השראת מושבות קטנות בקנדידה מבריקה באמצעות טיפול פוטודינמי בתיווך בנגל

Summary

המשמעות של מושבות קטנות בקנדידה spp. עמידות לתרופות לא נחקרה במלואה. טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי (aPDT) מציע אסטרטגיה מבטיחה נגד זיהומים פטרייתיים עמידים לתרופות. מחקר זה מדגים כי aPDT בתיווך בנגל ורד מבטל ביעילות קנדידה גלברטה וגורם למושבות קטנות, ומציג הליך ייחודי.

Abstract

מול שיעור תמותה של 40% בחולי קנדידמיה, קנדידה עמידה לתרופות והמוטציות הקטנות שלהם נותרו אתגר טיפולי גדול. טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי (aPDT) מכוון למבנים פטרייתיים מרובים, בניגוד לאנטיביוטיקה/אנטי-פטרייתיות, מה שעלול לסכל עמידות. שיטות מסורתיות לגרימת מושבות קטנות מסתמכות על אתידיום ברומיד או פלוקונזול, שיכולים להשפיע על רגישות לתרופות ותגובות לחץ. מחקר זה בדק את היישום של אור ירוק (שיא 520 ננומטר) ופוטונסיטייזר ורד בנגלי (RB) כדי להילחם במבודד קנדידה גלברטה עמיד לתרופות. הממצאים הראו כי טיפול ב- aPDT עיכב באופן משמעותי את צמיחת התאים (הפחתה של ≥99.9%) וגרם ביעילות להיווצרות מושבות קטנות, כפי שמעידה הקטנת גודל ואובדן צביעת מחוון חיזור מיטוכונדריאלי. מחקר זה מספק ראיות ראשוניות לכך ש-aPDT יכול לגרום למושבות קטנות בזן C. glabrata עמיד לתרופות במבחנה, ומציע גישה בעלת פוטנציאל טרנספורמטיבי למאבק בזיהומים פטרייתיים עמידים.

Introduction

זיהומים פטרייתיים, במיוחד אלה הנגרמים על ידי קנדידה אלביקנס וקנדידה גלברטה עמידה יותר ויותר לתרופות, מהווים איום עולמי רציני¹. זיהומים אלה יכולים להיות קטלניים, במיוחד עבור חולים מאושפזים ואלה עם מערכת חיסונית מוחלשת. עלייה בעמידות האנטי פטרייתית מאיימת על השליטה בקנדידה פולשנית, זיהום פטרייתי חמור עם תמותה גבוהה, במיוחד מקנדידה אלביקנס². זנים עמידים מעכבים טיפול יעיל, מה שעלול להגדיל הן את המורכבות והן את שיעורי התמותה. במחוז אלאמדה, קליפורניה, ארה"ב, C. glabrata הפך למין הפולש הנפוץ ביותר³. שינוי זה בשכיחות ובתפוצה של מיני קנדידה עשוי להיות מושפע משיטות בריאות מקומיות, דמוגרפיה של מטופלים, שימוש בחומרים אנטי פטרייתיים ושכיחות גורמי סיכון לזיהומי קנדידה.

מוטנטים קטנים בקנדידה, חסרי מיטוכונדריה פונקציונלית, חושפים כיצד אברון זה משפיע על התגובה לתרופות, אלימות ועמידות ללחץ ^4,5. C. glabrata יוצר בקלות מושבות אלה, רוכש רגישות לפוליאנים תוך שהוא מאבד אותו לאזולים⁶. רגישות לאזול ותפקוד נשימתי קשורים זה לזה באופן מורכב, עם נשימה מופחתת המובילה להתנגדות באמצעות אובדן DNA מיטוכונדריאלי⁷. מושבות קטנות של C. glabrata עם עמידות לאזול בודדו מדגימות צואה אנושיות ממושתל מח עצם שעבר טיפול פלוקונזול⁸ ומבקבוקי תרבית דם של חולים עם זיהומים בזרם הדם⁹. ההשלכות האפשריות שלהם על עמידות לתרופות, אלימות ותגובה ללחץ מדגישות את המשמעות הקלינית שלהם. בנוסף, התכונות הייחודיות שלהם הופכות אותם לכלים רבי ערך לחקר שאלות בסיסיות בביולוגיה מיטוכונדריאלית⁵. ככל שהמחקר על מוטנטים קטנים נמשך, היישומים שלהם במחקר קליני ובסיסי כאחד צפויים להתרחב.

מחקר זה גילה כי טיפול פוטודינמי (PDT) יכול לגרום למושבות קטנות ב - C. glabrata, להרחיב את מגוון השיטות מעבר לטכניקות המסורתיות של חשיפת C. glabrata לאתידיום ברומיד או fluconazole.

Protocol

1. טיפוח של C. glabrata

הערה: C. glabrata עמיד לתרופות מרובות (C2-1000907) העמיד לרוב הסוכנים האנטי פטרייתיים, כולל fluconazole, משמש לניסויים. ייתכן שיהיה צורך להתאים את תנאי הניסוי לזן הספציפי, שכן ייתכנו שינויים בין זנים שונים. כל הניסויים השתמשו בקנדידה לוג-פאזה שגדלה ב-25 מעלות צלזיוס (מחקה זיהום טבעי) לעקביות. חוסר הקורים של C. glabrata מפשט את הכימות בהשוואה ל - C. albicans, היוצר קורים ב- 37 ° C¹⁰.

1. כדי להכין תרבית לוג-פאזה של C. glabrata, בחרו מושבה בודדת מצלחת אגר והעבירו אותה למבחנה מזכוכית עם 3 מ"ל של שמרים סטריליים פפטון דקסטרוז (YPD) בינוני (ראו טבלת חומרים). יש לדגור במשך 14-16 שעות ב-25°C עם רעידות (155 סל"ד, זווית של 45° כדי להגביר את העברת האוויר לתווך).
2. לאחר הדגירה, יש לדלל את התרבית עם YPD טרי ל-OD₆₀₀ של 0.1 בטכניקה סטרילית. יש לדגור ב-25°C למשך 6 שעות עם רעידות ב-155 סל"ד. אמת את שלב היומן של C. glabrata על ידי מדידת OD₆₀₀. כוון 0.65-1.00, אשר מתאים 1 × 10 7-1.5 × 10⁷ תאים / מ"ל.

2. אינדוקציה של מושבות קטנות על ידי אתידיום ברומיד, fluconazole וטיפול פוטודינמי

1. השראת מושבה קטנה Ethidium bromide
   1. התאם תרחיף שמרים ל- OD₆₀₀ של 0.1 (5 × 10⁶ תאים/מ"ל) עם YPD לנפח סופי של 3 מ"ל, ולאחר מכן הוסף 30 מיקרוליטר של ציר אתידיום ברומיד (10 מ"ג/מ"ל) (ראה טבלת חומרים) לקבלת ריכוז סופי של 100 מיקרוגרם/מ"ל.
   2. יש לדגור על מתלי השמרים למשך הלילה (16-18 שעות) ב-25°C, 155 סל"ד, זווית של 45°. התאם ל- OD₆₀₀ של 0.65 (1 × 10,⁷ תאים/מ"ל). בצע סדרת דילול פי 10 בצלחת של 96 בארות על ידי הוספת 20 μL של תרחיף השמרים המותאם ל- 180 μL של PBS לכל באר. זה יוצר שישה דילולים הנעים בין ^10-1 ל ^10-5.
   3. בחר 4 גורמי דילול (למשל, 10⁰, 10¹, 10² ו- 10³) וצלחת 3 טיפות (20 μL) כל אחד על 4 רבעים של לוחות אגר YPD (משולש).
   4. לדגור על צלחות לילה ב 37 °C (77 °F). בחר רבעים עם 5-80 מושבות מהדילולים שנבחרו בעבר עבור צביעת טריפנילטטרזוליום כלוריד (TTC)¹¹ (ראה שלב 3). סרוק לוחות ברזולוציה של 1,200 dpi באמצעות סורק אופטי בצבע מלא של 48 סיביות.
2. אינדוקציה של מושבה קטנה Fluconazole
   הערה: כדי לזרז את התהליך, השתמש בתאי T3 (תערובת של תאים נורמליים וקטנים המתקבלים לאחר 3 טיפולי RB-PDT; ראה שלב 2.3) להיווצרות מושבה קטנה הנגרמת על ידי פלוקונזול. הסיבה לכך היא שטיפול סטנדרטי בדרך כלל גורם להיווצרות איטית יותר.
   1. הכינו וכווננו תרחיף של תאי שמרים כמתואר בשלב 2.1.1.
   2. לדגור לילה (16-18 שעות) ב 25 °C (75 °F). התאם שוב את OD₆₀₀ ל- 0.1.
   3. העבר 1 מ"ל של המתלה המותאם לצינור סטרילי של 5 מ"ל.
   4. טבלו צמר גפן סטרילי (באורך 15 ס"מ, עם קצה בגודל 0.9X2.6 ס"מ, ראו טבלת חומרים) בתרחיף השמרים, תוך הקפדה על מגע עם תחתית הצינור ופיתול לסילוק עודפי נוזלים מדופן הצינור.
   5. מכינים את הצלחות במכסה המנוע בעזרת אגר מולר-הינטון (ראו טבלת חומרים).
   6. ספוג את הכותנה קדימה ואחורה על האגר, סובב 60° פעמיים, ולאחר מכן ספוג את ההיקף לקבלת כיסוי אחיד.
   7. עקרו מלקחיים מעל להבה במשך 1-2 שניות, אפשרו להם להתקרר לזמן קצר, ואז השתמשו בהם כדי להרים את הדיסקים הריקים.
   8. חלק את הלוח לשלושה סקטורים שווים באמצעות סמן. מקם דיסק ריק אחד במרכז כל מגזר.
   9. הוסף 12.5 μL fluconazole ציר (2 מ"ג / מ"ל, ראה רשימת חומרים) לכל דיסק (25 מיקרוגרם / דיסק), לערבב היטב כדי למנוע בועות, ולדגור ב 37 ° C במשך 20-24 שעות.
   10. בצע את צביעת TTC (ראה שלב 3). סרוק לוחות ברזולוציה של 1,200 dpi באמצעות סורק אופטי בצבע מלא של 48 סיביות.
3. PDT מושבה קטנה אינדוקציה
   הערה: פטריות שונות עשויות לייצר מספר שונה של מושבות קטנות לאחר PDT. זנים מסוימים עשויים שלא לייצר כלל.
   1. הכן את מערכת aPDT.
      הערה: הליך ההתקנה עבור התקן מערכת aPDT עוקב אחר השיטה שדווחה על-ידי Hung et al¹². בקצרה, מערכת aPDT מורכבת ממערך LED ירוק עם שיא של 520 ננומטר (ראה טבלת חומרים), אור מאיר מלמטה עם יישור טוב עם כל באר של צלחת 96 בארות.
   2. כוונן את תרחיף תאי השמרים בתווך YPD ל- OD₆₀₀ של 0.65 (כ- 1 × 10⁷ תאים/מ"ל).
   3. ערבבו 1 מ"ל של תרחיף שמרים עם 111 מיקרוליטר של 2% ורד בנגלי (RB, איור 1) (ראו טבלת חומרים) בצינור עגול כדי לתת ריכוז RB סופי של 0.2%. דוגרים על התערובת ב-25°C למשך 15 דקות, ומסובבים אותה בזווית של 45° ב-155 סל"ד.
   4. מעבירים את התערובת לצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל וצנטריפוגה במהירות של 16,100 x גרם למשך 2.5 דקות (בטמפרטורת החדר).
   5. השליכו את הסופרנאטנט וגרדו בעדינות את הצינור חמש פעמים על רצפת מכסה המנוע כדי לתלות מחדש את הכדור.
   6. שטפו את המתלים עם 1x PBS ארבע פעמים כדי להסיר את כל ה-RB. כל שטיפה מלווה בהשעיה של הגלולה עם מערבולות קצרות או פיפטינג להשעיה יסודית.
      1. לאחר הכביסה הסופית, להוסיף 1000 μL של PBS. הפתרון הוא בצבע ורוד בהיר. מעבירים 200 μL של תרחיף שמרים שטוף RB לכל אחת משלוש בארות בצלחת 96 בארות (משולש).
   7. מקם את לוח 96 הקידוחים על מערכת התאורה הפוטודינמית עם נורות LED המאירות אור ירוק מלמטה. כבו את אורות החדר כדי להבטיח תאורה אחידה ולמנוע הפרעות. הפעל את מערכת תאורת ה- LED כדי לספק מינון PDT של 4.38 J/cm² במשך 2 דקות; ודא שהמערכת מיושרת כראוי עם הבארות.
   8. לאחר הקרנה, לדלל את תרחיף השמרים בצלחת 96 באר. הוסף 20 μL של תרחיף שמרים לבאר המכילה 180 μL PBS, ויוצר דילול פי 10. חזור על הפעולה עבור שאר הדילולים כדי להשיג טווח של ^10-1 עד ^10-5.
   9. בחר ארבעה גורמי דילול (למשל, ^10-2 עד ^10-5) בהתבסס על התאמת ריכוז תאי השמרים.
   10. עבור כל גורם דילול, צלחת 3 טיפות (20 μL כל אחד) לכל רביע על לוחות אגר YPD.
   11. לאחר שתרחיף השמרים נספג לחלוטין, בסביבות 10 דקות על ידי צלחות אגר, להפוך ולדגור לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
   12. הגדר T0 כקבוצת הביקורת ההורית C. glabrata ללא טיפול PDT. הכינו פטריות T0 בשלב צמיחת היומן כמתואר לעיל וחשפו אותן לאור ירוק של 4.38 J/cm² בנוכחות 0.2% RB. מצב PDT זה מעכב באופן עקבי 3 עד 3.5 לוגים של צמיחה פטרייתית.
       1. ציינו את הפטריות ששרדו כ-T1 וחשפו אותן שוב לאותו מינון PDT לאחר שהן מורחבות במבחנה לשלב גדילת בולי עץ. הפטריות ששרדו לאחר ה-PDT השני מסומנות כ-T2 וכן הלאה.
   13. למחרת, בחר רבעים עם ספירת מושבות בין 5 ל -80. ספור את מספר המושבות בכל רביע וחשב את הטיטר באמצעות הנוסחה הבאה: יחידה יוצרת-מושבה (CFU)/מ"ל = מספר מושבות (ממוצע של משולש) × גורם דילול × 50.
   14. בצע את צביעת TTC (ראה שלב 3). סרוק את הצלחת כפי שתואר קודם לכן (שלב 2.2).

3. ניתוח תפקוד מיטוכונדריאלי (בדיקת צביעת TCC)

הערה: TTC הוא מחוון חמצון-חיזור ומקבל אלקטרונים. הוא הופך לאדום כאשר תרכובות לבנות נשברות על ידי אלקטרונים¹¹. שימו לב שלא כל התאים יוצרים בהכרח מושבות נראות לעין תוך 24 שעות לאחר התרבית על צלחת אגר. מושבות עם מיטוכונדריה פונקציונלית הופכות אדומות, ואילו מושבות עם מיטוכונדריה לא תפקודית נשארות לבנות. זה מאפשר הבחנה בין מושבות עם פונקציונליות מיטוכונדריאלית שונה.

1. לאחר הטיפול, יש לדלל את מתלי הקנדידה על לוחות אגר YPD בהתאם לצפיפות התאים הרצויה כדי לקבל מושבות נפרדות להדמיה קלה ולהכתמה.
2. לאחר 24 שעות של צמיחה ב 37 °C (77 °F), מושבות גלויות נוצרות מתא יחיד. פיפטה 20 μL של 20% TTC ישירות למרכז כל מושבה.
3. לאחר ספיגה מלאה, בסביבות 10 דקות של TTC על ידי המושבות, לדגור ב 37 ° C במשך 30-40 דקות.

4. קינטיקה צמיחה של נורמלי וקטן C. glabrata

הערה: שלושה זנים של שמרים הושוו: C. glabrata C2-1000907 T0 (בידוד קליני ללא טיפול PDT), T3n (C. glabrata C2-1000907 לאחר 3 RB-PDT רצופים המציגים מושבות בקוטר ממוצע של 1.5 ± 0.8 מ"מ בדומה לתאי ההורים), ו- T3p (מושבות קטנות של C. glabrata C2-1000907 לאחר 3 RB-PDT רצופים).

1. כוונן את תרחיף תאי השמרים בתווך YPD ל- OD₆₀₀ של 0.1 (5 × 10,⁶ תאים/מ"ל) בצינור של 3 מ"ל.
2. מדוד באופן אוטומטי את OD₆₀₀ של התרבית הסטטית כל 20 דקות באמצעות קורא המיקרו-לוחות הרב-מצבי (ראה טבלת חומרים) במשך 24 שעות.

תוצאות

הנתונים מוצגים כממוצע עם שגיאת תקן ± והתקבלו משלושה ניסויים בלתי תלויים, עם לפחות טריפליקטים בכל קבוצה. נתונים ניסיוניים, כולל ספירת מושבות, מדידות OD₆₀₀ ותוצאות צביעת TTC, עברו גרפים ונותחו סטטיסטית באמצעות גרפים ותוכנות סטטיסטיות (ראה טבלת חומרים). ANOVA חד-כיווני או מבחן t ?...

Discussion

מחקר זה חושף את PDT כשיטה המדווחת הראשונה לגרימת היווצרות מושבות קטנות בקנדידה, העולה על ההשפעות המבוססות של אתידיום ברומיד ופלוקונזול. תצפית חדשנית זו מחייבת חקירה נוספת כדי לפענח את השלכותיה הן על מיגור פטריות על ידי הפחתת האלימות והן על הופעתם של מנגנוני התנגדות.

PDT בתיוו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Merck, Taipei, Taiwan	Millex, SLGVR33RS
1.5 mL microfuge tube	Neptune, San Diego, USA	#3745
20% Triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma-Aldrich, MO, USA	T8877
5 mL polypropylene round bottom tube	Corning, AZ, USA	352059
5 mL round-bottom tube with cell strainer cap	Corning, AZ, USA	Falcon, #352235
96-well plate	Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan	#16196
Agar	BRS, Tainan, Taiwan	AG012
Blank disk	Advantec, Tokyo, Japan	49005040
Centrifuge	Eppendorf, UK	5415R
Ethidium bromide solution	Sigma-Aldrich, MO, USA	E1510
Fluconazole, 2 mg/mL	Pfizer, NY, USA	BC18790248
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 7.0
Green light emitting diode (LED) strip	Nanyi electronics Co.,Ltd, Tainan, Taiwan	5050	Excitation wave: 500~550 nm
Low Temperature. shake Incubators	Yihder, Taipei, Taiwan	LM-570D (R)
Mouth care cotton swabs	Good Verita Enterprise, Taipei, Taiwan	161357
Muller Hinton II agar	BD biosciences, California, USA	211438
Multimode microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax i3x
OD600 spectrophotometer	Biochrom, London, UK	Ultrospec 10
Rose Bengal	Sigma-Aldrich, USA	330000	stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C
Sterilized glass tube	Sunmei, Tainan, Taiwan	AK45048-16100
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium	HIMEDIA, India	M1363