A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

השיטה שפותחה של תיוג 13C6-Glucose בשילוב עם כרומטוגרפיה נוזלית ברזולוציית מסה ברזולוציה גבוהה היא רב-תכליתית ומניחה את הבסיס למחקרים עתידיים על האיברים והמסלולים העיקריים המעורבים בסינתזה של מטבוליטים שניוניים בצמחי מרפא, כמו גם ניצול מקיף של מטבוליטים שניוניים אלה.

Abstract

מאמר זה מציג שיטה חדשנית ויעילה לאישור איברים ראשוניים המעורבים בסינתזת מטבוליטים שניונית. כמטבוליט המשני החשוב ביותר בפריזפוליפילה var. yunnanensis (Franch.) יד. -Mzt. (PPY), פריז saponin (PS) יש מגוון רחב של פעילויות פרמקולוגיות PPY הוא ביקוש גובר. מחקר זה ביסס עלים, קני שורש וצרור גזע-כלי דם 13C6-גלוקוז הזנה ולא הזנה ארבעה טיפולים כדי לאשר במדויק את האיברים העיקריים המעורבים בסינתזת פריז ספונינים VII (PS VII). על ידי שילוב ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית (LC-MS), חושבו במהירות ובמדויק היחסים של 13C/12C של עלה, קנה שורש, גזע ושורש בטיפולים שונים, ונמצאו ארבעה סוגים של יחסי שיא יונים איזוטופיים PS (M): (M+1) /M, (M+2) /M, (M+3) /M ו-(M+4) /M. התוצאות הראו כי היחס של 13C/12C בקני השורש של צרור גזע-כלי דם וקני שורש היה גבוה משמעותית מזה שבטיפול ללא האכלה. בהשוואה לטיפול ללא הזנה, היחס בין מולקולות PS VII (M+2) /M− בעלים גדל משמעותית תחת טיפולי הזנה של עלים וגבעול-כלי דם. במקביל, בהשוואה לטיפול ללא הזנה, היחס בין מולקולות PS VII (M+2) - / M - בעלים תחת טיפול קנה שורש לא הראה הבדל משמעותי. יתר על כן, היחס בין מולקולות PS VII (M+2) - / M - בגזע, בשורש וקנה השורש לא הראה הבדלים בין ארבעת הטיפולים. בהשוואה לטיפול ללא האכלה, היחס בין מולקולת Paris saponin II (PS II) (M+2) /M בעלים תחת טיפול הזנת עלים לא הראה הבדל משמעותי, והיחס (M+3) /M של מולקולות PS II בעלים תחת טיפול הזנת עלים היה נמוך יותר. הנתונים אישרו כי האיבר העיקרי לסינתזה של PS VII הוא העלים. הוא מניח את הבסיס לזיהוי עתידי של האיברים והמסלולים העיקריים המעורבים בסינתזה של מטבוליטים משניים בצמחי מרפא.

Introduction

המסלולים הביוסינתטיים של מטבוליטים שניוניים בצמחים הם מורכבים ומגוונים, וכוללים איברי צבירה ספציפיים ומגוונים מאוד1. כיום, אתרי הסינתזה הספציפיים והאיברים האחראים למטבוליטים שניוניים בצמחי מרפא רבים אינם מוגדרים היטב. עמימות זו מציבה מכשול משמעותי לקידום אסטרטגי וליישום של שיטות גידול שנועדו לייעל הן את התשואה והן את האיכות של חומרי מרפא.

ביולוגיה מולקולרית, ביוכימיה וטכניקות תיוג איזוטופים נמצאות בשימוש נרחב כדי לפענח את מסלולי הסינתזה והאתרים של מטבוליטים שניוניים בצמחי מרפא 2,3,4,5, וכל אחת מהמתודולוגיות הללו מציגה חוזקות ומגבלות ייחודיות, כגון הבדלים ביעילות ובדיוק.

Protocol

1. הכנה ניסיונית

  1. ודא כי במהלך גידול הצמח, הלחות היחסית של החממה היא 75%, טמפרטורות היום / לילה הם 20 °C / 10 °C (75 °F), תקופת הצילום מורכבת מ 12 שעות ביום ו 12 שעות בלילה, ואת עוצמת האור היא 100 μmol·m-2·s-1. מספקים קרינה באמצעות מנורות דיודה פולטות אור (LED), תוך שמירה על מרחק של 30 ס"מ בין מנורת הלד לחופת הצמח.
    הערה: תקופת האור ועוצמת האור הם בהתאם למספר שעות השמש במהלך תקופת הגידול ביונאן. קרינה נמדדת באופן שגרתי על ידי חיישן קוונטי (ראו טבלת חומרים). בצע את השינויים הנדרשים בפרמטרים סביבתיים בהתאם למאפייני צמח המרפא. לאחר שתנאים סביבתיים אלה כוילו בקפידה בהתבסס על מאפייני הצמח ופרופיל אור השמש ה....

תוצאות

כדי לאשר שאספקת 13C6-גלוקוז בקני שורש הייתה מוצלחת, ניתחנו עוד יותר את יחסי האיזוטופים של 13C/12C בקני שורש. יחסי האיזוטופים של 13C /12C בטיפולים 3 ו-4 היו גבוהים בהרבה מאלה של טיפול 2 (איור 1A). התוצאות הצביעו על כך ש-13C,6-גלוקוז מטיפול 3 ו-4 ?.......

Discussion

היישום המוצלח של פרוטוקול זה תלוי במחקר מקיף של תכונות פיזיולוגיות של צמחים, רקמות, איברים ומטבוליטים משניים. גישת התכנון הניסויי המתוארת בפרוטוקול מניחה בסיס איתן לחקר המסלולים הביוסינתטיים של מטבוליטים שניוניים צמחיים. הגורמים הקריטיים בניסוי זה הם: (1) קביעת גיל השתילים הרב-שנתיים ו-(2) .......

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של תוכנית הנוער של סין (מס '82304670).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 % Formic acid waterChengdu Kelong Chemical Reagent Factory44890
13C6-Glucose powderMERCK110187-42-3
AcetonitrileChengdu Kelong Chemical Reagent Factory44890
AUTOSAMPLER VIALSBiosharp Biotechnology Company44866
BEH C18 columnWaters,Milfor,MA1.7μm,2.1*100 mm
CNC ultrasonic cleanerKunshan Ultrasound Instrument Co., LtdKQ-600DE
Compound DiscovererTM  softwareThermo Scientific, Fremont,CA3
Compound DiscovererTM  software Thermo Scientific,Fremont,CA3
Electric constant temperature blast drying ovenDHG-9146A
Electronic analytical balanceSedolis Scientific Instruments Beijing Co., LtdSOP
Ethanol Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory44955
Fully automatic sample rapid grinderShanghai Jingxin TechnologyTissuelyser-48
Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass SpectrometerThermo FisherDelta V Advantage
Hoagland solutionSigma-AldrichH2295-1L
Hydroponic tankJRD1020421
Isodat softwareThermo Fisher Scientific3
Liquid chromatography high-resolution mass spectrometryAgilent Technology Agilent 1260 -6120 
Nitrogen manufacturing instrumentPEAK SCIENTIFICGenius SQ 24
Organic phase filterTianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd44890
Oxygen pumpMagic DragonMFL
Quantum sensorHighpointUPRtek
ScalpelHandskit11-23
Sprinkling canCHUSHIWJ-001
Xcalibur  softwareThermo Fisher Scientific4.2

References

  1. Erb, M., Kliebenstein, D. J. Plant secondary metabolites as defenses, regulators, and primary metabolites: The blurred functional trichotomy. Plant Physiol. 184 (1), 39-52 (2020).
  2. Li, Y., Kong, D., Fu, Y., Sussman, M. R., Wu, H.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

13C6LC MSParis Saponin VIIParis Saponin II

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved