JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

תרכובות Thiophenesulfonamide הן מעכבים חזקים וספציפיים של ויסתי חישת Vibrio quorum LuxR/HapR החוסמים את פעילותם in vivo, ובכך מונעים שעתוק גנים לאלימות, תנועתיות וביופילמים. פרוטוקול זה מפרט כיצד תרכובות אלה מסונתזות, מעוצבות בסיליקו, ונבדקות in vivo לפעילות נגד LuxR/HapR.

Abstract

חיידקים מזהים מספרי אוכלוסייה מקומיים באמצעות חישת מניין, שיטה של תקשורת תא-תא המשמשת באופן נרחב לשליטה בהתנהגויות חיידקים. בזני ויבריו , מווסתי חישת המניין הראשיים LuxR/HapR שולטים במאות גנים לחישת מניין, שרבים מהם משפיעים על אלימות, חילוף חומרים, תנועתיות ועוד. Thiophenesulfonamides הם מעכבים רבי עוצמה של LuxR/HapR הקושרים את כיס הליגנד בגורמי שעתוק אלה וחוסמים את ביטוי הגנים לחישת מניין במורד הזרם. סוג זה של תרכובות שימש כבסיס לפיתוח מערכת של נהלים פשוטים, חזקים וחינוכיים לסטודנטים בקולג' להטמיע את כישורי הכימיה והביולוגיה שלהם באמצעות מודל CURE: ניסיון מחקרי מבוסס קורס לתואר ראשון. פרוטוקולים ממוטבים מתוארים הכוללים שלושה שלבי למידה בפלטפורמה איטרטיבית ורב-תחומית כדי לערב את התלמידים ב- CURE של שנה: (1) לתכנן ולסנתז מעכבי מולקולות קטנות חדשות המבוססים על ליבת thiophenesulfonamide, (2) להשתמש במידול מבני כדי לחזות זיקה קשירה למטרה, ו (3) להעריך את התרכובות ליעילות בבדיקות מיקרוביולוגיות נגד חלבונים ספציפיים Vibrio LuxR/HapR. בדיקת הכתב המתוארת שבוצעה ב- E. coli מנבאת בהצלחה את יעילות התרכובות נגד חלבוני מטרה במיני Vibrio המקומיים.

Introduction

חיידקים חשים את צפיפות האוכלוסייה ואת סוג התאים הסמוכים להם באמצעות תהליך תקשורת תא-תא שנקרא חישת מניין (QS)1. קבוצות מגוונות של חיידקים משתמשות ב-QS כדי לשלוט בהתנהגויות שונות, כגון תנועתיות, היווצרות ביופילם, הפרשת גורמי אלימות ועוד. החלבונים והאותות המעורבים ב-QS שונים מאוד בין חיידקים. במינים של ויבריו , מערכת האיתות QS משתמשת בעיקר בקולטני היסטידין-קינאז היברידיים הקשורים לממברנה, שמזהים אותות ספציפיים של מולקולות קטנות שנקראים autoinducers2 (איור 1). קולטנים אלה שולטים בזרימת הפוספט דרך המערכת לווסת תגובה המתמלל רנ"א קטן. ייצור sRNA משנה את הייצור של וסת חישת המניין הראשי, המוגדר כקבוצה משומרת של חלבונים הנקראים ביחד LuxR/HapR3. כך, בצפיפות תאים נמוכה, ה-mRNA המקודד LuxR/HapR מתפרק באמצעות מיקוד sRNA, ובצפיפות תאים גבוהה, חלבון LuxR/HapR מיוצר ברמות מקסימליות (נסקר ב-Ball et al.3).

קבוצת החלבונים LuxR/HapR שייכת לקבוצה הגדולה של חלבוני TetR, המוגדרת על ידי נוכחות סליל-תור-סליל בתחום קשירת ה-DNA, היווצרות הומודימר פונקציונלי, ובדרך כלל הכללת תחום קשירת ליגנד4. חלבוני Vibrio LuxR/HapR עונים על כל הקריטריונים הללו, אם כי ליגנד טרם זוהה. חלבון LuxR/HapR בכל מיני הוויבריו הנחקרים שולט בהתנהגויות רבות במורד הזרם, שרבות מהן ידועות כחשובות בפתוגנזה: ייצור ביופילמים, פרוטאזות, ציטוקסינים, המוליזין, הפרשת סוג III, וקומפלקסי הפרשה מסוג VI, ועוד3. מחיקה של חלבון LuxR/HapR מובילה לירידה או אובדן של אלימות במערכות מארחות 5,6,7, מה שמוביל להשערה כי עיכוב של חלבונים אלה הוא אסטרטגיה בת קיימא לנטרול התקדמות המחלה. מיני ויבריו גורמים למחלת ויבריוזיס באורגניזמים ימיים, כולל דגים, רכיכות ואלמוגים, כמו גם בבני אדם הבאים במגע או בולעים מינים מסוימים.

מחקרים קודמים זיהו פאנל של תרכובות תיופנסולפונאמיד שנקשרות באופן ספציפי לתחום קשירת הליגנד של חלבוני LuxR/HapR במינים מרובים של ויבריו כדי לחסום את תפקודם 5,8,9 (איור 1). באמצעות מסך כתב ב- E. coli, התרכובות זוהו ולאחר מכן נבדקו בויבריו המקומי, אשר הראה מתאם גבוה בין ההשפעה ב- E. coli ההטרולוגי לבין היעילות בויבריו9. תרכובות אלה פשוטות לסנתזה בשלב אחד, מה שהופך אותן לאידיאליות לסינתזה של ספריות קטנות בהקשר של קורס מעבדה לביולוגיה כימית. ניסיון מחקרי בן שלושה שבועות המבוסס על קורס לתואר ראשון (CURE) שתוכנן סביב פיגום מולקולרי זה דווח בעבר8. מודול זה, שנמשך שלושה שבועות, עבר אופטימיזציה, ייעול והורחב נוסף ב-CURE השנתי הזה, שנועד להתמקד בעיכוב של חלבוני LuxR/HapR במגוון מיני Vibrio.

Protocol

פרטי הריאגנטים והציוד ששימש למחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. תכנון וסינתזה של ספריות thiophenesulfonamide

הערה: מעכבי Thiophenesulfonamide כגון 3-phenyl-1-(thiophen-2-ylsulfonyl)-1 H-pyrazole (PTSP) מסונתזים באמצעות עיבוי בסיס מקודם שלבאחד 8,9, כפי שמוצג באיור 2. כדי לתכנן ספריות מורכבות חדשות למחקר, על החוקרים לרכוש אמינים וסולפוניל כלורידים מתאימים ולבצע את השלבים המסוכמים להלן. אם המבנה של אמין שונה מאוד מן הנגזרת pyrazole ארומטי, אז תנאי תגובה חלופיים ייתכן שיהיה צורך לזהות על ידי חיפוש בספרות. הליך זה הוא חזק, ובסיסים כגון הידרוקסיד נתרן, אמין triethyl, ו pyridine עבדו גם טוב. אם זה מבוצע בקורס, התלמידים עשויים לקבל את החופש לבחור את ההליך שלהם עם תוצאות חיוביות סבירות.

  1. סינתזה ובידוד של PTSP
    הערה: ניתן להשלים זאת בתקופת מעבדה אחת של 3 שעות.
    1. להמיס 822 מ"ג של phenylpyrazole (5.7 mmol של אמין, 1.5 eq.) ב 15 מ"ל של tetrahydrofuran בבקבוק תחתון עגול 50 מ"ל עם מוט ערבוב.
    2. הוסיפו באיטיות 306 מ"ג נתרן הידריד (60% בשמן, 7.65 מילימול, 2 eq.) ליצירת תרחיף. תנו לתרחיף על צלחת ערבוב במשך 10 דקות.
    3. בבקבוקון, להכין פתרון של thiophenesulfonyl כלוריד (3.82 mmol של כלוריד sulfonyl, 1 eq.) ב 5 מ"ל של THF.
    4. הוסף את התמיסה של סולפוניל כלוריד שהוכנה בשלב 1.1.3 לתרחיף שהוכן בשלב 1.1.2 ואפשר לתרחיף שהתקבל לערבב במשך 30 דקות נוספות.
    5. הוסף 20 מ"ל של מי DI לתערובת התגובה בצלוחית התחתונה העגולה של 50 מ"ל.
    6. מעבירים את כל תכולת בקבוק התגובה למעט מוט הערבוב למשפך הפרדה של 250 מ"ל10.
    7. יש להוסיף 20 מ"ל אתיל אצטט (EtOAc) למשפך המפריד ולנער.
    8. מסירים את השכבה התחתונה (המימית) ומניחים בצד.
    9. מסירים את השכבה העליונה (האורגנית) ומניחים בצד בצלוחית Erlenmeyer בנפח 200 מ"ל.
    10. מחזירים את השכבה המימית למשפך המפריד ומוציאים עם 20 מ"ל אתיל אצטט.
    11. חזור על שלבים 1.1.8 ו- 1.1.9.
    12. מחזירים את השכבות האורגניות המשולבות למשפך המפריד ושוטפים עם 20 מ"ל NaCl רווי (מלח).
    13. מסירים את השכבה התחתונה (המימית) ומניחים בצד.
    14. מסננים את השכבה העליונה (האורגנית) בחזרה לצלוחית ארלנמאייר.
    15. יבשו את השכבות האורגניות המשולבות מעל MgSO4 בבקבוק Erlenmeyer וסננו לבקבוק תחתון עגול בנפח 250 מ"ל באמצעות נייר סינון איכותי10.
    16. הסר את הממס האורגני על מאייד סיבובי.
  2. נתח את תערובת התגובה הגולמי ב- 1H NMR כדי לוודא שהמוצר נוצר10.
    הערה: הזמן הדרוש לשלב זה יהיה תלוי ברמת הנוחות של התלמיד עם ספקטרוסקופיית NMR.
  3. לטהר את המוצר על ידי כרומטוגרפיית עמוד ג'ל סיליקה (10:1 הקסנים: אתיל אצטט)10.
    הערה: ניתן להשלים זאת בתקופת מעבדה אחת של 3 שעות.
  4. אפיינו את המוצר באופן ספקטרוסקופי.
    הערה: הזמן הדרוש לשלב זה יהיה תלוי ברמת הנוחות של התלמיד עם ספקטרוסקופיית NMR.
    הערה: נתוני אפיון עבור 3-phenyl-1-(thiophen-2-ylsulfonyl)-1 H-pyrazole (PTSP)10:
    1H NMR (400 MHz, CDCl 3): δ 8.11 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.88 - 7.79 (m, 3H), 7.68 (dd, J = 5.0, 1.4 Hz, 1H), 7.44 - 7.31 (m, 3H), 7.07 (dd, J = 5.0, 3.9 Hz, 1H), 6.71 (d, J = 2.8 Hz, 1H).
    13C NMR (101 MHz, CDCl 3): δ 157.17, 136.84, 135.40, 135.36, 132.55, 131.28, 129.36, 128.72, 127.79, 126.47, 106.90.
    HRMS (ESI): מחושב עבור C13H10O2N2NaS2 [M+Na+]: 313.0076. נמצא: 313.0078.

2. מידול מבני לחיזוי קשירת תיופנסולפונאמידים לווסת Vibrio LuxR/HapR

הערה: פרוטוקול זה משתמש בגרסה מבוססת האינטרנט של AutoDock Vina הנקראת Webina11 כדי לעגן מעכבי מולקולות קטנות (PTSP במקרה זה) לתוך כיס קשירת הליגנד של ההומולוג LuxR/HapR שנקרא SmcR מ- Vibrio vulnificus12. התוצאות של פרוטוקול זה הן (1) זיקות קשירה מחושבות ו-(2) קובץ מבנה שניתן לפתוח ב-PyMol או בתוכנית קשורה כדי להמחיש את אינטראקציות ליגנד-חלבון. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לכל מולקולה קטנה ולכל חלבון עם כיס קשירת ליגנד. לוקח דקות לעגון לתוך SmcR מכיוון שאזור החיפוש אחר קולטן זה מוגדר להלן. אם יש צורך להגדיר את אזור החיפוש עבור קולטן חדש (שלבים 2.15-2.20), ניתן להשלים זאת בתקופת מעבדה אחת של 3 שעות. לאחר הגדרת אזור החיפוש, העגינה הבאה תארך דקות.

  1. הורד את כלי AutoDock. בחר את הקובץ המתאים למערכת ההפעלה והתקן אותו במחשב.
    הערה: פרוטוקול זה משתמש בגירסה מבוססת אינטרנט של AutoDock Vina. ניתן לבצע את העגינה גם באופן מקומי אם תוכנית זו מותקנת (עיין בהוראות היצרן).
  2. הורד את המבנה עבור apo SmcR.
  3. נווט אל בנק נתוני החלבונים.
  4. בסרגל החיפוש, הזן את מזהה PDB 3KZ9.
  5. לחץ על הורד קבצים מהתפריט הנפתח לכיוון הפינה השמאלית העליונה של הדף ובחר פורמט PDB .
  6. לאחר הורדת הקובץ, שמור אותו בתיקיה חדשה המוקדשת לעבודת העגינה.
  7. צור קובץ מבנה .mol של מעכב המולקולה הקטנה (PTSP).
  8. נווט אל molview ולחץ על סמל פח האשפה כדי להסיר את המבנה שנמצא שם.
  9. צייר PTSP בחלון המבנה.
  10. לחץ על 2D ל 3D.
  11. לחץ על כלים → לייצא → קובץ MOL.
  12. קובץ בשם "Molview.mol" יורד למחשב. תן לקובץ שם הגיוני ושמור אותו בתיקיה המכילה את קובץ החלבון pdb.
  13. הגדר את אזור החיפוש.
  14. הגדר את האזור בוובינה ככיס הקישור של החלבון (SmcR) כדי להקל על העגינה באזור הנכון.
    הערה: קואורדינטות עבור SmcR מסופקות ונוצרות באמצעות הפרוטוקול הבא. אם SmcR נמצא בשימוש, ניתן לדלג על שלבים 2.15-2.20. ניתן להתאים את הפרוטוקול לכל חלבון בעל כיס קשירת ליגנד ידוע. קואורדינטות: center_x = 17, center_y = 40, center_z = 56, size_x = 12, size_y = 12, size_z = 12.
  15. בכלי AutoDock, לחץ על File → Read Molecule ופתח את קובץ חלבון pdb שהורד בשלב 2.5.
  16. נווטו אל לוח הבקרה ולחצו על החץ הכחול לצד שם החלבון. זה יעלה רשימה של שרשראות. לחץ על החץ הכחול ליד אחת משרשראות החלבון.
  17. כדי להדגיש את חומצות האמינו של הכיס המחייב, מצא את חומצת האמינו המעניינת ברשימה שהופיעה. ליד חומצת האמינו, עבור אל המשולש בעמודה Cl (צבע) בקצה הימני. לחץ על המשולש ובחר לפי קשת.
    הערה: השתמש בשיטה זו כדי להדגיש את חומצות האמינו הבאות:12 Phe75, Phe78, Leu79, Ile96, Met100, Trp114, Phe129, Asn133, Gln137, Val140, Ala163, Phe166, His167, Cys170 (אם Met100 חסר, ניתן לדלג עליו).
  18. לאחר מכן, לחץ על Grid → GridBox. קופסה צריכה להופיע מעל מבנה החלבון עם פנים אדומות, ירוקות וכחולות. לפני ביצוע שינויים, שנה את המרווח (אנגסטרום) ל- 1. פעולה זו תבטיח שקנה המידה של התיבה ישתנה כראוי עבור השלבים הבאים.
    1. לאחר מכן, שנה את החוגות <היסט> התיבה רשת מרכזית כדי לתרגם את התיבה בכיווני x, y ו- z כדי למקם אותה מעל חומצות האמינו המודגשות. לחץ וגרור על החלבון כדי לסובב את המבנה בתלת מימד.
      הערה: פעולה זו תסייע להבטיח שהתיבה נמצאת במיקום הנכון. במידת הצורך, השתמש בשלוש החוגות העליונות עבור מספר הנקודות כדי לשנות את גודל התיבה.
  19. לאחר הגדרת מיקום התיבה והמידות, לחץ על קובץ → סגור שמירת זרם.
  20. בתפריט, לחץ על Grid → Output → Save GPF. תן שם לקובץ ושמור אותו באותה תיקייה שבה נמצאים שני קובצי המבנה. קובץ GPF זה כולל את קואורדינטות התיבה.
  21. בצע "עגינה" ב- Webina כדי ליצור אנרגיית קישור מחושבת.
  22. פתח את התיקיה המכילה את קובץ הליגנד .mol ואת קובץ החלבון .pdb. Webina דורש קבצי .pdbqt, ויעשה את המרת הקובץ.
  23. נווט אל סמינרים באינטרנט.
  24. קולטן: גרור מעל הקובץ שהורדת מה-pdb שנקרא 3kz9.pdb. לחץ על הוסף אטומי מימן, ולחץ על המר. לחץ על אישור בחלון המוקפץ הבא כדי לעבוד עם מונומר.
  25. ליגנד: גרור מעל קובץ ה- .mol עבור PTSP (או מעכב מולקולות קטנות אחרות). ודא שלא נבחרו תיבות ולחץ על המר. השאר את "תנוחה נכונה" ריקה וגלול מטה אל תיבת העגינה. הזן את פרמטרי התיבה המתאימים (אלה המפורטים לעיל עבור SmcR או קבוצה שנוצרה על-ידי הפרוטוקול בשלבים 2.15-2.20 עבור חלבון אחר).
  26. לחץ על התחל Webina וחכה.
  27. סדרה של אנרגיות קישור מחושבות תדווח [זיקה (קק"ל/מול)] ישירות מתחת להדמיה של המולקולה המעוגנת. ודא שהערך הראשון הוא השלילי ביותר.
  28. כדי לדמיין את הליגנד המעוגן בפימול או בתוכנית דומה אחרת, הורד את קובץ PDBQT הפלט על ידי לחיצה על כפתור ההורדה המתאים. קובץ זה הוא רק הליגנד (PTSP) בקואורדינטות המעוגנות.
  29. דמיינו את מתחם ליגנד-SmcR המעוגן ב-PyMol13.
    1. הורד ופתח את PyMol.
      הערה: סטודנטים ומחנכים במשרה מלאה עשויים לקבל רישיון PyMol ללא תשלום. כאשר תתבקש לקבל רישיון לאחר הפעלת PyMol בפעם הראשונה, לחץ על קנה רישיון. בחר תלמיד/מורה.
    2. פתח את קובץ ה- pdb שנקרא 3kz9.pdb.
    3. פתח את קובץ הפלט pdbqt שנוצר על ידי Webina.
    4. דמיינו את הקונפורמציה הטובה ביותר (זו עם הזיקה המחייבת הנמוכה ביותר) על ידי לחיצה על החצים הקטנים המצביעים בפינה השמאלית התחתונה של מסך PyMol. הקונפורמציה הראשונה תהיה הנוחה ביותר ותוצג בעת פתיחת הקובץ.
    5. תמרן את החלבון עם הליגנד המעוגן ב- PyMol באמצעות פקודות סטנדרטיות14.
      הערה: המחקר הקודם של Newman et al. השווה את זיקות הקישור החזויות של מספר תרכובות שנקבעו על ידי Webina לבדיקות in vitro ו- in vivo 9. זיקות קשירה אלה משמשות כהפניות לתרכובות שעשויות להיות מעכבות טובות עם זיקות גבוהות (המתאמות למספרים נמוכים יותר של קק"ל/מול) עבור כיס הקשירה. דוגמה לנתוני פלט Webina כלולה באיור 3A,B עבור קשירת PTSP בכיס של SmcR.

3. הערכה ביולוגית של thiophenesulfonamides בעיכוב חישת מניין

הערה: ההליך הספציפי לבדיקת חלבון Vibrio campbellii LuxR מתואר כאן. עם זאת, הליך זה יכול להיות מותאם לשימוש עם כל חלבוני Vibrio LuxR/HapR, שכולם זמינים על פלסמידים משכפלים אקטופית התואמים לפלסמיד הכתב pJV0649. בדיקת "המסך האדום-ירוק" מבוצעת על רקע חיידקי הטרולוגי באמצעות תאי E. coli המכילים את שני הפלסמידים. פלסמיד ביטוי LuxR/HapR (המעניק עמידות לקנמיצין) זמין ומבטא גנים שונים של LuxR (איור 4A). פלסמיד pJV064 (המעניק עמידות לכלורמפניקול) מקודד גן gfp תחת שליטה של מקדם המופעל על ידי LuxR וגן mCherry תחת שליטה של מקדם LuxR (איור 4A). שני המקדמים נבחרו בשל זיהויים כגנים מווסתים LuxR עם שינויים גדולים בביטוי in vivo15. זני LuxR/HapR E. coli ופלסמיד pJV064 פורסמו בעבר 9,15.

  1. הכנת מדיה נוזלית: להכין 1 ליטר של LB בינוני.
    1. שקלו 10 גרם של NaCl, 10 גרם של bactotryptone, ו 5 גרם של תמצית שמרים.
    2. מערבבים את הרכיבים בכוס או גליל מדורג בעזרת צלחת ערבוב.
    3. להביא את נפח הכולל ל 1 L באמצעות צילינדרים מדורגים.
    4. אם תרצה, aliquot לתוך 100 מ"ל לכל בקבוק לפני autoclaving.
    5. Autoclave במשך 15 דקות עבור כל 1 ליטר של מדיה. לחלופין, אם אוטוקלאבה אינה זמינה, ניתן להשתמש בסיר מיידי16.
  2. חיסון זן (יום 1)
    1. הוסף אנטיביוטיקה למדיום LB בריכוזים סופיים של קנמיצין (40 מיקרוגרם/מ"ל) וכלוראמפניקול (10 מיקרוגרם/מ"ל).
    2. Aliquot 5 מ"ל של LB/Kan40/CM10 בינוני לתוך מבחנות סטריליות עם כובעים.
    3. חיסון זני E. coli ממלאי מקפיא: תרבית E. coli המבטאת LuxR/HapR ופלסמיד pJV064 (LuxR+)9,15; E. coli תרבית בקרת וקטור ריק ופלסמיד pJV064 (LuxR-)9,15.
    4. נערו את התרבית למשך הלילה ב-275 סל"ד ב-30°C למשך 16-18 שעות.
  3. בדיקה של thiophenesulfonamides (יום 2)
    1. שוקלים ~ 30 מ"ג של התרכובת. יש להשהות ל-100 מילימטר ב-DMSO ובמערבולת כדי לערבב. לאחר מכן, להכין מלאי 10 mM.
    2. ערבב 20 μL של מלאי 100 mM עם 180 μL של DMSO כדי לדלל אותו (1:10) כדי להניב מלאי עבודה של 10 mM. מערבולת לערבב.
    3. תרבות LuxR+ מדוללת לאחור ותרביות LuxR (1:100) במדיית LB/Kan/CM של 10 מ"ל לתוך צינורות חרוטיים של 15 מ"ל ומערבולות לזמן קצר לערבוב.
    4. השתמש צלחת שחורה היטב, תחתית שקופה, סטרילית 96 באר עבור הבדיקה.
    5. הכינו סדרת דילול לכל העמודות. דיאגרמה של סדרת הדילול פי 4 כלולה כהפניה (איור 4B).
      הערה: צינור דיגיטלי רב-ערוצי מומלץ לתהליך זה. שיטה זו מיועדת לסדרת דילול פי 4 (1:4). עם זאת, ניתן להשתמש בסדרות דילול שונות (למשל, 1:10, 1:5).
      1. פיפט 200 μL של תרבית LuxR+ מתערבב לצלחת בת 96 בארות בשורה A, 1-6 (איור 4B; ירוק).
      2. פיפט 200 מיקרוליטר של תרבית LuxR מתערבב לצלחת בת 96 בארות בשורה A, 7-12 (איור 4B; כתום).
      3. פיפט 150 μL של תרבית LuxR+ מתערבב לצלחת בת 96 בארות בשורות B-E, 1-6 (איור 4B; ירוק).
      4. פיפט 150 μL של תרבית LuxR מתערבב לצלחת של 96 בארות בשורות B-E, 7-12 (איור 4B; כתום).
      5. הוסף 2 μL של התרכובת או DMSO לכל באר בשורה A לפי איור 4B.
      6. עבור כל עמודה, צינור למעלה ולמטה 3 פעמים, ולאחר מכן העבר 50 μL משורה A לשורה B, באותה עמודה.
      7. חזור על הערבוב והפיפטינג עבור שורות B, C, D, E. לאחר ערבוב שורה E, להסיר 50 μL ולשים פסולת. בסופו של דבר, אחד צריך להיות 150 μL בכל באר.
    6. מכסים את הצלחת בסרט מיקרו-נקבובי.
    7. לדגור על הצלחת על ידי ניעור ב 275 סל"ד ב 30 ° C במשך הלילה במשך 16-18 שעות.
    8. מדוד את הפלואורסצנטיות והצפיפות האופטית של לוחות הבדיקה (יום 3).
      1. הסר את הסרט בזהירות, ולא לשפוך נוזלים מהבארות.
      2. בקורא לוחות, קרא את הצפיפות האופטית ב- 600 ננומטר (OD600), GFP ו- mCherry.
        הערה: מומלץ לקבוע רווח עבור שני ערוצי הפלואורסצנטיות כדי לאפשר השוואה בין מבחנים.
    9. רשום נתונים כפלואורסצנטיות מנורמלת לכל תא: GFP/OD600 ו- mCherry/OD600.
    10. שרטט את הנתונים, כפי שמוצגים באיור 5, כדי להמחיש את התוצאות עבור בקרת DMSO בהשוואה לדגימות הבדיקה.

4. שטיפת צלחות הבדיקה השחורות לשימוש חוזר

  1. משרים את הצלחות באקונומיקה.
    1. תייגו פלסטיק בנפח 1 ליטר כ"פסולת ביולוגית". שפכו נוזלים מצלחות לתוך מיכל פסולת זה (נקו בזהירות את כל הטפטוף עם 70% EtOH). שטפו את הצלחות במי DI מבקבוק השפריץ על הפסולת ושפכו אותו לתוכו.
    2. תייגו עוד פלסטיק בנפח 1 ליטר כ"30% אקונומיקה". שימו צלחות/מכסים במיכל זה וכסו ב-30% אקונומיקה. עוטפים את החלק העליון ביריעת פלסטיק ושוקלים את הצלחות עם קופסת טיפים או משהו דומה. השאירו שקועים בתמיסת האקונומיקה למשך הלילה.
  2. יש לשטוף ולהשרות אתנול.
    1. שטפו היטב את הצלחות במי DI לתוך הכיור, כך שלא תישאר אקונומיקה. שפכו את שאריות המים מהבארות לכיור.
    2. יש להוסיף 70% EtOH לכל הבארות והמכסים באמצעות בקבוק תרסיס. תנו לצלחות לשבת זקופות עם המכסה למעלה, אבל שאלו כדי שה-EtOH יוכל להתאדות, אבל שום דבר לא נופל לתוך הבארות. תנו לצלחת לשבת למשך הלילה.
  3. הניחו לצלחות להתייבש.
    1. לזרוק החוצה את כל EtOH שנותרו.
    2. הפכו את הצלחת על מגבת נייר ותנו לשאר ה-EtOH להתאדות. השאירו את הצלחות כך במכסה אדים. הצלחות יהיו מוכנות לשימוש הבא.

תוצאות

כתוצאות מייצגות, הנתונים נכללים משלוש תרכובות תיופנסולפונאמיד שסונתזו על-ידי סטודנטים לתואר ראשון עבור תרכובות 1A, 2B ו-3B (איור 5A-C; מתואר בפירוט אצל Newman et al.9). כל תרכובת נבדקה בזן E. coli המבטא V. campbellii LuxR ובאמצעות פ?...

Discussion

CURE זה פותח במקור כפרוטוקול מקוצר בן שני שלבים, שלושה שבועות (תכנון/סינתזה ובדיקה) ויושם בחמישה סמסטרים כחלק מקורס מעבדה אורגנית ברמה העליונה8. מאז הדו"ח המקורי, מודול המידול הממוחשב נוסף, ואת הבדיקה E. coli היה מותאם עבור חוקרים מתחילים. הפרוטוקול התלת-שלבי,...

Disclosures

JVK ו- LCB חושפים אינטרסים פיננסיים ב- Quornix, LLC, שעשויים להפיק תועלת מתוצאות המחקר על תרכובות thiophenesulfonamide.

Acknowledgements

המחקר המדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר R35GM124698 JVK. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-thiophensulfonyl chlorideAmbeedA258464
3-Phenyl-1H-pyrazoleAmbeedA10440198%
96-well clear bottom black platesUSA Scientific5665-5090Q96-well polystyrene uClear black TC plate with lid, clear flat bottom, sterile, 8/sleeve, 32/case 
Autodock Toolshttp://mgltools.scripps.edu/downloads
Autodock Vinahttps://vina.scripps.edu 
Chloramphenicol
DMSO
ethyl acetateFisher ScientificAA31344M4Reagent grade
hexanesFisher ScientificH291
Kanamycin
magnesium sulfateFisher ScientificM65-500Anhydrous
Microporous FilmUSA Scientific2920-1010Microporous Film, -20degC to +80degC, 50/box, Sterilized
molviewmolview.org
NaCl
Protein Databankhttps://www.rcsb.org/
Pymolhttps://pymol.org/2/
Qualitative filter paperFisher Scientific09-805-342Cytiva Whatman™ Qualitative Filter Paper: Grade 1 Circles, 47 mm
Silica gelSorbtech30930M-25Silica Gel, Standard Grade, 60A, 40-63um (230 x 400 mesh)
Sodium hydrideMillipore Sigma45291260 % dispersion in mineral oil
TetrahydrofuranFisher ScientificMTX02847Tetrahydrofuran, anhydrous, 99.9%, ACS Grade, DriSolv
TLC PlatesSorbtech1634067Silica gel TLC plates, aluminum backed
Tryptone
webinahttps://durrantlab.pitt.edu/webina/
Yeast Extract

References

  1. Ng, W. L., Bassler, B. L. Bacterial quorum-sensing network architectures. Annu Rev Genet. 43, 197-222 (2009).
  2. Barrasso, K., et al. Dual-function quorum-sensing systems in bacterial pathogens and symbionts. PLoS Pathog. 16, e1008934 (2020).
  3. Ball, A. S., Chaparian, R. R., van Kessel, J. C. Quorum sensing gene regulation by LuxR/HapR master regulators in Vibrios. J Bacteriol. 199 (19), 00105-00117 (2017).
  4. Ramos, J. L., et al. The TetR family of transcriptional repressors. Microbiol Mol Biol Rev. 69, 326-356 (2005).
  5. Kim, B. S., et al. QStatin, a selective inhibitor of quorum sensing in Vibrio species. mBio. 9 (1), 02262 (2018).
  6. Kim, S. M., et al. LuxR homologue SmcR is essential for Vibrio vulnificus pathogenesis and biofilm detachment, and its expression is induced by host cells. Infect Immun. 81, 3721-3730 (2013).
  7. Hasegawa, H., Hase, C. C. TetR-type transcriptional regulator VtpR functions as a global regulator in Vibrio tubiashii. Appl Environ Microbiol. 75, 7602-7609 (2009).
  8. Dorn, S. K., Newman, J. D., Van Kessel, J. C., Brown, L. C. Synthesis and biological assay of small-molecule quorum sensing inhibitors: A three-week course-based undergraduate research experience. J Chem Educ. 98, 3533-3541 (2021).
  9. Newman, J. D., et al. Amino acid divergence in the ligand-binding pocket of Vibrio LuxR/HapR proteins determines the efficacy of thiophenesulfonamide inhibitors. Mol Microbiol. 116 (4), 1173-1188 (2021).
  10. Mohrig, J. R. H., Schatz, P. F. . Techniques in Organic Chemistry. 3. End. , (2001).
  11. Kochnev, Y., Hellemann, E., Cassidy, K. C., Durrant, J. D. Webina: An open-source library and web app that runs AutoDock Vina entirely in the web browser. Bioinformatics. 36, 4513-4515 (2020).
  12. Kim, Y., et al. Crystal structure of SmcR, a quorum-sensing master regulator of Vibrio vulnificus, provides insight into its regulation of transcription. J Biol Chem. 285, 14020-14030 (2010).
  13. . . The PyMOL molecular graphics system v. 2.0. , (2023).
  14. . PyMol wiki commands Available from: https://pymolwiki.org/index.php/Category:Commands (2023)
  15. van Kessel, J. C., Ulrich, L. E., Zhulin, I. B., Bassler, B. L. Analysis of activator and repressor functions reveals the requirements for transcriptional control by LuxR, the master regulator of quorum sensing in Vibrio harveyi. mBio. 4 (4), 00378 (2013).
  16. Swenson, V. A., et al. Assessment and verification of commercially available pressure cookers for laboratory sterilization. PLoS One. 13, e0208769 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

207ThiophenesulfonamidesReporter AssayCURE

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved