בידוד גרעיני מתאי דם שמקורם בהקפאה חוץ גופית

Summary

אנו מתארים פרוטוקול לחילוץ גרעינים באיכות גבוהה מסוגי תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים בהקפאה, סטרומה/אנדותל ותאי דם שמקורם בהקפאה, לתמיכה בניתוחי ריצוף של הדור הבא של גרעין יחיד. ייצור גרעינים שלמים באיכות גבוהה הוא הכרחי לניסויים מולטיומיים, אך יכול להוות חסם כניסה לשטח עבור מעבדות מסוימות.

Abstract

מודלים מבוססי תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) הם פלטפורמות מצוינות להבנת התפתחות הדם, ולתאי דם שמקורם ב- iPSC יש תועלת תרגומית כריאגנטים לבדיקה קלינית וטיפולי תאים הניתנים לטרנספוזציה. הופעתו והרחבתו של ניתוח מולטיומיקס, כולל, אך לא רק, ריצוף RNA של גרעין יחיד (snRNAseq) ו- Assay for Transposase-Accessible Chromatin sequencing (snATACseq), מציע את הפוטנציאל לחולל מהפכה בהבנה שלנו של התפתחות תאים. זה כולל ביולוגיה התפתחותית באמצעות מודלים hematopoietic במבחנה . עם זאת, זה יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית לבודד גרעינים שלמים מתאים בתרבית או ראשוניים. סוגי תאים שונים דורשים לעתים קרובות תכשירים גרעיניים מותאמים בהתאם לנוקשות התא ותכולתו. קשיים טכניים אלה יכולים להגביל את איכות הנתונים ולשמש מחסום לחוקרים המעוניינים להמשיך במחקרים מולטיומיים. שימור בהקפאה של דגימות נחוץ לעתים קרובות בשל מגבלות באיסוף ו / או עיבוד תאים, ודגימות קפואות יכולות להציג אתגרים טכניים נוספים לבידוד גרעיני שלם. בכתב יד זה, אנו מספקים שיטה מפורטת לבידוד גרעינים באיכות גבוהה מתאים שמקורם ב- iPSC בשלבים שונים של התפתחות המטופויטית במבחנה לשימוש בתהליכי עבודה מולטיומיים של גרעין יחיד. מיקדנו את פיתוח השיטה בבידוד גרעינים מתאי סטרומה/אנדותל דבקים שמקורם ב-iPSC ומתאי אב המטופויטיים שאינם דבקים, שכן אלה מייצגים סוגי תאים שונים מאוד מבחינת זהות מבנית ותאית. שלבי פתרון הבעיות המתוארים הגבילו גושים גרעיניים ופסולת, ואפשרו התאוששות של גרעינים בכמות ובאיכות מספיקות לניתוחים במורד הזרם. שיטות דומות עשויות להיות מותאמות לבידוד גרעינים מסוגי תאים אחרים שמורים בהקפאה.

Introduction

המטופויזיס היא מערכת התפתחותית מאופיינת היטב, אך חוסר יכולת לשחזר את היווצרות תאי הדם במבחנה מדגים הבנה חלקית של גורמים קשורים. מודלים של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) המבוססים על המטופויזה יכולים לעזור להבהיר גורמי התפתחות מרכזיים וביולוגיה קשורה. מערכת iPSC מציעה גם מודל מצוין לחקר הפרעות דם, ותאי דם מבוססי iPSC פותחו כדי לייצר ריאגנטים רלוונטיים מבחינה תרגומית וטיפולית 1,2,3,4. מחקרים חד-תאיים שימשו באופן נרחב לחקר ביולוגיה התפתחותית מבוססת iPSC, כולל סוגי תאים המיוצרים במהלך המטופויזיס⁵. בהשוואה לריצוף רנ"א בתפזורת, שאינו יכול להסיק על קשרים בין תת-אוכלוסיות תאים⁶, מודלים חד-תאיים מאפשרים הערכה של הטרוגניות התא ויכולים להקל על זיהוי ואפיון התפתחות התא ^6,7.

היווצרות תאים המטופויטיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים דורשת התמיינות רציפה באמצעות פסים פרימיטיביים, מזודרם ומצבי אנדותל ליצירת תאי אנדותל המוגניים. תאי אנדותל המוגניים הם מבשרים ישירים לתאי גזע ותאי אב המטופויטיים⁸. לסוגי תאים אלה יש תכונות מורפולוגיות ותאיות שונות להפליא. קיימת הבנה מוגבלת של הנוף האפיגנטי והדינמיקה ההתפתחותית של מודלים של תאים המטופויטיים שמקורם במבחנה, אם כי זהו ידע חיוני כדי לשחרר את מלוא הפוטנציאל הטיפולי של מערכת iPSC. במקרים רבים, רק שיטות אנליזה של תאים בודדים מאפשרות זיהוי אוכלוסיות תאים, פעילויות שעתוק, נופי כרומטינים ומנגנוני בקרה השולטים בהתפתחות בקרב תכשירים הטרוגניים של תאים.

שתי מתודולוגיות, ריצוף RNA חד-תאי (scRNAseq) וריצוף RNA של גרעינים בודדים (snRNAseq), יכולות לחשוף תובנות שעתוק ברמת התא הבודד⁹. גורם עיקרי המכתיב את תוקף הנתונים ומהימנותם הוא הצורך הבלתי מתפשר בדגימות העומדות בקריטריוני איכות מחמירים. אלה כוללים דרישות מדויקות לצפיפות התא / הגרעין, כדאיות אופטימלית ומינימום גושים. הכנת גרעינים בודדים יכולה להיות מאתגרת מבחינה טכנית. ייתכנו אתגרים נוספים הקשורים לשימוש בתאים שנשמרו בעבר בהקפאה.

אנו מציינים ארבע מגבלות פוטנציאליות חשובות לגישות scRNAseq סטנדרטיות. ראשית, פרוטוקולים סטנדרטיים ליצירת תרחיפים של תאים מתייחסים לעתים קרובות לתכשירים מתאים או רקמות טריים, ולא לאלה שנשלפו לאחר שימור בהקפאה¹⁰. זה יכול לצמצם את התועלת של משאבים בעלי ערך פוטנציאלי. שנית, יעילות הדיסוציאציה של סוגי תאים מגוונים משתנה. לדוגמה, סוגים רבים של תאי מערכת החיסון עוברים דיסוציאציה בקלות יחסית. לעומת זאת, תאי סטרומה, פיברובלסטים ותאי אנדותל, אשר בדרך כלל מוטמעים במטריצה החוץ תאית ובקרום המרתף, הם בעלי תכונות תאיות ייחודיות שיכולות לסבך בידוד גרעינים^11,12. תכונות אלה יכולות לדרוש פרוטוקולי דיסוציאציה אגרסיביים, אשר עלולים לסכן את השלמות המבנית של אוכלוסיות תאים עדינות יותר. שלישית, תאים מסוימים (למשל, מגה-קריוציטים) יכולים לעבור את הקוטר של 100 מיקרומטר ולהציב קשיים עבור מספר פלטפורמות מסחריות קיימות של תא בודד¹³. בנוסף, טיפול לא נכון יכול להוביל לנזק תאי ולתגובות עקה במהלך השלבים הראשונים של בידוד התא, הכוללים הידרוליזה אנזימטית ודיסוציאציה מכנית, אשר יכולים להשפיע על פרופילי ביטוי גנים^11,14.

מסיבות אלה ואחרות, גישת גרעין יחיד עשויה להיות חלופה עדיפה על שיטות תא בודד¹⁵. בהתחשב ביציבות העדיפה של קרום הגרעין בהשוואה לקרום התא, מעטפת הגרעין עשויה להישאר שלמה גם לאחר שימור רקמתי^{בהקפאה 16}. זה יכול להקל על מיצוי גרעיני ולשפר את מגוון סוגי הדגימות המתאימים לשיטות ריצוף של הדור הבא. שנית, גרעינים מפגינים התנגדות מוגברת להפרעות מכניות ונוטים להפגין פחות שינויי שעתוק במהלך דיסוציאציה¹⁴. לכן, גרעינים יכולים לספק יציבות RNA גדולה יותר ופרופילי שעתוק הניתנים לשכפול רבים יותר. יתרון בולט שלישי של שיטות גרעינים בודדים הוא היעדר אילוצים של גודל התא ויישום עבור תאים גדולים יותר, כמו קרדיומיוציטים או מגה-קריוציטים¹². רביעית, גרעינים משמשים כמצע מתאים לאנליזות מולטיומיקס, המציעות תובנות מורחבות מניתוח משולב של ביטוי גנים, אזורי כרומטין נגישים ופרמטרים אחרים¹⁷, המאפשרים הבנה עמוקה יותר של הטרוגניות התא, התפתחותה ומצבים תפקודיים¹⁸.

על ידי אפיון iPSCs במהלך התפתחות hematopoietic, גישות multiomics יכול לעזור להגדיר תהליכים התפתחותיים במודלים נורמליים או פתולוגיים של מחלות. השוואות של תאים שמקורם ב-iPSC לתאים ראשוניים או רקמות יכולות גם לספק הערכה של נאמנות מודל iPSC לביולוגיה in vivo , להקל על שיפור מודל iPSC וגילוי אוכלוסיות תאים חדשות וגורמים המניעים את היווצרות הדם.

למרות שקבוצות רבות ניווטו בהצלחה את הבידוד הגרעיני ואת ניתוח ריצוף הדור הבא, בידוד גרעינים באיכות גבוהה נותר מחסום בפני מעבדות מסוימות המעוניינות לבצע ניתוחים מבוססי גרעין יחיד. כתב יד זה מפרט פרוטוקול לבידוד גרעינים איכותיים מתאים שבעבר נשמרו בהקפאה iPSC. התמקדנו בתאי סטרומה/אנדותל דבקים ובתאי אב המטופויטיים שאינם דבקים, מכיוון שאלה מייצגים סוגי תאים שונים מאוד מבחינת מבנה ותוכן הדורשים שינויים מותאמים אישית ופתרון בעיות כדי להגביר את ההתאוששות של גרעינים באיכות גבוהה הניתנים לריצוף הדור הבא או לניסויים אחרים.

Protocol

1. cryopreservation של תאים

1. יש להקפיא >1 x 10⁶ תאים מבודדים שמקורם ב-iPSC לכל מ"ל ב-1 מ"ל של 90% FBS ו-10% DMSO. הכניסו את ההקפאה למיכל הקפאה בטמפרטורה של -80°C כדי להפחית את מהירות ההקפאה ולמטב את התאוששות התאים בת קיימא (Table of Materials). צפו אובדן תאים משמעותי, אשר יכול להשתנות בהתאם לתנאי התרבית ולזהות התא.
2. עבור מ- -80°C לאחסון חנקן נוזלי תוך 24 שעות.

2. הפשרת תאים

1. יש לאחזר קריוביאל מאחסון חנקן נוזלי ולהפשיר באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 2 דקות. הסר מאמבט המים בעוד גבישי קרח קטנים עדיין גלויים.
2. מעבירים את התאים מהקריוביאל לצינור ריק של 15 מ"ל ומוסיפים לאט 10 מ"ל של מדיום מחומם מראש (RPMI 1640 + 10% FBS) תוך ערבוב זהיר. צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 3 דקות ב 25 ° C.
3. לשאוף את supernatant ולבנות מחדש ב 1 מ"ל של DPBS בתוספת 2% FBS ו 1 mM CaCl₂ (טבלה של חומרים). בזהירות לערבב על ידי pipetting 3x עם micropipette 1000 μL. מעבירים לצינור תחתון עגול פוליסטירן 5 מ"ל.

3. הסרת תאים מתים

1. הוסף 50 μL של קוקטייל להסרת תאים מתים (טבלה של חומרים) ל 1 מ"ל של תרחיף התא. הוסיפו 50 מיקרוליטר של קוקטייל לבחירת ביוטין לתערובת התאים. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות. שלבים אלה מסמנים את התאים המתים Annexin V⁺ הכלולים בתרחיף התא עם ביוטין.
2. מערבלים במרץ במשך 30 שניות, חרוזי דקסטרן המיועדים לדלדול סוגי תאים לא רצויים המסומנים בביוטין (רשימת חומרים). יש להוסיף 100 μL של חרוזי דקסטרן לתרחיף התאים ולערבב על ידי פיטום עדין למעלה ולמטה 2x עם מיקרופיפטה של 1000 μL (טבלת חומרים).
3. הוסף 1.3 מ"ל של DPBS המכיל 2% FBS ו- 1 mM CaCl₂ לתרחיף התא וערבב על ידי פיפטציה עדינה למעלה ולמטה 2x עם מיקרופיפטה של 1000 μL. מכניסים את הצינור למגנט (טבלת חומרים) ודגרים בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
4. הפוך את המגנט והצינור כדי לשפוך את תרחיף התא החי המועשר לתוך צינור חרוטי חדש של 15 מ"ל. צנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 3 דקות ב-4°C. הסר את רוב supernatant ו resuspend ב 1 מ"ל של DPBS + 0.04% BSA. מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג 3x עם מיקרופיפטה 1000 μL.

4. בידוד גרעינים

1. צנטריפוגה מתלה תאים חיים ב 460 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן לשאוף supernatant, להבטיח שום הפרעה של כדור התא.
2. יש להוסיף 100 מיקרוליטר של חיץ ליזיס טרי 0.5x מקורר על קרח (טבלה 1) ולערבב בעדינות על ידי פיפטוף 10x עם מיקרופיפטה של 100 μL. יש לדגור 3 דקות על קרח.
3. הוסיפו 500 מיקרוליטר של חיץ כביסה צונן (טבלה 2) לצינור ללא ערבוב. צנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.

5. שטיפה והערכה של גרעינים

1. יש לשאוף סופרנאטנט ולהוסיף 500 מיקרוליטר של חיץ כביסה צונן כדי להמיס את הגלולה השלמה שנותרה ללא ערבוב. צנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. מוציאים את כל הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית הגרעינים.
2. השהה מחדש ב-120 מיקרוליטר של חיץ גרעינים מדולל מקורר (טבלה 3). סנן את תרחיף התא באמצעות מסננת תאים בגודל 40 מיקרומטר (רשימת חומרים).
3. צביעה עם 0.4% טריפאן כחול והערכה חזותית של איכות גרעינים מבודדים תחת מיקרוסקופ 10x (טבלה של חומרים).

6. עיבוד גרעינים מבודדים

1. שמור גרעינים על קרח. המשך לעיבוד נוסף באופן מיידי, מכיוון שגושים גרעיניים יכולים להתרחש לאורך זמן ומחייבים שלבי סינון נוספים.

תוצאות

השתמשנו בפרוטוקול הנ"ל כדי לחלץ גרעינים מתאי סטרומה/אנדותל נצמדים שמקורם ב-iPSC בהקפאה ומתאי אב המטופויטיים שאינם דבקים (צפים). ייצוג סכמטי מפורט של הליך הבידוד הגרעיני ניתן למצוא באיור 1.

לצורך בדיקה מורפולוגית, גרעינים מבודדים הוכתמו בכחול טריפאן והודמיינו ?...

Discussion

שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול
בידוד גרעינים באיכות גבוהה חיוני ליישום מוצלח של שיטות ריצוף הדור הבא המבוססות על גרעין יחיד, המתפתחות במהירות. מתוך הכרה בחסמים הקיימים עבור מעבדות המעוניינות בגישות אלה, במיוחד עבור דגימות שמורות בהקפאה, כוונתנו הייתה לעצב טכניקת בידוד גרעיני המ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Reagents
Dimethyl sulfoxide solution (DMSO)	Sigma	673439
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Corning	21031CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	GeminiBio	100106
RPMI Medium 1640 (1X)	Gibco	11875093
Cells
Induced pluripotent stem cells	N/A	N/A	The iPSCs used in this study were obtained through the CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility
Cell Staining Reagents
Trypan Blue Solution	Corning	25900CI
Dead Cell Removal Reagents
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C4901
EasySep Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	StemCell Technologies	17899	This kit is designed for the depletion of unwanted cell types labeled with biotin. The kit includes Dead Cell Removal (Annexin V) Cocktail, Biotin Selection Cocktail, and Dextran beads. This kit targets phosphatidylserine on the outer leaflet of the cell membrane of apoptotic cells using Annexin V. Unwanted cells are labeled with Annexin V, Biotinylated antibodies, and magnetic particles, and separated without columns using an EasySep magnet. Desired cells are simply poured off into a new tube.
Materials
10 µl Micropipette	Wards science	470231606
100 µl Micropipette	Wards science	470231598
1000 µl Extended Universal Tip	Oxford Lab Products	OAR-1000XL-SLF
1000 µl Micropipette	Wards science	470231602
2.0 ml Cryogenic vials	Corning	431386
20 µl Micropipette	Wards science	470231608
200 µl Micropipette	Wards science	470231600
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
Corning DeckWork 0.1-10 µl Pipet Tip Station	Corning	4143
Corning DeckWork 1-200 µl Pipet Tip Station	Corning	4144
Counting chamber	CytoSMART	699910591
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
Magnet	StemCell Technologies	18000
NALGENE Cryo 1°C Freezing Container	Nalgene	51000001
Nuclei Isolation Reagents			Nuclei isolation reagents include Lysis Buffer,  Wash buffer, and Diluted Nuclei Buffer,and Lysis Dilution Buffer. The constitution of these buffers are in the Table 1, 2, and 3. Our nuclei isolation method improved isolation from the standard kit protocols (e.g., 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). This protocol can be used with several commercial kits, including the Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283).
Dead Cell Removal kit	STEMCELL	17899
Digitonin	Thermo Fisher Scientific	BN2006
DL-Dithiothreitol solution (DTT)	Sigma	646563
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
MACS bovine serum albumin (BSA) stock Solution	Miltenyi Biotec	130091376
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma	7786303
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma	M1028
Nonidet P40 Substitute	Sigma	74385
Nuclease-Free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9937
Nuclei Buffer (20X)	10X Genomics	2000153
Protector RNase inhibitor	Sigma	3335399001
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S7653-250G
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma	59222C
Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4	Sigma	T2194
Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4)	Sigma	T3252-500G
Tween 20	Bio-Rad	1662404
Other equipment
Automated cell counter	CytoSMART	699910591
Microscope	Zeiss	Primostar 3