עכבר יילודים בידוד מח עצם והכנת מקרופאגים שמקורם במח עצם

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה לא אנזימטית ופשוטה לבידוד תאי מח עצם של עכבר יילודים בני 7-9 ימים ויצירת מקרופאגים ממוינים באמצעות סופרנאטנט של תאי L929 כמקור לגורם מגרה מושבת גרנולוציטים (M-CSF). המקרופאגים שמקורם במח עצם נותחו עוד יותר עבור אנטיגנים פני השטח F4/80, CD206, CD11b וכשירות תפקודית.

Abstract

טכניקות שונות לבידוד מח עצם מעכברים בוגרים כבר מבוססות היטב. עם זאת, בידוד מח עצם מעכברים ילודים הוא מאתגר וגוזל זמן, אך עבור דגמים מסוימים, הוא רלוונטי והכרחי מבחינה תרגומית. פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה ופשוטה להכנת תאי מח עצם מגורים בני 7-9 ימים. תאים אלה יכולים להיות מבודדים עוד יותר או להתמיין לסוגי תאים ספציפיים בעלי עניין. מקרופאגים הם תאי חיסון חיוניים שממלאים תפקיד מרכזי בדלקת ובזיהום. במהלך ההתפתחות, מקרופאגים בילודים תורמים באופן משמעותי לעיצוב מחדש של רקמות. יתר על כן, הפנוטיפ והתפקודים של מקרופאגים בילודים שונים מאלה של עמיתיהם הבוגרים. פרוטוקול זה מתאר גם את ההתמיינות של מקרופאגים בילודים מתאי מח עצם מבודדים בנוכחות תווך מותנה L929. סמני פני השטח של מקרופאגים יילודים מובחנים הוערכו באמצעות אנליזה ציטומטרית של זרימה. כדי להדגים פונקציונליות, היעילות הפאגוציטית נבדקה גם באמצעות Escherichia coli מצומד לצבע הרגיש ל- pH.

Introduction

מח עצם מקיף אוכלוסיות תאי גזע המטופויטיות ומזנכימליות המתחדשות מעצמן וניתן להתמיין לשושלות תאים שונות. תאי גזע המטופויטיים במח העצם מולידים שושלות מיאלואידיות ולימפואידיות¹. תאי גזע מזנכימליים מייצרים אוסטאובלסטים (עצם), אדיפוציטים (שומן) או כונדרוציטים (סחוס)². לתאים אלה יישומים רבים בתחום הביולוגיה של התא והנדסת רקמות, כולל ריפוי גנטי ^3,4. תאי אב הנמצאים במח העצם מתמיינים לסוגי תאים ספציפיים בנוכחות גורמי גדילה ספציפיים לשושלת. Erythropoietin מקדם את התפשטות של תאי אב אריתרואידים, גורם מגרה מושבת גרנולוציטים (G-CSF) מגרה את הצמיחה של מושבו....

Protocol

כל ההליכים אושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במערב וירג'יניה ובוצעו בעקבות המלצות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה על ידי מועצת המחקר הלאומית. גורי עכברים C57BL/6J שימשו במחקר זה. הפרטים של כל הריאגנטים והציוד שנעשה בהם שימוש מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת מדיה

1. הכינו 3 מ"ל של חומר תרבית MEM בתוספת 10% FBS, 2 מ"מ גלוטמין, 25 מ"מ HEPES ופניצילין (100 U/mL)/סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל) בצינור צנטריפוגה של 5 מ"ל, ושמרו אותו על קרח.
2. במידת הצורך לאחסון אבות מח עצם בחנקן נוזלי, הכינו מדיית הקפאה המכילה 10% DMEM, 80% FBS ו-10% DMSO.
3. עבור DMEM מלא, להכין DMEM בתוס....

תוצאות

באמצעות השיטה המתוארת במחקר זה, ניתן לבודד בהצלחה 25 עד 37 מיליון תאי מח עצם מגודל המלטה של חמישה גורי עכברים C57BL/6. שיטה זו אומתה עם גדלי המלטה הנעים בין 5 ל -7 גורים. גיל הבידוד המינימלי בניסויים שלנו היה 7 ימים. בהתאם לגודל ההמלטה ומספר התאים הדרושים לניסוי שהוא פחות ממיליון, החוקרים יכולים לנס.......

Discussion

מחקר המערב מודלים של עכברי יילודים יכול להציב מספר אתגרים. ליילודים יש מערכת חיסונית מתפתחת שהיא ייחודית בהשוואה למבוגרים⁸. לפיכך, אין להניח שנתונים שנוצרו ממודלים של בעלי חיים בוגרים חלים על תינוקות, וכמה עבודות שפורסמו ביטאו רעיון זה היטב^18,19........

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 µm strainer	Greiner	542040	Cell culture
96 well round (U) bottom plate	Thermo Scientific	12-565-65	Cell culture
Anti-mouse CD11b-BV786	BD Biosciences	740861	FACS analysis
Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488	BD Biosciences	141709	FACS analysis
Anti-mouse F4/80-PE	BD Biosciences	565410	FACS analysis
Countess3	Thermo Scientific	TSI-C3ACC	Automated cell counter
DMEM	Hyclone	SH30022.01	Cell culture
DMSO	VWR	WN182	Cell culture
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV	Cell culture
Escherichia coli O1:K1:H7	ATCC	11775	Infection
EVOS FL	Invitrogen	12-563-649	Cell Imaging System
FBS	Avantor	76419-584	Cell culture
FluoroBright BMDM	Thermo fisher Scientific	A1896701	Dye free culture media
Glutamine	Cytiva	SH30034.01	Cell culture
HEPES	Cytiva	SH30237.01	Cell culture
L-929	ATCC		Differentiation
LSRFortessa	Becton Dickinson		Flowcytometer
Lysotracker red DND 99	Invitrogen	L7528	Fluorescent dye
MEM	Corning	15-010-CV	Cell culture
Penicillin /streptomycin	Hyclone	SV30010	Cell culture
pHrodo green STP ester	Invitrogen	P35369	Fluorescent dye
T75 flask	Cell star	658170	Cell culture
Trypsin-EDTA	Gibco	25300120	Cell culture
Zeiss 710	Zeiss	P20GM103434	Confocal