גידול ספרואידים תלת מימדיים של סרטן הלבלב הדסמופלסטי מבית Co-Culture

Summary

סרטן הלבלב נותר אחד מסוגי הסרטן הקשים ביותר לטיפול. לכן, קריטי שמודלים פרה-קליניים להערכת יעילות הטיפול יהיו ניתנים לשחזור ורלוונטיים קלינית. פרוטוקול זה מתאר הליך תרבית משותפת פשוט ליצירת ספרואידים דמופלסטיים הניתנים לשחזור, רלוונטיים קלינית.

Abstract

אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) הוא אחד מסוגי הסרטן הקטלניים ביותר עם שיעור הישרדות של 5 שנים של <12%. המחסום הגדול ביותר לטיפול הוא המטריצה החוץ תאית הדסמופלסטית הצפופה (ECM) המקיפה את הגידול ומפחיתה את כלי הדם, המכונה בדרך כלל דסמופלזיה. מגוון שילובי תרופות ופורמולציות נבדקו לטיפול בסרטן, ולמרות שרבים מהם מראים הצלחה טרום קלינית, הם נכשלים קלינית. לכן, חשוב שיהיה מודל רלוונטי מבחינה קלינית זמין שיכול לחזות את התגובה של הגידול לטיפול. מודל זה אומת בעבר כנגד גידולים קליניים שנכרתו. כאן מתואר פרוטוקול פשוט לגידול ספרואידים תלת-ממדיים (3D)-קו-תרבותיים דסמופלסטיים שיכולים לייצר באופן טבעי ECM חזק ואינם דורשים מקורות מטריצה חיצוניים או פיגומים כדי לתמוך בצמיחתם.

תאי סטלט לבלב אנושיים (HPaSteC) ותאי PANC-1 משמשים להכנת תרחיף המכיל את התאים ביחס של 1:2, בהתאמה. התאים מצופים בפלטת U-well מצופה פולי-HEMA, 96 בארות בעלות חיבור נמוך. הצלחת היא צנטריפוגה כדי לאפשר לתאים ליצור גלולה ראשונית. הצלחת מאוחסנת באינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO₂, ואת המדיה מוחלף כל 3 ימים. ניתן לצלם לוחות במרווחי זמן ייעודיים כדי למדוד נפח כדורי. לאחר 14 ימי תרבית, נוצרים ספרואידים דסמופלסטיים בוגרים (כלומר נפח ממוצע של 0.048 + 0.012 מ"מ³ (451 מיקרומטר x 462.84 מיקרומטר)) וניתן להשתמש בהם להערכת טיפול ניסיוני. רכיבי ECM בוגרים כוללים קולגן-I, חומצה היאלורונית, פיברונקטין ולמינין.

Introduction

הפרוגנוזה הגרועה של סרטן הלבלב קשורה למגוון סיבות, ביניהן היעדר סמנים ביולוגיים קלים לגילוי המובילים לגילוי מאוחר. סיבה מרכזית נוספת היא הסטרומה הסמיכה המקיפה את הרקמה, מה שמוביל לאספקת דם מופחתת. שקיעת כמויות גדולות של מטריצה חוץ-תאית (ECM), אינטראקציה בין תאים, תאי אנדותל, תאי חיסון שונים, פריציטים, אוכלוסיית מיופיברובלסטים מתרבים ופיברובלסטים, ונוכחותם של תאים לא-ניאופלסטיים (יחד מהווים את התגובה הדסמופלסטית)¹, מהווים את הסטרומה העבה האחראית לעמידות הכימותרפית והרדיותרפית של PDAC². לתאי סרטן וסטרומה יש אינטראקציה מורכבת, דינמית ודו-כיוונית. למרות שאלמנטים מסוימים מחלישים או מאיצים את ....

Protocol

1. תרבית תאים דו-ממדית

1. לגדל תאי PANC-1 בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM), בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) בתנאים סטריליים. יש לגדול עד 70%-80% מפגש לפני המעברים, ואין להשתמש מעבר לקטע^ה-20 . עיין בתהליך המתואר בשלב 4.2.1.
   הערה: כנקודת התייחסות, 1 x 10⁶ תאים ב 20 מ"ל של מדיה צריך בערך 2-3 ימים כדי להגיע 70-80% מפגש.
2. גדל תאי HPaSteC במצע תאי Stellate בתוספת 2% FBS, 1% PenStrep ו-1% תוסף צמיחת תאי Stellate (SteCGS) באמצעות הערכה שסופקה על ידי היצרן בתנאים סטריליים. גדל בהתאם להוראות היצרן (עם כמה שינויים) כפי שמוצג בשלב 4.2.2 בצלוחית מצופה פולי-L-ליזין.
   1. דלג על שלב נטרו....

תוצאות

שלושה מהשלבים הקריטיים ביותר שמעורבים בגידול הספרואידים הם ספירת התאים הראשונית, שלבי הערבוב בזמן זריעת הספרואידים, וביצוע שינויי מדיה בזמן כדי לאפשר לכדוריות לגדול (איור 1). נוסף על כך, היכרות עם איור 2 של שינויי המדיה לאחר היום .......

Discussion

משך הזמן ויחסי התאים שנבחרו לגידול הספרואידים התבססו על מחקרים כפי שדווחו קודם לכן³⁸. כאשר ניסו למטב מחקרים אלה על ידי החלפת תאי NIH3T3 בתאי HPaSteC, נפחי הספרואידים ודפוסי אפופטוזיס נמצאו דומים מאוד לפרמטרים הממוטבים שדווחו (דווח עבור PANC-1: NIH3T3:: 120:12) כאשר יחסי PANC-1: H.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axio Observer inverted microscope	Carl Zeiss	0450-354
Cellometer Auto T4	Nexcelom Bioscience LLC	Auto-T4
DMEM, powder, high glucose	Gibco	12100046
Donkey anti-sheep conjugated with Alexa Fluor 568	Abcam	ab175712
Fetal Bovine Serum	Cytiva	SH3091003HI
Goat antirabbit IgG labeled with Alexa Fluor 488	Abcam	ab150077
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14175145
Human Pancreatic Stellate Cells (HPaSteC)	ScienCell	3830
Microscope Nikon	Nikon	Eclipse Ts 100
Nunc 96-Well Polystyrene Round Bottom Microwell Plates	Thermo Scientific	12-565-331
Olympus Fluoview FV1200 confocal laser	Olympus	N/A	Discontinued product
PANC-1	ATCC	CRL-1469
Poly-HEMA	Sigma	P3932
Rabbit polyclonal anti-laminin antibodies	Abcam	ab11575
Rabbit polyclonal anti-type I collagen antibodies	Abcam	ab34710
Sheep polyclonal anti-hyaluronic acid antibodies	Abcam	ab53842
Stellate cell media complete kit	ScienCell	5301
Trypsin	MP Biomedicals, LLC	153571	Trypsin solution prepared according to manufacturers protocol and used at 0.25%w/v
Trypsin Neutralization Solution (TNS)	ScienCell	103