13C6-תיוג גלוקוז הקשור LC-MS: זיהוי של איברים ראשוניים צמחיים בסינתזת מטבוליטים משנית

Summary

השיטה שפותחה של תיוג ¹³C_6-Glucose בשילוב עם כרומטוגרפיה נוזלית ברזולוציית מסה ברזולוציה גבוהה היא רב-תכליתית ומניחה את הבסיס למחקרים עתידיים על האיברים והמסלולים העיקריים המעורבים בסינתזה של מטבוליטים שניוניים בצמחי מרפא, כמו גם ניצול מקיף של מטבוליטים שניוניים אלה.

Abstract

מאמר זה מציג שיטה חדשנית ויעילה לאישור איברים ראשוניים המעורבים בסינתזת מטבוליטים שניונית. כמטבוליט המשני החשוב ביותר בפריזפוליפילה var. yunnanensis (Franch.) יד. -Mzt. (PPY), פריז saponin (PS) יש מגוון רחב של פעילויות פרמקולוגיות PPY הוא ביקוש גובר. מחקר זה ביסס עלים, קני שורש וצרור גזע-כלי דם ¹³C_{6-גלוקוז} הזנה ולא הזנה ארבעה טיפולים כדי לאשר במדויק את האיברים העיקריים המעורבים בסינתזת פריז ספונינים VII (PS VII). על ידי שילוב ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית (LC-MS), חושבו במהירות ובמדויק היחסים של ¹³C/¹²C של עלה, קנה שורש, גזע ושורש בטיפולים שונים, ונמצאו ארבעה סוגים של יחסי שיא יונים איזוטופיים PS (M⁻): (M+1) ⁻/M⁻, (M+2) ⁻/M⁻, (M+3) ⁻/M⁻ ו-(M+4) ⁻/M⁻. התוצאות הראו כי היחס של ¹³C/¹²C בקני השורש של צרור גזע-כלי דם וקני שורש היה גבוה משמעותית מזה שבטיפול ללא האכלה. בהשוואה לטיפול ללא הזנה, היחס בין מולקולות PS VII (M+2) ⁻/M^{− בעלים} גדל משמעותית תחת טיפולי הזנה של עלים וגבעול-כלי דם. במקביל, בהשוואה לטיפול ללא הזנה, היחס בין מולקולות PS VII (M+2) ^- / M ^- בעלים תחת טיפול קנה שורש לא הראה הבדל משמעותי. יתר על כן, היחס בין מולקולות PS VII (M+2) ^- / M ^- בגזע, בשורש וקנה השורש לא הראה הבדלים בין ארבעת הטיפולים. בהשוואה לטיפול ללא האכלה, היחס בין מולקולת Paris saponin II (PS II) (M+2) ⁻/M⁻ בעלים תחת טיפול הזנת עלים לא הראה הבדל משמעותי, והיחס (M+3) ⁻/M⁻ של מולקולות PS II בעלים תחת טיפול הזנת עלים היה נמוך יותר. הנתונים אישרו כי האיבר העיקרי לסינתזה של PS VII הוא העלים. הוא מניח את הבסיס לזיהוי עתידי של האיברים והמסלולים העיקריים המעורבים בסינתזה של מטבוליטים משניים בצמחי מרפא.

Introduction

המסלולים הביוסינתטיים של מטבוליטים שניוניים בצמחים הם מורכבים ומגוונים, וכוללים איברי צבירה ספציפיים ומגוונים מאוד¹. כיום, אתרי הסינתזה הספציפיים והאיברים האחראים למטבוליטים שניוניים בצמחי מרפא רבים אינם מוגדרים היטב. עמימות זו מציבה מכשול משמעותי לקידום אסטרטגי וליישום של שיטות גידול שנועדו לייעל הן את התשואה והן את האיכות של חומרי מרפא.

ביולוגיה מולקולרית, ביוכימיה וטכניקות תיוג איזוטופים נמצאות בשימוש נרחב כדי לפענח את מסלולי הסינתזה והאתרים של מטבוליטים שניוניים בצמחי מרפא 2,3,4,5, וכל אחת מהמתודולוגיות הללו מציגה חוזקות ומגבלות ייחודיות, כגון הבדלים ביעילות ובדיוק.

Protocol

1. הכנה ניסיונית

1. ודא כי במהלך גידול הצמח, הלחות היחסית של החממה היא 75%, טמפרטורות היום / לילה הם 20 °C / 10 °C (75 °F), תקופת הצילום מורכבת מ 12 שעות ביום ו 12 שעות בלילה, ואת עוצמת האור היא 100 μmol·^m-2·^s-1. מספקים קרינה באמצעות מנורות דיודה פולטות אור (LED), תוך שמירה על מרחק של 30 ס"מ בין מנורת הלד לחופת הצמח.
   הערה: תקופת האור ועוצמת האור הם בהתאם למספר שעות השמש במהלך תקופת הגידול ביונאן. קרינה נמדדת באופן שגרתי על ידי חיישן קוונטי (ראו טבלת חומרים). בצע את השינויים הנדרשים בפרמטרים סביבתיים בהתאם למאפייני צמח המרפא. לאחר שתנאים סביבתיים אלה כוילו בקפידה בהתבסס על מאפייני הצמח ופרופיל אור השמש ה....

תוצאות

כדי לאשר שאספקת ¹³C_{6-גלוקוז} בקני שורש הייתה מוצלחת, ניתחנו עוד יותר את יחסי האיזוטופים של ¹³C/¹²C בקני שורש. יחסי האיזוטופים של ¹³C /¹²C בטיפולים 3 ו-4 היו גבוהים בהרבה מאלה של טיפול 2 (איור 1A). התוצאות הצביעו על כך ^ש-13C,_{6-גלוקוז} מטיפול 3 ו-4 ?.......

Discussion

היישום המוצלח של פרוטוקול זה תלוי במחקר מקיף של תכונות פיזיולוגיות של צמחים, רקמות, איברים ומטבוליטים משניים. גישת התכנון הניסויי המתוארת בפרוטוקול מניחה בסיס איתן לחקר המסלולים הביוסינתטיים של מטבוליטים שניוניים צמחיים. הגורמים הקריטיים בניסוי זה הם: (1) קביעת גיל השתילים הרב-שנתיים ו-(2) .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 % Formic acid water	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
13C6-Glucose powder	MERCK	110187-42-3
Acetonitrile	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
AUTOSAMPLER VIALS	Biosharp Biotechnology Company	44866
BEH C18 column	Waters,Milfor,MA	1.7μm,2.1*100 mm
CNC ultrasonic cleaner	Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd	KQ-600DE
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific, Fremont,CA	3
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific,Fremont,CA	3
Electric constant temperature blast drying oven		DHG-9146A
Electronic analytical balance	Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd	SOP
Ethanol	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44955
Fully automatic sample rapid grinder	Shanghai Jingxin Technology	Tissuelyser-48
Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer	Thermo Fisher	Delta V Advantage
Hoagland solution	Sigma-Aldrich	H2295-1L
Hydroponic tank	JRD	1020421
Isodat software	Thermo Fisher Scientific	3
Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry	Agilent Technology	Agilent 1260 -6120
Nitrogen manufacturing instrument	PEAK SCIENTIFIC	Genius SQ 24
Organic phase filter	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	44890
Oxygen pump	Magic Dragon	MFL
Quantum sensor	Highpoint	UPRtek
Scalpel	Handskit	11-23
Sprinkling can	CHUSHI	WJ-001
Xcalibur  software	Thermo Fisher Scientific	4.2