דיסקציה, עיבוד היסטולוגי וניתוח ביטוי גנים של רקמת שומן חומה סופרקלאביקולרית מורין

Summary

כאן, אנו מספקים הליך מעשי לניתוח וביצוע ניתוחים היסטולוגיים וביטוי גנים של רקמת שומן חומה סופרקלאביקולרית.

Abstract

תרמוגנזה בתיווך רקמת שומן חום (BAT) ממלאת תפקיד חשוב בוויסות חילוף החומרים, והמורפולוגיה והתפקוד שלה יכולים להיות מושפעים מאוד מגירויים סביבתיים בעכברים ובבני אדם. נכון לעכשיו, מורין interscapular BAT (iBAT), הממוקם בין שתי עצם השכמה באגף הגבי העליון של עכברים, הוא מחסן BAT העיקרי המשמש מעבדות מחקר לחקר תפקוד BAT. לאחרונה זוהו בעכברים כמה מחסני BAT שלא היו ידועים קודם לכן, כולל אחד המקביל לרקמת שומן חומה סופרקלאביקולרית אנושית. שלא כמו iBAT, רקמת שומן חומה סופרקלאביקולרית (scBAT) ממוקמת בשכבת הביניים של הצוואר ולכן לא ניתן לגשת אליה בקלות.

כדי להקל על המחקר של scBAT עכבר שזוהה לאחרונה, מוצג כאן פרוטוקול המפרט את השלבים לניתוח scBAT שלם מעכברים לאחר לידה ובוגרים. בשל גודלו הקטן של scBAT ביחס למחסני שומן אחרים, הנהלים שונו והותאמו במיוחד לעיבוד scBAT. בין שינויים אלה הוא השימוש במיקרוסקופ מנתח במהלך איסוף רקמות כדי להגדיל את הדיוק וההומוגניזציה של דגימות scBAT קפואות כדי להעלות את היעילות של ניתוח qPCR לאחר מכן. בעזרת אופטימיזציות אלה, ניתן לקבוע את הזיהוי, המראה המורפולוגי והאפיון המולקולרי של scBAT בעכברים.

Introduction

השכיחות הגוברת של השמנת יתר בארה"ב ובעולם הציתה עניין רב בהבנת האטיולוגיה שלה ובזיהוי טיפולים פוטנציאליים ^1,2. רקמת השומן ממלאת תפקיד חיוני בחילוף החומרים, וחוסר ויסות של רקמת השומן יכול להוביל להתפתחות של השמנת יתר. בדרך כלל, ישנם שני סוגים של רקמות שומן, רקמת שומן לבנה וחומה. בעוד רקמת שומן לבן (WAT) יכולה לאחסן אנרגיה כימית ולהפריש גורמים אנדוקריניים, רקמת שומן חום (BAT) יכולה להשתמש באנרגיה כימית כדי לייצר חום ולשמור על טמפרטורת הגוף בקור ^3,4. בגלל יכולת ייחודית זו, הפעלת BAT יכולה גם להגדיל את הוצאת האנרגיה ולשפר את הרגישות לאינסולין

Protocol

ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במכללת ביילור לרפואה. כל ההליכים בוצעו בעכברים זכרים C57BL/6J בני 3 שבועות ו-3 חודשים. לפני הנתיחה, כל העכברים הומתו באמצעות הליך המתת חסד פחמן דו חמצני מאושר. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. דיסקציה של scBAT

1. הניחו את פגר העכבר על שולחן העבודה ונקו את המספריים הכירורגיים ואת המלקחיים הנקודתיים העדינים במיוחד עם 70% אתנול.
2. רססו את צוואר הגחון של העכבר באתנול 70% כדי להרטיב את הפרווה ולמזער את זיהום הפרווה.
3. בצע חתך דו צדדי, כ -1.5 ס"מ, לאורך עצם הבריח.

תוצאות

שלא כמו iBAT, אשר ממוקם בשכבה התת-עורית של הגב בין שתי השכמה, scBAT ממוקם בשכבת הביניים של הצוואר, המשתרעת עמוק בין שכבות שרירי השלד ובלוטת הרוק כשהיא גדלה לאורך וריד הצוואר החיצוני (איור 1A). ניתוח scBAT אינו פשוט כמו iBAT. במאמר זה אנו מספקים הליך מפורט הכולל שלבים ח?.......

Discussion

בפרוטוקול זה, אנו מציגים בפירוט את ההליכים לניתוח ועיבוד scBAT עבור H&E וניתוח ביטוי גנים. מכיוון ש- scBAT שוכן בשכבת הביניים של הצוואר ונמצא לאורך הוורידים הגדולים, הבידוד של מחסן זה דורש טכניקה מדויקת. באופן ספציפי, כדי לקבל תצוגה ברורה של המחסן, אנו ממליצים למקם את העכבר תחת מיקרוסקופ ניתוח לאח.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
95% Dehydrant Alcohol (Flex 95)	Epredia	8201
100% Dehydrant Alcohol (Flex 100)	Epredia	8101
96-well PCR plate	Bio-Rad	MLL9601
Aurum Binding Mini Column	Bio-Rad	7326826
Aurum High Stringency Wash	Bio-Rad	7326803
Aurum Low Stringency Wash	Bio-Rad	7326804
Base Molds (for embedding)	Tissue-Tek	4122
BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2"	Becton Dickinson	305167
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad	1840148
Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL	Fisherbrand	02-681-453
Centrifuge	Eppendorf	5430R
CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument	Bio-Rad	12011319
Chloroform	Thermo Scientific Chemicals	383760010
Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium	Epredia	83104
DEPC-Treated Water	Ambion	AM 9906
Dissecting Microscope	Nikon	SMZ1500
DNase Dilution Solution	Bio-Rad	7326805
DNase I	Bio-Rad	7326828
dNTPs	Invitrogen	18427013
Elution solution	Bio-Rad	7326801
EM 400 embedding medium paraffin	Leica Biosystems	3801320
Eosin Y (0.5% w/v)	RICCA	2858-16
Formula R Infiltration medium paraffin	Leica Biosystems	3801470
Genemark Nutator Gyromixer 349	Bio Express	S-3200-2
Gill #3 Hematoxylin	Sigma-Aldrich	GHS332-1L
HCl (for HCL-Ethanol)	Fisher Chemical	A142212
IP VI Embedding Cassettes	Leica Biosystems	39LC-550-5-L
Koptec's Pure Ethanol - 200 Proof (for 70% Ethanol)	Decon Labs	V1001
MgCl2 (25 mM)	Thermo Fisher Scientific	R0971
Microcentrifuge Tubes 1.7 mL	Avantor	87003-294
Microseal 'B' Seals (adhseive seals)	Bio-Rad	MSB1001
Microtome	Leica Biosystems	RM2245
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CM
Mortar Coors Tek	Thomas Scientific	60310
NaCl (for 0.85% saline)	Fisher Bioreagents	BP358-212
NanoDrop Spectrophotometer	NanoDrop Technologies	ND-1000 UV/Vis
Oligo dT	Invitrogen	18418020
Paraffin Section Flotation Bath	Boekel Scientific	14792V
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148-500G
PCR Tube Strip	Avantor	76318-802
Pestle by Coors Tek	Thomas Scientific	60311
Pestle Pellet Motor	Kimble	749540-0000
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Precision Model 19 Vacuum Oven	Thermo Fisher Scientific	CAT# 51221162
Primer: 36B4  (forward) 10 μM 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’			Chen lab Oligo database
Primer: 36B4 (reverse) 10 μM 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (forward) 10 μM 5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM 5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM 5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM 5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’			Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (forward) 10 μM 5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’			Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (reserve) 10 μM 5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (forward) 10 μM 5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM 5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’			Chen lab Oligo database
RNA isolation solution (PureZol)	Bio-Rad	7326880
RNase Away (surface decontaminant)	Thermo Scientific	1437535
RNase H	NEB	M0297S
Rnase inhibitor (RNase Out)	Invitrogen	10777019
Scintillation Vial (glass)	Electron Microscopy Sciences	72632
Slide drying bench	Electrothermal (Cole-Parmer)	MH6616
Stainless staining rack	Electron Microscopy Sciences	70312-54
Stereo microscope (for embedding)	Olympus	SZ51
Sugical scissors	McKesson	43-1-104
Superfine point Straight Dissecting Forceps	Avantor	82027-402
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT)	Invitrogen	18080044
SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL	Terumo	100281
SYBR Green (qPCR enzyme master mixture)	Applied Biosystems	A25778
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars)	Electron Microscopy Sciences	SKU: 62540-01
Toluene	Fisher Chemical	T324-1
Transfer pipette	Avantor	414004-005
Xylene	Fisher Chemical	X3P-1GAL