A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
פרוטוקול זה מתאר את השלבים העיקריים להשגת עוברי דגים נטולי חיידקים (GF) ושמירה עליהם מהזחלים ועד לשלב הנעורים, כולל דגימה וגילוי מצבם הסטרילי. השימוש במודלים של GF עם זיהום חשוב להבנת תפקיד המיקרובים בבריאות המאכסן.
דגי זברה משמשים כמודלים רבי ערך למחקר על גדילה, חסינות ומיקרוביוטה של המעי בשל הדמיון הגנומי שלהם ליונקים, עוברים שקופים שפותחו בסביבת כוריון נקייה יחסית, והתפתחות מהירה מאוד של זחלים בהשוואה למודלים של מכרסמים. דגי זברה נטולי חיידקים (Danio rerio) חיוניים להערכת רעילות המזהמים ולביסוס מודלים של מחלות דמויות אדם הקשורות לתפקודים מיקרוביאליים. בהשוואה למודלים קונבנציונליים (CR) (דגים בגידול משותף), דגי זברה GF מאפשרים מניפולציה מדויקת יותר של המיקרוביוטה המארחת, ומסייעים בקביעת הקשר הסיבתי בין מיקרואורגניזמים לפונדקאים. כתוצאה מכך, הם ממלאים תפקיד קריטי בקידום הבנתנו את מערכות היחסים הללו. עם זאת, מודלים של דגי זברה GF נוצרים ונחקרים בדרך כלל במהלך שלבי החיים המוקדמים (מעוברים ועד זחלים) עקב מגבלות בתפקוד מערכת החיסון ובספיגת חומרים מזינים. מחקר זה מייעל את הייצור, התחזוקה והזיהוי של מודלים מוקדמים של דגי זברה GF ללא האכלה ועם הזנה לטווח ארוך באמצעות מזון GF (כגון Artemia sp., שרימפס מלח). לאורך כל התהליך בוצעו דגימות יומיות ותרביות באמצעות זיהויים מרובים, כולל לוחות וריצוף rRNA 16S. הקצב האספטי, ההישרדות ומדדי ההתפתחות של דגי זברה GF תועדו כדי להבטיח את האיכות והכמות של המודלים שנוצרו. חשוב לציין, מחקר זה מספק פרטים על טכניקות בידוד חיידקים וזיהום עבור דגי GF, המאפשרים יצירה יעילה של מודלים של דגי GF מזחלים לשלבים צעירים עם תמיכה במזון GF. על ידי יישום הליכים אלה במחקר ביו-רפואי, מדענים יכולים להבין טוב יותר את היחסים בין תפקודי חיידקי המעי לבריאות המאכסן.
המיקרוביוטה (כלומר, ארכאה, חיידקים, אאוקריה ווירוסים) ממלאת תפקיד מכריע בשמירה על בריאות המאכסן ותורמת להתפתחות מחלות שונות על ידי השפעה על תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים באמצעות אינטראקציות סימביוטיות בתוך מחסום המעי, פני השטח של האפיתל ותפקודי מוצין אצל אנשים 1,2,3. הרכב המיקרוביוטה בשלבי חיים שונים, מינקות ועד יובלה, בגרות והזדקנות, כמו גם נוכחותה במקומות שונים כגון אתרי נארס, פה, עור ומעיים, מעוצבים באופן דינמי על ידי סביבות ובתי גידול מגוונים4. מיקרוביוטת המעי באורגניזמים מעורבת בספיגת חומרי מזון, תגובה חיסונית, פלישת פת....
ניסויי הדגים נערכו בהתאם להנחיות הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים בצ'ונגצ'ינג והוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית צ'ונגצ'ינג, סין, כמו גם התקנים לבעלי חיים ניסיוניים שהונפקו על ידי לשכת המדינה לאיכות ופיקוח טכני (מזהה אישור: GB14922-2001 עד GBT14927-2001). דגי זברה (Danio rerio, סוג בר, זן AB) הופקו מהמכון להידרוביולוגיה, האקדמיה הסינית למדעים, ונשמרו במעבדה בעקבות נהלים36 שדווחו בעבר.
1. תחזוקת דגי זברה בוגרים ואיסוף עוברים
הערה: בהסתמך על שינויים ממחקרים קודמים ומדוחות 16,37,38,39, התחזוקה של דגי זברה בוגרים, גידול זחלים ושיטות למודלים נ....
ניתן לייצר ביעילות את דגמי דגי הזברה GF על ידי ניצול שפע הביצים שהושרצו על ידי זוגות דגי זברה, כאשר הפרוטוקול מותאם למודלים קודמים של דגי GF35. צלחת אחת בת 6 בארות יכולה לגדל כ-30-48 עוברים/זחלים, מה שמאפשר איסוף נתונים נרחב וניתוח סטטיסטי. לאחר טיפול סטרילי, עוברי GF מתורבתים באינקובט.......
צעדים קריטיים במסגרת הפרוטוקולים של דגי GF והכנת מזון GF
במהלך יצירת מודלים של דגי GF היו מעורבים מספר שלבים קריטיים, כולל הכנת חומרים סטריליים, עיקור עוברים, חידוש יומי של GZM, איסוף דגימות שונות ובדיקה סטרילית של כל דגימה במספר שיטות. בין השלבים הללו, הטיפול הראשוני בעוברים הוא בסי?.......
הפרוטוקול של GF Artemia הוענק כפטנט על ידי מנהל הקניין הרוחני הלאומי של סין, אשר יקל על השימוש המוגבל בשיטה לאחר קבלת אישור המחברים. המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים או כלכליים אחרים.
אנו מודים בכנות לתמיכה של פרויקט הכישרונות של האוניברסיטה הרפואית של צ'ונגצ'ינג (מס 'R4014 ל- DSP ו- R4020 ל- PPJ), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC, מס '32200386 ל- PPJ), סטודיו מנטור חדשנות פוסט-דוקטורט בצ'ונגצ'ינג (X7928 DSP), ותוכנית המרכז המשותף סין-סרי לנקה למחקר והדגמה של טכנולוגיית מים על ידי האקדמיה הסינית למדעים (CAS) / המרכז המשותף סין-סרי לנקה לחינוך ומחקר על ידי CAS.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
AB-GZM | Amphotericin:Solarbio; kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio. | Amphotericin:CAS:1397-89-3; kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313. | 49.6 mL GZM, 50 µL amphotericin stock solution (250 µg/mL), 25 µL kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 µL ampicillin stock solution (20 mg/mL). |
1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes | biosharp | BS-15-M | To collect samples, and hold agents |
2.4 g/L NaClO | XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. | CAS: 7681-52-9 | Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution. |
6-well plates, 24-, 48- well plates | LABSELECT | 11112 | To culture fish |
Aeronomas | NCBI database | No.MK178499 | 2019-JPP-ESN |
Anaerobic TSA plates | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx. | tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0. | The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system. |
Anaerobic work station | GENE SCIENCE | E200G | Bacterial isolation, sterile testing |
Analysis | GraphPad Prism 5 | v6.07 | To analysis the data |
API 20 E kits | BioMerieux SA, France | No.1005915090 | Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism |
Artemia (Brine shrimp) | Shangjia Aquarium Co., Ltd. | Aquamaster brand | Artemia cysts, and brine shrimp eggs |
Auto cycle system for fish culture | Ningbo Hairui Technology Co., Ltd | No Cat | Maintain the fish |
Autoclave | Zeal Way | G154DWS | Prepare the materials |
BHI Aerobic | Coolaber | Cat#PM0640 | BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder. |
BHI Anaerobic | Coolaber | Cat#PM0640 | BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system. |
Biochemical incubator | LongYue Co., Ltd | SPX | For fish and plates |
Biosafety cabinet | Haier | HR40-IIA2 | Sterile treatment and testing |
Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO | XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. | CAS: 7681-52-9 | Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water. |
Blood plates | sheep blood:Solarbio | Cat. NO. TX0030 | Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates. |
Cell culture flask | Corning | 430639 | To culture fish |
CM-Dil dyes | Molecular Probes | Cat#C7000 | To label the bacteria |
Constant temperature shaking incubator | Peiving Co., Ltd | HZQ-X100 | Bacterial culture |
Database | NCBI | Bacteria and Archaea database | Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/ |
Disposable Pasteur pipette | biosharp | bs-xh-03l | Used to change water, and transfer eggs |
Disposable petri dish | biosharp | BS-90-D | To culture fish |
DNA kits | Solaribio | Cat#D1600 | Bacterial genomic DNA extraction kits |
Electric pipette | SCILOGEX | Levo me | Change water |
Exiguobacterium | NCBI database | No.MK178504 | 2019-JPP-ESN |
GZM | Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd. | No Cat | Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L. |
Laboratory pure water system | Hitech Co., Ltd | Prima-S15 | Prepare the agents |
Microscope | Nikon | SMZ18 | With fluorescent light to observe fish larvae |
PCR kits | TIANGEN | Cat#ET101 | Taq DNA Polymerase kit |
Pipette | LABSELECT | sp-013-10 | Change water |
Povidone iodine (PVP-I) | Aladdin | Lot#H1217005 | Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water. |
Timing converter | PinYi Co., Ltd | AL-06 | To regulate the light |
TSA plates | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx. | tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0. | TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder. |
TSB Aerobic | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; | tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; | TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl. |
TSB Anaerobic | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; | tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; | TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system. |
Ultra-clean workbench | Airtech | SW-CJ-2FD | Sterile treatment and testing |
Ultra-pure flow system for fish culture | Marine Biological Equipment company | No Cat | Produce water for fish |
Vibrio | NCBI database | No.MK178501 | 2019-JPP-ESN |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved