ייצור, תחזוקה וזיהוי של מודלים של דגי זברה נטולי חיידקים מזחלים ועד שלבים צעירים

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השלבים העיקריים להשגת עוברי דגים נטולי חיידקים (GF) ושמירה עליהם מהזחלים ועד לשלב הנעורים, כולל דגימה וגילוי מצבם הסטרילי. השימוש במודלים של GF עם זיהום חשוב להבנת תפקיד המיקרובים בבריאות המאכסן.

Abstract

דגי זברה משמשים כמודלים רבי ערך למחקר על גדילה, חסינות ומיקרוביוטה של המעי בשל הדמיון הגנומי שלהם ליונקים, עוברים שקופים שפותחו בסביבת כוריון נקייה יחסית, והתפתחות מהירה מאוד של זחלים בהשוואה למודלים של מכרסמים. דגי זברה נטולי חיידקים (Danio rerio) חיוניים להערכת רעילות המזהמים ולביסוס מודלים של מחלות דמויות אדם הקשורות לתפקודים מיקרוביאליים. בהשוואה למודלים קונבנציונליים (CR) (דגים בגידול משותף), דגי זברה GF מאפשרים מניפולציה מדויקת יותר של המיקרוביוטה המארחת, ומסייעים בקביעת הקשר הסיבתי בין מיקרואורגניזמים לפונדקאים. כתוצאה מכך, הם ממלאים תפקיד קריטי בקידום הבנתנו את מערכות היחסים הללו. עם זאת, מודלים של דגי זברה GF נוצרים ונחקרים בדרך כלל במהלך שלבי החיים המוקדמים (מעוברים ועד זחלים) עקב מגבלות בתפקוד מערכת החיסון ובספיגת חומרים מזינים. מחקר זה מייעל את הייצור, התחזוקה והזיהוי של מודלים מוקדמים של דגי זברה GF ללא האכלה ועם הזנה לטווח ארוך באמצעות מזון GF (כגון Artemia sp., שרימפס מלח). לאורך כל התהליך בוצעו דגימות יומיות ותרביות באמצעות זיהויים מרובים, כולל לוחות וריצוף rRNA 16S. הקצב האספטי, ההישרדות ומדדי ההתפתחות של דגי זברה GF תועדו כדי להבטיח את האיכות והכמות של המודלים שנוצרו. חשוב לציין, מחקר זה מספק פרטים על טכניקות בידוד חיידקים וזיהום עבור דגי GF, המאפשרים יצירה יעילה של מודלים של דגי GF מזחלים לשלבים צעירים עם תמיכה במזון GF. על ידי יישום הליכים אלה במחקר ביו-רפואי, מדענים יכולים להבין טוב יותר את היחסים בין תפקודי חיידקי המעי לבריאות המאכסן.

Introduction

המיקרוביוטה (כלומר, ארכאה, חיידקים, אאוקריה ווירוסים) ממלאת תפקיד מכריע בשמירה על בריאות המאכסן ותורמת להתפתחות מחלות שונות על ידי השפעה על תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים באמצעות אינטראקציות סימביוטיות בתוך מחסום המעי, פני השטח של האפיתל ותפקודי מוצין אצל אנשים ^1,2,3. הרכב המיקרוביוטה בשלבי חיים שונים, מינקות ועד יובלה, בגרות והזדקנות, כמו גם נוכחותה במקומות שונים כגון אתרי נארס, פה, עור ומעיים, מעוצבים באופן דינמי על ידי סביבות ובתי גידול מגוונים⁴. מיקרוביוטת המעי באורגניזמים מעורבת בספיגת חומרי מזון, תגובה חיסונית, פלישת פת....

Protocol

ניסויי הדגים נערכו בהתאם להנחיות הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים בצ'ונגצ'ינג והוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית צ'ונגצ'ינג, סין, כמו גם התקנים לבעלי חיים ניסיוניים שהונפקו על ידי לשכת המדינה לאיכות ופיקוח טכני (מזהה אישור: GB14922-2001 עד GBT14927-2001). דגי זברה (Danio rerio, סוג בר, זן AB) הופקו מהמכון להידרוביולוגיה, האקדמיה הסינית למדעים, ונשמרו במעבדה בעקבות נהלים³⁶ שדווחו בעבר.

1. תחזוקת דגי זברה בוגרים ואיסוף עוברים

הערה: בהסתמך על שינויים ממחקרים קודמים ומדוחות 16,37,38,39, התחזוקה של דגי זברה בוגרים, גידול זחלים ושיטות למודלים נ....

תוצאות

ניתן לייצר ביעילות את דגמי דגי הזברה GF על ידי ניצול שפע הביצים שהושרצו על ידי זוגות דגי זברה, כאשר הפרוטוקול מותאם למודלים קודמים של דגי GF³⁵. צלחת אחת בת 6 בארות יכולה לגדל כ-30-48 עוברים/זחלים, מה שמאפשר איסוף נתונים נרחב וניתוח סטטיסטי. לאחר טיפול סטרילי, עוברי GF מתורבתים באינקובט.......

Discussion

צעדים קריטיים במסגרת הפרוטוקולים של דגי GF והכנת מזון GF
במהלך יצירת מודלים של דגי GF היו מעורבים מספר שלבים קריטיים, כולל הכנת חומרים סטריליים, עיקור עוברים, חידוש יומי של GZM, איסוף דגימות שונות ובדיקה סטרילית של כל דגימה במספר שיטות. בין השלבים הללו, הטיפול הראשוני בעוברים הוא בסי?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AB-GZM	Amphotericin:Solarbio;  kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio.	Amphotericin:CAS:1397-89-3; kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313.	49.6 mL GZM, 50 µL amphotericin stock solution (250 µg/mL), 25 µL kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 µL ampicillin stock solution (20 mg/mL).
1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes	biosharp	BS-15-M	To collect samples, and hold agents
2.4 g/L NaClO	XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.	CAS: 7681-52-9	Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution.
6-well plates, 24-, 48- well plates	LABSELECT	11112	To culture fish
Aeronomas	NCBI database	No.MK178499	2019-JPP-ESN
Anaerobic TSA plates	tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx.	tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0.	The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system.
Anaerobic work station	GENE SCIENCE	E200G	Bacterial isolation, sterile testing
Analysis	GraphPad Prism 5	v6.07	To analysis the data
API 20 E kits	BioMerieux SA, France	No.1005915090	Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism
Artemia (Brine shrimp)	Shangjia Aquarium Co., Ltd.	Aquamaster brand	Artemia cysts, and brine shrimp eggs
Auto cycle system for fish culture	Ningbo Hairui Technology Co., Ltd	No Cat	Maintain the fish
Autoclave	Zeal Way	G154DWS	Prepare the materials
BHI Aerobic	Coolaber	Cat#PM0640	BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder.
BHI Anaerobic	Coolaber	Cat#PM0640	BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system.
Biochemical incubator	LongYue Co., Ltd	SPX	For fish and plates
Biosafety cabinet	Haier	HR40-IIA2	Sterile treatment and testing
Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO	XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.	CAS: 7681-52-9	Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water.
Blood plates	sheep blood:Solarbio	Cat. NO. TX0030	Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates.
Cell culture flask	Corning	430639	To culture fish
CM-Dil dyes	Molecular Probes	Cat#C7000	To label the bacteria
Constant temperature shaking incubator	Peiving Co., Ltd	HZQ-X100	Bacterial culture
Database	NCBI	Bacteria and Archaea database	Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/
Disposable Pasteur pipette	biosharp	bs-xh-03l	Used to change water, and transfer eggs
Disposable petri dish	biosharp	BS-90-D	To culture fish
DNA kits	Solaribio	Cat#D1600	Bacterial genomic DNA extraction kits
Electric pipette	SCILOGEX	Levo me	Change water
Exiguobacterium	NCBI database	No.MK178504	2019-JPP-ESN
GZM	Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd.	No Cat	Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L.
Laboratory pure water system	Hitech Co., Ltd	Prima-S15	Prepare the agents
Microscope	Nikon	SMZ18	With fluorescent light to observe fish larvae
PCR kits	TIANGEN	Cat#ET101	Taq DNA Polymerase kit
Pipette	LABSELECT	sp-013-10	Change water
Povidone iodine (PVP-I)	Aladdin	Lot#H1217005	Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water.
Timing converter	PinYi Co., Ltd	AL-06	To regulate the light
TSA plates	tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx.	tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0.	TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder.
TSB Aerobic	tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;	tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112;	TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl.
TSB Anaerobic	tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;	tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112;	TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system.
Ultra-clean workbench	Airtech	SW-CJ-2FD	Sterile treatment and testing
Ultra-pure flow system for fish culture	Marine Biological Equipment company	No Cat	Produce water for fish
Vibrio	NCBI database	No.MK178501	2019-JPP-ESN