חשיפת הפנוטיפ הפרופטוטי של מדולובלסטומה

Summary

תכולת הידרופרוקסיד שומנים מייצגת את האינדיקטור הנפוץ ביותר למוות של תאים פרופטוטיים. מאמר זה מדגים את ניתוח ציטומטריית הזרימה שלב אחר שלב של תכולת הידרופראוקסיד שומנים בתאים עם השראת פרופטוזיס.

Abstract

האינטראקציה של ברזל וחמצן היא חלק בלתי נפרד מהתפתחות החיים על פני כדור הארץ. עם זאת, כימיה ייחודית זו ממשיכה לרתק ולתהות, ומובילה למיזמים ביולוגיים חדשים. בשנת 2012, קבוצה מאוניברסיטת קולומביה הכירה באינטראקציה זו כאירוע מרכזי המוביל לסוג חדש של מוות תאי מווסת בשם "פרופטוזיס". המאפיין העיקרי של פרופטוזיס הוא הצטברות של הידרופרוקסידים ליפידים עקב (1) הגנה נוגדת חמצון לא מתפקדת ו / או (2) עקה חמצונית מוחצת, אשר לרוב עולה בקנה אחד עם תוכן מוגבר של ברזל חופשי בתא. זה נמנע בדרך כלל על ידי הציר האנטי-פרופטוטי הקנוני הכולל את טרנספורטר הציסטין xCT, גלוטתיון (GSH) ו- GSH peroxidase 4 (GPx4). מכיוון שפרופטוזיס אינו סוג מתוכנת של מוות תאי, הוא אינו כרוך במסלולי איתות האופייניים לאפופטוזיס. הדרך הנפוצה ביותר להוכיח סוג זה של מוות תאי היא באמצעות נוגדי חמצון ליפופיליים (ויטמין E, ferrostatin-1, וכו ') כדי למנוע את זה. מולקולות אלה יכולות להתקרב ולסלק נזקי חמצון בקרום הפלזמה. היבט חשוב נוסף בחשיפת הפנוטיפ הפרופטוטי הוא זיהוי הצטברות קודמת של הידרופרוקסידים ליפידים, שעבורם משתמשים בצבע הספציפי BODIPY C11. כתב היד הנוכחי יראה כיצד ניתן לגרום לפרופטוזיס בתאי מדולובלסטומה מסוג בר באמצעות השראות שונות: ארסטין, RSL3 ותורם ברזל. באופן דומה, ייעשה שימוש בתאי xCT-KO שגדלים בנוכחות NAC, ועוברים פרופטוזיס לאחר הסרת NAC. הפנוטיפ ה"מבעבע" האופייני נראה תחת מיקרוסקופ האור תוך 12-16 שעות מרגע הפעלת הפרופטוזיס. יתר על כן, ייעשה שימוש בצביעת BODIPY C11 ואחריה ניתוח FACS כדי להראות הצטברות של הידרופרוקסידים ליפידים ומוות תאים כתוצאה מכך באמצעות שיטת צביעת PI. כדי להוכיח את האופי הפרופטוטי של מוות תאי, ferrostatin-1 ישמש כסוכן ספציפי המונע פרופטוזיס.

Introduction

פרופטוזיס (Ferroptosis) הוא סוג חדש של חמצן תגובתי (ROS) התלוי במוות תאי¹. מלבד ROS, ברזל ממלא תפקיד מכריע בסוג זה של מוות תאי, ומכאן השם². השלב האחרון והביצועי של פרופטוזיס הוא הצטברות ברזל של נזק חמצוני של שומנים בקרום הפלזמה שבסופו של דבר מוביל לפגיעה בשלמות הממברנה וחדירות סלקטיבית, ולבסוף, מוות תאי על ידי בעבוע. אירוע הידרופרוקסידציה של שומנים הוא תופעה טבעית; עם זאת, התפשטותו ברחבי קרום התא נמנעת על ידי ההגנה נוגדת החמצון של התא. השחקן העיקרי בהקשר זה הוא חלבון Se גלוטתיון פרוקסידאז 4 (GPx4), שיכול להתקרב לממברנה ולהמיר הידרופרוקסידים ליפידים לנגזרות האלכוהול הפחות רעילות שלהם³. כוח ההפחתה של GPx4 מסופק בעיקר, אך לא רק, על ידי גלוטתיון (GSH), טריפפטיד המורכב מחומצות אמינו לא חיוניות: גליצין, גלוטמט וציסטאין. חומצת האמינו המגבילה את קצב הביוסינתזה של GSH היא ציסטאין⁴. למרות ציסטאין מסווג כחומצת אמינו לא חיונית, הדרישות שלה יכול בקלות לחרוג הייצור הפנימי שלה בתאים שגשוג מאוד (כגון תאים סרטניים). לפיכך הוא סווג מחדש בקבוצה של חומצות אמינו חיוניות למחצה. היבוא הדרוש של ציסטאין מתרחש בעיקר באמצעות מערכת Xc, המאפשרת יבוא של צורה מחומצנת (דומיננטית) של ציסטאין (aka ציסטין) על חשבון ייצוא גלוטמט⁵. מערכת Xc מורכבת מתת-יחידת תעבורה תלוית Cl-עצמאית Na+, המכונה xCT, ומתת-יחידה מלווה, המכונה CD98. עד לאחרונה, התכונות האנטי-פרופטוטיות של ציר xCT-GSH-GPx4 נתפסו כייחודיות ובלתי ניתנות לשכפול⁶. עם זאת, בשנת 2019^{תואר מסלול} אנטי-פרופטוטי חלופי, המורכב מיוביקווינול (קואנזים Q10) והאנזים הרגנרטיבי שלו - חלבון מדכא פרופטוזיס 1 (FSP1), ^7,8. זמן קצר לאחר מכן, דווח על מערכת ניקוי רעלים נוספת של הידרופראוקסיד שומנים הכוללת GTP cyclohydrolase-1/tetrahydrobiopterin (GCH1/BH4)⁹. עם זאת, נראה כי תפקידו המרכזי של ציר xCT-GSH-GPx4 במניעת פרופטוזיס אינו מאותגר.

במהלך העשור האחרון, ferroptosis נחקר בהרחבה במגוון סוגי גידולים, מראה פוטנציאל גדול כאסטרטגיה אנטי סרטנית (נסקר על ידי Lei et ^al.10). יתר על כן, דווח כי תאים סרטניים המפגינים עמידות גבוהה לכימותרפיה קונבנציונלית ו / או נטייה לשלוח גרורות רגישים באופן מפתיע להשראת פרופטוזיס, כגון מעכבי GPx4 11,12,13. עם זאת, בהקשר של גידולי מוח, הפוטנציאל של גורמים פרופטוטיים נותר במידה רבה לא נחקר. בעוד שסוג זה של מוות תאי נקשר קשר קשר הדוק עם פגיעה באיסכמיה מוחית¹⁴ומחלות נוירודגנרטיביות¹⁵, הפוטנציאל שלו בהקשר של גידולי מוח הוגבל בעיקר לגליובלסטומה, הגידול הממאיר הממאיר ביותר (נסקר על ידי Zhuo et ^al.16). מצד שני, הרגישות של מדולובלסטומה, הגידול הממאיר השכיח ביותר במוח בילדים וגורם מוביל לתמותה בילדות, לגורמים לפרופטוזיס עדיין לא נחקרה במידה רבה. למיטב ידיעתנו, קיימת ספרות מועטה שעוברת ביקורת עמיתים המקשרת בין פרופטוזיס למדולובלסטומה. עם זאת, כמה מחקרים גילו כי ברזל ממלא תפקיד מכריע בהישרדות, התפשטות ופוטנציאל גידולי של תאי גזע סרטניים מדולובלסטומה וגליובלסטומה (CSC)^17,18, מה שעלול להפוך אותם לפגיעים יותר להשראת פרופטוזיס. זה משמעותי במיוחד מכיוון שמדולובלסטומה ידועה לשמצה בתת-האוכלוסייה שלה של CSCs, או תאים יוזמים/מתפשטים של גידולים, שנראה כי הם אחראים במידה רבה לעמידות לכימותרפיה, הפצה והישנות¹⁹.

רגישות להשראת פרופטוזיס נחקרת בדרך כלל על ידי מדידת תכולת/הצטברות שומנים הידרופרוקסידים, אשר עשויה להוביל למוות תאי או לא. הגורמים הנפוצים ביותר להשראת פרופטוזיס הם (1) ארסטין, מעכב של טרנספורטר xCT²⁰,(2) RSL3, מעכב של האנזים GPx4², ו/או (3) תורמי ברזל, כגון פרו-אמוניום ציטראט (FAC)²¹. תכולת הידרופרוקסיד שומנים מוערכת באמצעות הבדיקה הסלקטיבית BODIPY 581/591 C11²², שיש לה עירור ופליטה מקסימלית ב 581/591 ננומטר במצבו המופחת. עם אינטראקציה וחמצון על ידי הידרופרוקסידים ליפידים, הגשושית מעבירה את העירור והפליטה המקסימלית שלה ל 488/510 ננומטר. בדרך כלל, עלייה משמעותית בתכולת הידרופרוקסיד שומנים קודמת למוות של תאים פרופטוטיים. מכיוון שפרופטוזיס אינו מוות תאי מתוכנת, אין מפל איתות מולקולרי המוביל לביצועו. לכן, הדרך היחידה לאשר את זה היא לפקח על תוכן hydroperoxide שומנים ולהשתמש מעכבים ספציפיים עבור סוג זה של מוות התא, כגון ferrostatin 1²³. Ferrostatin 1 הוא נוגד חמצון ליפופילי שיכול לחדור את תא השומנים של התא ולסלק hydroperoxides שומנים, ובכך למנוע אירועים ferroptotic.

Protocol

המחקר הנוכחי נערך באמצעות קווי תאים מסוג DAOY wild-type (WT) medulloblastoma, אשר גודלו בתרבית ב 37 ° C עם 5% CO₂ בתווך DMEM בתוספת 8% FBS. קו התאים שנמחק xCT נשמר באותם תנאים, עם ניסויים שבוצעו במדיה בתוספת 1 mM N-אצטיל-ציסטאין (NAC). התאים נבדקו באופן קבוע למיקופלסמה באמצעות ערכה מסחרית לזיהוי מיקופלסמה (ראו טבלת חומרים) וגודלו בתרבית עד המעבר^העשירי .

1. קציר וזריעת התאים

הערה: כל השלבים מבוצעים בטכניקות אספטיות סטריליות במכסה מנוע זרימה למינרית של תרבית רקמה. תאי DAOY medulloblastoma הם דבקים, כלומר ניתן להשליך את כל התאים שאינם מחוברים על ידי שטיפה עם מלוחים חוצצי פוספט (PBS) ללא Ca²⁺ ו- Mg²⁺.

1. לוקחים את צלחת הציר (צלחת פטרי, בקוטר 100 מ"מ) עם התאים ומסירים את התאים הצפים והמדיום מהצלחת באמצעות אספירטור.
2. הוסף 5-10 מ"ל של PBS לצלחת, לשטוף את התחתית עם תנועות מעגליות של המנה, ולאחר מכן להסיר את PBS מהצלחת באמצעות אספירטור.
3. מוסיפים 1 מ"ל טריפסין (דילול פי 10) לצלחת. דוגרים על הצלחת עד שהקשה עדינה על הצלחת משחררת את התאים. קח 10 מ"ל של מדיום תרבית DMEM בתוספת 8% FBS ולקצור באופן מכני את התאים מהצלחת.
4. העבר את מתלה התא לתוך צינור 15 מ"ל.
5. קח 500 μL של השעיית התא ולשים אותו cuvette לספירה. ספור את מספר התאים לכל מ"ל של השעיית תאים. במחקר זה נעשה שימוש במונה תאים אוטומטי (ראו טבלת חומרים).
6. חשב את הנפח הדרוש כדי לקחת מתרחיף התא כדי להכיל 1,00,000 תאים.
7. קח צלחת 6 באר והוסף את הנפח המחושב של תרחיף התא לתוך כל באר, ולאחר מכן להוסיף מדיה תרבית DMEM בתוספת 8% FBS ל 2 מ"ל בכל באר.

2. טיפול בתאים

הערה: הבקרה והטיפולים מתבצעים בשיטת טריפליקט. הקבוצות הן כדלקמן: בקרה (DMSO), 1 מיקרומטר של ארסטין, 0.3 מיקרומטר של RSL3, 250 מיקרומטר של FAC, 2 מיקרומטר של Ferrostatin 1, 1 מיקרומטר של ארסטין + 2 מיקרומטר של Ferrostatin 1, 0.3 של μM RSL3 + 2 μM של Ferrostatin 1, 250 μM של FAC + 2 μM של Ferrostatin 1. לצורך הניסוי דרושות ארבע לוחיות בנות 6 בארות, כפי שמצוין בטבלה 1). הפרטים המסחריים של כל הריאגנטים הדרושים מפורטים בטבלת החומרים.

1. 24 שעות לאחר הזריעה, להוסיף את הטיפול המתאים לבאר עם התאים.
2. השאירו את הכלים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ באינקובטור.

3. צביעת הידרופרוקסידים ליפידים של התאים המטופלים עם בדיקת BODIPY 581/591 C11

הערה: תמיסת המניות של הבדיקה הספציפית להידרופראוקסיד שומנים מוכנה ב- DMSO בריכוז של 1 mM. Aliquots של פתרון המניות מאוחסנים ב -20 °C בצינורות לא שקופים. עבור צביעה, להכין פתרון עבודה 2 מיקרומטר של הבדיקה במדיה DMEM בתוספת 8% FBS.

1. 6 שעות לאחר הטיפול, להתבונן בתאים תחת מיקרוסקופ אור (עיגול התא צריך להיות גלוי).
2. מוציאים את הכלים מהאינקובטור ומניחים אותם במכסה מנוע זרימה למינרית של תרבית רקמה.
   בעזרת שואב הסר את המדיה ואת התאים הצפים (המתים).
3. הוסף בעדינות 2 מ"ל של PBS לכל באר, שטוף את התחתית בתנועות מעגליות של לוחות 6 בארות, ולאחר מכן להסיר את PBS מן הבארות באמצעות שאיפה.
4. הוסף 2 מ"ל של פתרון העבודה של הבדיקה (ריכוז סופי של 2 מיקרומטר ב- DMEM בתוספת FBS).
5. השאירו את המנה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 30 דקות בחושך (ניתן לעטוף את הצלחות ברדיד אלומיניום).

4. ניתוח ציטומטריית זרימה של תכולת הידרופרוקסיד שומנים בתאים המטופלים

הערה: כל השלבים הבאים מבוצעים בחושך (אין אורות במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית).

1. מוציאים את הכלים מהאינקובטור ומניחים אותם בתוך מכסה מנוע זרימה למינרי של תרבית רקמות.
   בעזרת אספירטור, הסירו את תמיסת הצביעה.
2. הוסף בעדינות 2 מ"ל של PBS לכל באר, שטוף את התחתית בתנועות מעגליות של לוחות 6 בארות, ולאחר מכן להסיר את PBS מן הבארות באמצעות שאיפה.
3. חזרו על שלב השטיפה פעם נוספת ושאפו את כל שאריות ה-PBS מהבאר באמצעות אספירטור.
4. הוסיפו 150 μL של מגיב דיסוציאציה תאי זמין מסחרית (ראו טבלת חומרים) בתחתית כל באר ודגרו על הצלחת עד שהקשה עדינה של הצלחת תשחרר את התאים. קח 250 μL של חיץ FACS (PBS, 2 mM EDTA, 0.5% BSA) וקצור באופן מכני את התאים מהבארות.
5. העבר את התאים לצינור FACS המתאים (שסומן בעבר) באמצעות מכסה המסנן. מניחים את הצינור עם התאים על קרח בחושך עד לביצוע הניתוח (הניתוח צריך להתבצע תוך שעה לאחר הצביעה).
   הערה: ההגדרה והכיול של מכונת FACS תלויים בהתקן שבו נעשה שימוש (ראה טבלת חומרים).
6. צור ניסוי חדש ותן לו שם (Ferroptosis ב DAOY - hydroperoxides שומנים).
7. בתכנון הניסוי, בחר את הלייזר (488 ננומטר) ואת המסנן (FITC).
8. בנתוני תצוגה, בחר את גודל התא המתאים (>12 מיקרומטר), הגדר את מתחי PMT (אוכלוסיית התא אמורה להופיע ברביע הראשון של תרשים הנקודות SSC-H/FSC-H) ושער את תרשים הנקודות.
9. הוסף תרשים חדש - היסטוגרמה, עם FITC-A על ציר y וסולם לוגריתמי.
10. מערבלים את הדגימות בצינור FACS, מניחים אותן במכונת FACS וטוענים את הדגימה. הקלט 10,000 אירועי FSC singlet ותן שם לקובץ (לדוגמה, DAOY WT CTL 6h). יצא את הקובץ כ- .fcs.

5. צביעת פרופידיום יודיד (PI) של התאים המתים בעת הטיפול

הערה: תכנון הניסוי זהה לחלוטין לזה של מדידת הידרופראוקסיד שומנים (ראה שלב 1 ושלב 2).

1. 24 שעות לאחר הזריעה, מוציאים את הכלים מהאינקובטור ומניחים אותם במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית.
2. לאסוף את המדיה (עם תאים מתים) בצינור 15 מ"ל.
3. הוסף 1 מ"ל של PBS לכל באר, לשטוף את התחתית עם תנועות מעגליות של צלחות 6 באר, ולאחר מכן לאסוף את PBS לתוך הצינור עם המדיה המתאימה.
4. מוסיפים 200 מיקרוליטר טריפסין (דילול 10x) בתחתית כל באר ודגרים על הצלחת עד שהקשה עדינה של הצלחת משחררת את התאים. השתמש במדיה המתאימה + PBS כדי לקצור את התאים מהבארות.
5. צנטריפוגה את מתלה התא ב 180 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant באמצעות אספירטור.
6. השהה מחדש את גלולת התא ב 300 μL של חיץ FACS והניחו אותו על קרח עד לניתוח.
7. ממש לפני הניתוח, הוסף תמיסת PI (ראה טבלת חומרים) לריכוז סופי של 2 מיקרוגרם/מ"ל.

6. ניתוח ציטומטריית זרימה של תאים מתים 24 שעות לאחר הטיפול

הערה: ההגדרות והכיול של התקן FACS מתבצעים כפי שצוין קודם לכן (ראה שלב 4).

1. צור ניסוי חדש ותן לו שם (Ferroptosis in DAOY - מוות תאי).
2. בתכנון הניסוי, בחר את הלייזר (488 ננומטר) ואת המסנן (PE).
3. בנתוני תצוגה, בחר את גודל התא המתאים (>12 מיקרומטר), הגדר את מתחי PMT (אוכלוסיית התא צריכה להופיע ברביע הראשון של תרשים הנקודות SSC-H/FSC-H) ושער את תרשים הנקודה.
4. הוסף תרשים חדש - היסטוגרמה, עם PE-A על ציר y וסולם לוגריתמי.
5. מערבלים את הדגימות בצינור FACS, מניחים אותן במכונת FACS וטוענים את הדגימה.
6. הקלט 10,000 אירועי FSC singlet ותן שם לקובץ (לדוגמה, DAOY WT CTL 6h). יצא את הקובץ כ- .fcs.

7. ניתוח ציטומטריית זרימה של תכולת הידרופרוקסיד שומנים בתאי DAOY xCT-/-

הערה: תאי xCT-^/- נוצרו כפי שתואר קודם לכן²⁴.

1. עבור הניסוי הזה, זרעו את התאים כפי שמצוין בשלב 2, אבל במקום הטיפול, השלימו את המדיה עם 1 mM NAC למשך הלילה.
2. למחרת, שמרו על NAC בקבוצה אחת והוציאו אותו מהשנייה.
3. בצע את ניתוח ציטומטריית זרימה של תוכן hydroperoxide שומנים בדיוק באותו אופן כמתואר בשלב 6.

8. ניתוח תוצאות ציטומטר הזרימה

1. פתח את מסמך ה- .fcs בתוכנת FlowJo (ראה טבלת חומרים).
2. לחץ פעמיים על הקובץ הבודד כדי לפתוח את כל האירועים (לא רק סינגלים של FCS) שנרשמו במדגם הבודד (SSC-A / FSC-A dot plot). מכיוון שההגדרות הן כאלה שהגטינג שנעשה במכונה לא נשמר, יש צורך לעשות את השער שוב ולתת שם לאוכלוסייה (למשל, DAOY WT).
3. לחץ פעמיים על האוכלוסייה המגודרת כדי לפתוח חלון נוסף עם ההיסטוגרמה.
4. שנה את ציר Y למסנן הפלואורסצנטי שבו נעשה שימוש (Comp-FITC/PE-A).
5. שנה את ציר X למודאלי (נרמל כל שיא למצב שלו, כלומר, ל- % ממספר התאים המרבי שנמצא בסל מסוים).
6. העתק את ההיסטוגרמה לעורך הפריסה. חזור על פעולה זו עבור כל הדגימות, ובכל פעם שהיסטוגרמות חדשות מודבקות בעורך הפריסה, גרור אותה מעל הקודמת כך שההיסטוגרמות יהיו בשכבת-על (חצי הסטה).

תוצאות

קו תאי המדולובלסטומה DAOY תורבית בתווך DMEM סטנדרטי בתוספת 8% FBS עד שהגיע לכ-60% מפגש. ביום הניסוי נקצרו תאים, ו-1,00,000 תאים לבאר צופו בצלחות בנות 6 בארות, לפי טבלה 1. למחרת, תאים (בטריפליקט) טופלו ב-1 מיקרומטר של ארסטין, 0.3 מיקרומטר של RSL3, או 250 מיקרומטר של FAC. לאחר מכן הונחו הלוחות באינקובטור בטמ...

Discussion

סימן ההיכר העיקרי של מוות תאי פרופטוטי הוא הצטברות בלתי מבוקרת של הידרופרוקסידים ליפידים בקרום הפלזמה. נזק חמצוני זה עלול להתרחש באופן אנזימטי או לא אנזימטי, אך בכל מקרה, התגובה תלויה בברזל/מזורזת, מה שמסביר את שמו של סוג זה של מוות תאי. הידרופרוקסידציה של שומנים מוערכת לעתים קרובות בעקיפי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BODIPY 581/591 C11	Thermo Fisher	D3861
Cell counter	Beckman	Coulter Z1
DMEM medium	Gibco	10569010
Erastin	Sigma-Aldrich	E7781-5MG
Ferroamminium citrate	Acros Organics	211842500
Ferrostatin-1	Sigma-Aldrich	SML0583-25MG
Fetal bovin serum (FBS)	Dominique Dutcher	500105N1N
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACS Melody
Gibco StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Thermo Fisher	11599686
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A7250
PlasmoTest Mycoplasma Detection Kit	InvivoGen	rep-pt1
propidium iodide	Invitrogen	P3566
RSL3	Sigma-Aldrich	SML2234-25MG
Trypsin - EDTA 10X - 100 mL	Dominique Dutcher	X0930-100