaid, N., Khan, F. A., Al-Suhaimi, E., Elaissari, A. Progress and perspectives in colon cancer pathology, diagnosis, and treatments. Diseases. 11 (4), 148 (2023).
  25. Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. An improvement of the 2ˆ(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostat Bioinfo Biomath. 3 (3), 71-85 (2013).
  26. Jurescu, A., et al. Colorectal carcinomas: Searching for new histological parameters associated with lymph node metastases. Medicina. 59 (10), 1761 (2023).
  27. Sawicki, T., et al. A review of colorectal cancer in terms of epidemiology, risk factors, development, symptoms and diagnosis. Cancers. 13 (9), 2025 (2021).
  28. Cardoso, R., et al. Overall and stage-specific survival of patients with screen-detected colorectal cancer in European countries: A population-based study in 9 countries. Lancet Reg Health Eur. 21 (1), 100458 (2022).
  29. Dekker, E., Tanis, P. J., Vleugels, J. L. A., Kasi, P. M., Wallace, M. B. Colorectal cancer. Lancet. 394 (10207), 1467-1480 (2019).
  30. Hull, M. A., Rees, C. J., Sharp, L., Koo, S. A risk-stratified approach to colorectal cancer prevention and diagnosis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 17 (12), 773-780 (2020).
  31. Hossain, M. S., et al. Colorectal cancer: A review of carcinogenesis, global epidemiology, current challenges, risk factors, preventive and treatment strategies. Cancers. 14 (7), 1732 (2022).
  32. Guyot D'Asnières De Salins, A., et al. Discordance between immunochemistry of mismatch repair proteins and molecular testing of microsatellite instability in colorectal cancer. ESMO open. 6 (3), 100120 (2021).
  33. Chen, W., Swanson, B. J., Frankel, W. L. Molecular genetics of microsatellite-unstable colorectal cancer for pathologists. Diagn Pathol. 12 (1), 24 (2017).
  34. Li, J., et al. Role of MLH1 methylation in esophageal cancer carcinogenesis and its clinical significance. Onco Targets Ther. 11 (1), 651-663 (2018).
  35. Iyer, R. R., Pluciennik, A. DNA mismatch repair and its role in Huntington's disease. J Huntingtons Dis. 10 (1), 75-94 (2021).
  36. Rebuzzi, F., Ulivi, P., Tedaldi, G. Genetic predisposition to colorectal cancer: How many and which genes to test. Int J Mol Sci. 24 (3), 2137 (2023).
  37. Guo, L., Yu, Z., Li, Q., Liang, X., Yang, L. Correlation of MLH1 and MSH2 levels with clinicopathologic characteristics in colorectal cancer. Am J Transl Res. 15 (2), 1107-1116 (2023).
  38. Liu, Y., Yang, C., Li, W., Zhang, S., Li, L. Analysis of association of MLH1 and PMS2 gene expression with clinicopathological features in elderly patients with colorectal cancer. Chinese J Geriatrics. 1 (12), 927-930 (2020).
  39. Salem, M. E., et al. Molecular analyses of left- and right-sided tumors in adolescents and young adults with colorectal cancer. Oncologist. 25 (5), 404-413 (2020).
  40. Goshayeshi, L., et al. Prevalence and clinicopathological characteristics of mismatch repair-deficient colorectal carcinoma in early onset cases as compared with late-onset cases: a retrospective cross-sectional study in Northeastern Iran. BMJ open. 8 (8), e023102 (2018).
  41. Zaborowski, A. M., et al. Clinicopathological features and oncological outcomes of patients with young-onset rectal cancer. Br J Surg. 107 (5), 606-612 (2020).
  42. Paredes, S. R., Chan, C., Rickard, M. Immunohistochemistry in screening for heritable colorectal cancer: what to do with an abnormal result. ANZ J Surg. 90 (5), 702-707 (2020).
  43. Anvari, A. H., Ganji, S. M., Movahhed, T. K. Cellular MLH1 gene expression and pathologic factors in Iranian patients with colorectal cancer. Qom Univ Med Sci J. 14 (8), 62-70 (2020).
  44. Sahin, I. H., et al. Analysis of age, tumor-sidedness, and mismatch repair (MMR) genes with response to immune checkpoint inhibitors (ICIs) in MMR-deficient (dMMR) colorectal cancer (CRC) patients (pts): A multi-institutional study. J Clinl Oncol. 37 (15), e15029 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

MLH1RNACDNAPCRCRC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved