כאן אנו מציגים פרוטוקול המפרט רכישה, עיבוד וניתוח של סדרת ניסויי NMR שמטרתם לאפיין אינטראקציות חלבון-גליקן בתמיסה. מתוארות רוב המתודולוגיות הנפוצות המבוססות על ליגנדות וחלבונים, אשר ללא ספק תורמות לתחומי הגליקוביולוגיה המבנית ומחקרי הזיהוי המולקולרי.
האינטראקציות של גליקנים עם חלבונים מווסתות אירועים רבים הקשורים לבריאות ומחלות. למעשה, הקמת אירועי הכרה אלה והשלכותיהם הביולוגיות קשורים קשר הדוק למבנים התלת-ממדיים של שני בני הזוג, כמו גם לתכונותיהם הדינמיות ולהצגתם על תאי התא המתאימים. טכניקות NMR הן ייחודיות להתרת מאפיינים אלה, ואכן, מתודולוגיות מגוונות מבוססות NMR פותחו ויושמו כדי לנטר את אירועי הקישור של גליקנים עם הקולטנים הקשורים אליהם. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים לרכישה, עיבוד וניתוח של שתיים ממתודולוגיות ה- NMR החזקות ביותר המשמשות בתחום הגליקוביולוגיה של NMR, 1H-Saturation Transfer Difference (STD) ו- 1 H,15N-Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) ניסויי טיטרציה, המציעים מידע משלים מנקודת המבט של גליקן וחלבון, בהתאמה. ואכן, כאשר הם משולבים הם מציעים ערכת כלים רבת עוצמה להבהרת ההיבטים המבניים והדינמיים של תהליכי זיהוי מולקולרי. גישה מקיפה זו משפרת את הבנתנו את יחסי הגומלין בין גליקן-חלבון ותורמת לקידום המחקר בתחום הגליקוביולוגיה הכימית.
זיהוי מולקולרי של גליקנים חיוני לתהליכים רבים הקשורים לבריאות ולמחלות. הספציפיות והסלקטיביות של קולטנים ביולוגיים (לקטינים, נוגדנים, אנזימים) עבור גליקנים תלויה במידה רבה בהתאמת האיזון הרעוע בין המרכיבים השונים של אנתלפיה (CH-π ואן דר ואלס, קשרי מימן, אלקטרוסטטיקה) ואנטרופיה (הידרופוביות, דינמיקה, המסה-המסה)1.
בהתחשב במגוון הכימי הגדול ובאופי הדינמי של גליקנים, שיטות NMR נמצאות בשימוש נרחב לניתוח אינטראקציות גליקן במשך יותר מ -25 שנה2, שכן מתודולוגיות אלה מספקות מידע מעולה על אירועי זיהוי מולקולרי עם פרטים מדויקים, ברזולוציה אטומית 3,4, גם כאשר לא ניתן לאחזר את ראיות האינטראקציה הנדרשות על ידי שימוש במתודולוגיות אחרות. כנקודת מפתח, NMR הוא רב-תכליתי ומאפשר לחקור אירועים דינמיים, ברמה האטומית, בסקאלות זמן שונות, המהווים את הטכניקה הטובה ביותר ללא ספק לחקר המבנה, הקונפורמציה והדינמיקה של גליקנים בתמיסה. עם זאת, התרת מידע זה עשויה להיות תהליך מורכב למדי הדורש שימוש באסטרטגיות מוגדרות היטב יחד עם ניתוח נתונים זהיר5.
טכניקות NMR הן מגוונות, ואכן, ישנן מתודולוגיות רבות שניתן להשתמש בהן כדי לפענח אינטראקציות גליקן-חלבון6. אנו מתארים כאן שתי גישות NMR בסיסיות המשמשות כיום לפענוח אינטראקציות קולטן גליקן 7,8, תוך שימת דגש על האופן שבו ניתן להתיר את ההצגה של אפיטופ המפתח גליקן כמו גם את אתר קישור החלבונים9.
בכל אירוע זיהוי מולקולרי, כאשר קולטן נקשר לליגנד נתון, מתרחש תהליך חילופי כימיקלים המשפיע על פרמטרים רבים של NMR של המשתתפים בקישור10. לכן, מנקודת המבט של NMR, ניתן לעקוב אחר האינטראקציה מנקודת המבט של ליגנד הגליקן או מזה של קולטן החלבון11. באופן כללי, קולטן החלבון הוא ביומולקולה גדולה (תנועה סיבובית איטית, עם קצב בציר הזמן, ולכן הרפיה רוחבית מהירה), בעוד שהגליקן המקיים אינטראקציה יכול להיחשב כמולקולה בגודל קטן-בינוני (תנועה סיבובית מהירה, עם קצב בציר הזמן ps, והרפיה רוחבית איטית)12. מנקודת מבט סטנדרטית, אותות ה-NMR של הגליקן צרים, בעוד אלה של הקולטן רחבים13.
שיטות NMR מבוססות ליגנד מסתמכות על השינוי הדרמטי שחווים פרמטרים רבים של NMR גליקני בעת מעבר מהמצב החופשי למצב המוגבל14. STD-NMR היא טכניקת ה-NMR הניסיונית הנפוצה ביותר להערכת תכונות קשירת גליקן מגוונות15, החל מהסקת קיומה של קשירה במצב תמיסה ועד לקביעת אפיטופ קשירת גליקן; כלומר, האטומים של הליגנד הנמצאים במגע עם קולטן החלבון16.
לחלופין, שיטות NMR מבוססות קולטן מנטרות את השינויים המתרחשים באותות של קולטן החלבון בנוכחות הגליקן ביחס לאלה שנרשמו עבור מצב apo17. אלה מתמקדים בעיקר בסינון הפרעות השינוי הכימי של אותות החלבון בין שני המצבים. הניסוי הנפוץ ביותר הוא 1 H-15N HSQC, או חלופות TROSY18.
השילוב של שתי הגישות מאפשר יישום תמ"ג במערכות רבות ומגוונות המציגות מגוון רחב של זיקות. עם זאת, עבור שיטות NMR מבוססות קולטן, בניגוד לאלה המבוססות על ליגנד, כמות גדולה יחסית של חלבון מסיס, לא מצטבר ויציב מסומן איזוטופ (15N) חייב להיות זמין.
נתאר כאן את שתי השיטות, תוך הדגשת נקודות החוזק והחולשה שלהן. שים לב שהשלבים הבסיסיים המתוארים בפרוטוקול משמשים דוגמאות לשימוש בספקטרומטרים של Bruker. כתוצאה מכך, שמות הפקודות והפרמטרים מתיישרים עם אלה המשמשים ב- TopSpin (תוכנת בקרת הספקטרומטרים של Bruker).
1. הפרש העברת רוויה NMR (STD-NMR)
הערה: השורות הבאות מתארות נהלים בסיסיים לרכישה, עיבוד וניתוח של ניסויי STD-NMR. צעדים אלה משמשים להדגמת התועלת של הטכניקה לאיתור קשירת ליגנדים ולהבהרת אפיטופ קשירת הליגנד. להבנה מעמיקה יותר של התכנון והרכישה של ניסויי NMR, עיין במדריך היצרן המתאים המצורף למכשיר ה- NMR.
2. 1ניסויי H-15N HSQC
הערה: השורות הבאות מפרטות את השימוש בניסויי H-15N HSQC 1 כדי לעקוב אחר השינויים בשינויים הכימיים של תהודה של 1H ו- 15N NMR של הקולטן (לקטין) בתגובה לנוכחות כמויות הולכות וגדלות של ליגנד (אוליגוסכריד)19. ניתוח Chemical Shift Perturbation (CSP) המבוסס על הנתונים שחולצו הוא בעל ערך רב לזיהוי שותפים קושרים אך גם למיפוי ממשק קשירת החלבונים ולקביעת זיקות קשירה. להבנה מעמיקה יותר של התכנון והרכישה של ניסויי NMR, עיין במדריך היצרן המתאים המצורף למכשיר ה- NMR.
במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול לניצול ניסויים מסוג 1H-STD NMR ו-1 H-15N HSQC כדי לפענח את פרטי האינטראקציה הקושרת בין לקטינים ואוליגוסכרידים קטנים. התוצאות שהתקבלו בניתוח הזיהוי המולקולרי של LacNAc על ידי hGalectin-7 (hGal-7) כלולות, ומשמשות דוגמה להמחשה ליישום מוצלח של הפרוטוקול וליעילות של מתודולוגיות NMR אלה לחקר הפרטים הקטנים של תהליך הזיהוי המולקולרי. איור 3 מראה אתספקטרום 1 H-STD NMR עבור האינטראקציה של LacNAc עם hGal-7. קיומם של אותות STD NMR מצביע על קשירה (איור 3A). יתר על כן, רק האותות השייכים לפרוטונים הנמצאים במגע הדוק עם החלבון מופיעים, מה שמאפשר את תיחום האפיטופ הקושר (איור 3B). איור 4 מדגיש כיצד ספקטרום H-15N HSQC 1של חלבון יכול לשמש כטביעת האצבע שלו, ואיור 5 מדגים את היישום של ניסויי טיטרציה של 1 H-15N הטרו-גרעיני בקוהרנטיות קוונטית יחידה (HSQC) כדי להגדיר את הפרעות השינוי הכימי של קבוצותאמיד עמוד השדרה h Galectin-7 בעת קשירת LacNAc. נתונים אלה לא רק חושפים את קיומה של אינטראקציה, אלא גם משרטטים את ממשק הקשירה של הלקטין. איור 6 מדגים כיצד ניתוח נתוני הטיטרציה מאפשר להעריך את זיקת הקישור של LacNAc על ידי hGalectin-7, אשר נמצא בטווח המיקרומולרי הגבוה. ממצא זה עולה בקנה אחד עם התוצאות המתקבלות באמצעות טכניקות חלופיות.
איור 1: בחירת תדר התהודה. 1ספקטרום H-NMR של LacNAc:hGal-7 יחס 50:1 במי מלח חוצצי פוספט ב-pH 7.4. אותות של ליגנד (LacNAc) מוגבלים באזור בין 2.0-5.2 ppm. תדירות הרוויה נבחרת בקפידה כדי להבטיח היעדר פרוטוני ליגנד בטווח של 1-2 ppm, מה שמאפשר הקרנה סלקטיבית של פרוטוני החלבון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ניסוי STD NMR. ייצוג סכמטי של ניסוי STD: הספקטרום הראשון (off-resonance) משמש כנקודת ייחוס ואילו בספקטרום השני (on-resonance) מבוצעת רוויית חלבונים. הרוויה מופצת ביעילות על פני החלבון כולו ומועברת לפרוטוני הליגנד במגע הדוק עם החלבון. ספקטרום ההבדל המתקבל (ספקטרום STD) מניב רק את התהודה שחוו רוויה. ניתוח ניסוי STD מאפשר מיפוי אפיטופי של הסוכר הקושר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח מחייב מנקודת מבטו של הליגנד. (A) סופראימפוזיציה של ספקטרום מחוץ לתהודה וספקטרום STD-NMR של 1H עבור האינטראקציה של LacNAc עם hGal-7. בספקטרום מחלות מין, רק אותות השייכים לפרוטונים הנמצאים במגע הדוק עם החלבון מופיעים. הביאור של תהודה 1H של הליגנד מדווח בספקטרום מחוץ לתהודה. (B) העוצמות היחסיות של מחלות מין מופו למבנה הכימי של LacNAc. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ספקטרום H-15N HSQC 1של חלבון מייצג את טביעת האצבע שלו. (A) 1 H-15N HSQC ספקטרום של 100 מיקרומטר של hGal-7 בצורת apo. הספקטרום נרשם ב 25 ° C. כמה פסגות צולבות NH היו מבוארות עם התווית של חומצת האמינו המתאימה להם. (B) כל זוג NH מציג שינוי כימי ייחודי התלוי בסביבה הכימית וכתוצאה מכך, במבנה התלת-ממדי של החלבון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ניתוח קשירה מנקודת המבט של החלבון. (A) מוצגת סופר-אימפוזיציה של ספקטרום H-15N HSQC 1שנרשם לטיטרציה של LacNAc לתמיסת HGal-7. בחינה של הספקטרה, שבה כמה פסגות צולבות חוות שינויים כימיים, מצביעה בבירור על אינטראקציה. (B) תרשים הפרעות ההסטה הכימיות המרביות (maxCSP) של אותות האמיד בעמוד השדרה שהוסקו מהטיטרציה של LacNAc (15 שווה ערך) עם hGal-7. (C) חומצות האמינו המוטרדות ביותר של hGal-7, על פי ניתוח CSP, ממופות למבנה PDB 5gal. במודל התלת-ממדי, הצבע האדום מתייחס לערך CSP מעל 2σ, ואילו הצבע הוורוד מתייחס לערכים בין 1σ ל-2σ. האזור הצבעוני מייצג ככל הנראה את אתר הקשירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: קביעת KD בהתבסס על ניסויי טיטרציה H-15N HSQC. (A) ייצוג התבנית שלטיטרציה מבוססת H-15N HSQC בהתאם לשער החליפין הכימי בסקאלת הזמן של NMR של המערכת במחקר (מהיר, בינוני או איטי). משטר החלפה מהיר נצפה במקרה של אינטראקציה LacNAc/hGal-7. (B) עקומת התאמה ואומדן KD המתקבל מניתוח CSP בריכוזי ליגנדים משתנים עבור מערכת המודל של hGal-7 ו- LacNAc disaccharide. KD המשוער מדווח עם השגיאה המתאימה כממוצע של הנתונים עבור 20 חומצות אמינו שונות; (C) קטעים של ספקטרום N-HSQC של 1 H,15המציגים את השינוי של פסגות צולבות נבחרות במהלך הטיטרציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
הפרש העברת רוויה NMR (STD-NMR) הפך לשיטת NMR הנפוצה והמגוונת ביותר לחקר אינטראקציות ליגנד-חלבון. כפי שמוצג לעיל, היא מסתמכת על תופעת העברת הרוויה, והמערך הניסויי כרוך ברכישה של שני ספקטרום חד-ממדי (1D) 1H: ספקטרום התהודה¬ וספקטרום ¬off-resonance. במהלך ניסוי התהודה, הרוויה של פרוטונים ספציפיים של החלבון מושגת על ידי הפעלת רכבת של פולסים בתדרי רדיו בהספק נמוך במהלך תקופה מסוימת (זמן הרוויה נע בדרך כלל בין 1-3 שניות). כדי למנוע רוויה ישירה של הליגנד, התדירות והאורך של פעימות הרוויה מותאמים להקרנה סלקטיבית של פרוטונים ספציפיים של החלבון; כלומר, יש ליישם אותם בתדר פנוי מכל אותות הליגנד ובאורך מתאים (איור 1). ככלל אצבע לפעימות רוויה של 50 אלפיות השנייה, יש לשמור על הפרש של 1 חל"מ מאזור הרוויה לאותות הליגנד הקרובים ביותר. בדרך כלל, פעימות רוויה סלקטיבית המיושמות על האזור האליפאטי של החלבון מספקות השפעות רוויה מוגברות. לחלופין, פרוטונים ארומטיים (6-7 ppm) יכולים להיות מוקרנים גם אם מולקולת הליגנד אינה מכילה אותות ארומטיים. זה מאוד שימושי עבור גליקנים המתרחשים באופן טבעי, כפי שהם אינם נושאים קבוצות ארומטיות. ברגע שאזור מסוים של החלבון מוקרן באופן סלקטיבי, הרוויה מתפשטת לאורך החלבון באמצעות הרפיה צולבת דיפולרית 1 H-1H (דיפוזיית ספין). בסופו של דבר, הרוויה מגיעה לפרוטוני החלבונים באתר הקשירה, אשר מועברים לאחר מכן לפרוטוני הסוכר הנמצאים במגע הדוק (r < 5 Å) עם הקולטן באמצעות אינטרמולקולרי 1 H-1H NOEs. ברור שעוצמת האותות של פרוטוני הליגנד הרווי פוחתת. לאחר קבלת הרוויה, בשל הקינטיקה המחייבת, הליגנדות הקשורות באופן ארעי (נדרש חילוף מהיר) מתנתקות ומידע הרוויה נצבר במצב החופשי. בשל התהליך הזה, ספקטרום התהודה של NMR מציג אותות מופחתים (איור 2).
כדי להציג בבירור הפרעה בעוצמה זו של גרעיני 1H של גליקן קשירה, נרכש ספקטרום NMR של פרוטון בקרה (off-resonance) שבו הרוויה מוחלת הרחק מכל קולטן או אות פחמימות (בדרך כלל בין 40-100 ppm), באותם תנאים. הספקטרום ה-1D שהוחסר בין ה-off-resonance ל-on-resonance מראה באופן בלעדי את האותות של גרעיני 1Hשל הליגנד ששינו את העוצמות: אלה שהיו קרובים מספיק לאתר הקישור של הקולטן כדי לקבל את המגנטיזציה (איור 2).
עם זאת, לא כל גרעיני 1H של פחמימה קשורה מקבלים את אותה כמות רוויה. תיאורטית, העברת המגנטיזציה מהקולטן לליגנד הכבול היא תלוית מרחק (1/r6). משמעות הדבר היא שעוצמות הרוויה המועברת בין גרעיני גליקן 1H מכילות מידע על הקרבה המרחבית בין פרוטוני הליגנד לאלה של הקולטן, ועוצמות STD NMR גדולות יותר עבור אותם פרוטונים הקרובים יותר לקולטן. בהתאם לכך, ניסוי STD NMR מאפשר גם לקבוע את אפיטופ הקישור של הפחמימה (איור 2 ואיור 3) מאחר שפרוטונים של הליגנד היושב קרוב יותר לפני השטח של החלבון מראים עוצמות גבוהות יותר מאלה שאינם משתתפים ישירות בקשירה.
הניסוי יכול להיות מיושם על מערכות עם זיקה חלשה-בינונית, לעתים רחוקות על מערכות עם זיקות חזקות בתחום μM או nM נמוך. אכן, היא דורשת שקצב הדיסוציאציה יהיה מהיר בסקאלת זמן ההרפיה. אחרת, מידע העברת הרוויה הולך לאיבוד באמצעות הרפיה לפני שהליגנד מתנתק.
מצד שני, ניסויי NMR מבוססי חלבון הם ייחודיים לפענוח אינטראקציה ליגנד-חלבון עם דיוק ברמת חומצות אמינו מבלי לפתור את מבני הרזולוציה האטומית. הוא בוחן ישירות תופעות של זיהוי מולקולרי בתמיסה ללא צורך בהתגבשות משותפת. מיפוי ניתוח CSP הוא בעל עוצמה יוצאת דופן לגילוי ליגנדות ולמיפוי אתר קשירת החלבונים (איור 4 ואיור 5). שיטה זו ישימה לכל טווח של זיקות בין תחום mM ו- nM, אפילו עבור מערכות שבהן שער החליפין איטי בסקאלת זמן השינוי הכימי21.
עם זאת, גישה זו כנראה לא תעבוד עבור חלבונים עם משקל מולקולרי מעל 30-40 kDa בשל בעיות הרפיה. לאחר מכן ניתן להשתמש בחלופה18 של TROSY, והיא חזקה במיוחד בשילוב עם דאוטרציה של חלבונים. יתר על כן, החלבון צריך להיות מסומן באופן אחיד עם 15N (ועוד מדגם כפול מסומן עם 13C ו 15N כדי להיות מסוגל להשלים את המשימה עמוד השדרה הנדרש). לכן, תנאי ביטוי החלבון, כולל מערכת הביטוי המתאימה צריכים להיות אופטימליים כדי להיות מסוגלים לקבל כמויות מיליגרם של חלבון. חלבונים המציגים נטייה לאוליגומריזציה או צבירה גם אינם מתאימים לניתוח זה. המכשיר המשמש כאן להקלטת נתוני NMR הוא ספקטרומטר Bruker 800 MHz המצויד בקריופרוב TCI. יהיה מאתגר מאוד להשתמש במתודולוגיה זו באמצעות מכשירים מתחת ל-600 מגה-הרץ או ללא בדיקה קריוגנית.
למחברים אין מה לחשוף.
אנו מודים Agencia Estatal de Investigación של ספרד עבור Severo Ochoa Center of Excellence Accreditation CEX2021-001136-S, במימון MCIN/AEI/10.13039/ 501100011033, ו- CIBERES, יוזמה של Instituto de Salud Carlos III (ISCIII, מדריד, ספרד). אנו מודים גם לנציבות האירופית על פרויקט GLYCOTWIN.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
5 mm Shigemi microtube set mat | CortecNet SAS | S30BMS-005B | |
Alpha-Lactose-Agarose | Sigma-Aldrich Química S.L. | 7634-5ML | |
Ammonium chloride (15 N, 99%) | LC-0179-N-50G | Tracer Tecnologías Analíticas S.L | |
Ampicillin (Sodium Salt) | Melford Laboratories LTD | A40040 | |
BIOVIA Discovery studio | BIOVIA, Dassault Systèmes | ||
BL21(DE3) Chemically Competent Cells | Merck Life Science, S.L.U. | CMC0014-40X40UL | |
Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-22R | |
D2O | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-1000 | |
Incubator | Eppendorf | Innova 42 | |
IPTG (Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside) | VWR International Eurolab S.L. | VW437144N | |
LacNAc | Elicityl | GLY008 | |
Luria Bertani (LB) Broth | Merck Life Science, S.L.U. | 3397-1KG | |
Matraz Erlenmeyer B N 5000 CC | VWR International Eurolab S.L. | 214-1137 | |
PBS 10x | Bio-Rad | 1610780 | |
PyMOL | PyMOL Molecular Graphics System | Version 2.0 Schrödinger | |
Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | VC 505 | |
Superconducting NMR magnet | Bruker | 600 MHz AVANCE III | |
Superconducting NMR magnet | Bruker | 800 MHz AVANCE III |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved
We use cookies to enhance your experience on our website.
By continuing to use our website or clicking “Continue”, you are agreeing to accept our cookies.