ייצוב אוסטאוטומיה של עצם הירך עם קיבוע פלטה באמביסטומה מקסיקנית

Summary

מוצג פרוטוקול לניתוח אוסטאוטומיה של עצם הירך עם שימוש בקיבוע לוחית פנימית באקסולוטלים בוגרים. ההליך יכול לשמש לביצוע מחקרים השוואתיים על התחדשות גפיים וריפוי שברים בדו-חיים ימיים.

Abstract

האקסולוטל (Ambystoma mexicanum) הוא אורגניזם מודל מבטיח לרפואה רגנרטיבית בשל יכולתו יוצאת הדופן לחדש איברים שאבדו או ניזוקו, כולל גפיים, מוח, לב, זנב ועוד. מחקרים על אקסולוטל שופכים אור על מסלולים תאיים ומולקולריים השולטים בהפעלת אבות ושיקום רקמות לאחר פציעה. ידע זה יכול להיות מיושם כדי להקל על ריפוי של פציעות regeneration-incompetent, כגון עצם לא איחוד. בפרוטוקול הנוכחי מתואר ייצוב אוסטאוטומיה של עצם הירך באמצעות מערכת קיבוע לוחית פנימית. ההליך הותאם לשימוש בבעלי חיים ימיים (axolotl, Ambystoma mexicanum). נעשה שימוש באקסולוטלים של ≥20 ס"מ מקצה חוטם לזנב עם עצם הירך המקבילה בגודל עכבר מלא, ותשומת לב מיוחדת הוקדשה למיקום הצלחת וקיבועה, כמו גם לטיפול שלאחר הניתוח. טכניקה כירורגית זו מאפשרת קיבוע עצם סטנדרטי ומיוצב ויכולה להיות שימושית להשוואה ישירה להתחדשות גפיים אקסולוטליות ולמחקרים מקבילים של ריפוי עצם בקרב דו-חיים ויונקים.

Introduction

האקסולוטל (Ambystoma mexicanum) הוא מודל חשוב להתחדשות איברים, כולל הזנב, חוט השדרה, המוח, הלב, הזימים והגפיים 1,2,3,4,5. מחקרים מפורטים של התחדשות גפיים אקסולוטליות חשפו מנגנונים של התמיינות תאים והיווצרות מאגר תאי גזע, בלסטמה, באתר הקטיעה. בשל יכולתם של תאי הבלסטמה לשחזר את כל חלקי הגפיים החסרים, כולל שלד בדוגמת ^6,7, האקסולוטל נראה כאורגניזם מודל אטרקטיבי למחקרי ריפוי עצם. לאחרונה, מספר מחקרים התמקדו יותר בביולוגיה של העצם באקסולוטלים, ותיארו מורפולוגיה של השלד, הרכב התא ודינמיקת אוסיפיקציה.

נמצא ביונקים כי תהליך ריפוי העצם בעצמות ארוכות מתרחש באמצעות אוסיפיקציה אנדוכונדרלית ומורכב ממספר שלבים: המטומה, רקמת גרגיר והיווצרות יבלות רכות, אוסיפיקציה של יבלות קשות ועצם ארוגה, ועיצוב מחדש של עצם⁸. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי ניתן לראות שלבים דומים בריפוי עצם אקסולוטלית⁹.

עד כה, שברים אקסולוטליים נחקרו במערכת לא מיוצבת, שבה עצם פשוט נחתכת עם מספריים iridectomy. השברים הגדולים נוצרו בזאוגופוד, שם מבוצעת אוסטאוטומיה על אחת העצמות, ואילו השנייה משמשת כתמיכה^10,11. לעומת זאת, שברים נחקרים באופן שגרתי ביונקים, כולל חולדות ועכברים, באמצעות מערכות קיבוע אמינות, כגון סיכות תוך מדולריות ולוחות יישור עצם, כדי לשלוט בגודל השבר ולהבטיח את יישור העצם.

לפיכך, השיטה נועדה להבטיח קיבוע מיוצב ואחיד של עצם הירך האקסולוטלית לפני אוסטאוטומיה. על מנת להפוך את מחקרי האקסולוטל לדומים יותר ליונקים, כולל עכברים ובני אדם, נלקחו בחשבון פין תוך-מדולרי¹², קיבוע לוח חיצוני^{13,14 וקיבוע} לוח יישור עצם פנימי 15,16,17. האחרון הוכח כמבטיח קיבוע עצם תקין ומאפשר יצירת רווח בגודל מסוים באמצעות חתך אחד או שניים עם מסור Gigly בקוטר מסוים. מכיוון שהאקסולוטלים מייצגים את הזחלים הימיים של Ambystoma mexicanum, ייתכן שקיבוע החיצוני גרם לסיבוכים לאחר הניתוח עקב הפצע הפתוח והמגע עם מים. מכיוון שאקסולוטלים אינם מפתחים מרכזי אוסיפיקציה שניוניים אפילו עד שלב מאוחר מאוד בהתפתחותם (גיל^{20 18}), ולכן לא ניתן למנוע מהציפורן התוך-מדולרית הסטנדרטית המשמשת בעכברים לנקב את האפיפיסים, הוחלט ליישם שיטת קיבוע לוחות פנימית על אקסולוטלים גדולים. באקסולוטלים גדולים, גודל עצם הירך ומידת התנודה דומים לאלה של עכבר בוגר, ובכך מאפשרים אוסטאוטומיה דיאפיסיאלית אמצעית עם קיבוע לוחית טיטניום¹.

גודל פער השבר קובע במידה רבה את דינמיקת הריפוי ואת תוצאתו. לדוגמה, בעכבר, שברים מיוצבים בקוטר 0.25 מ"מ מתאחים בעיקר באמצעות אוסיפיקציה תוך-ממברנית בשל גודלם הקטן וייצובם הנוקשה; שבר של 0.7 מ"מ מרפא על ידי אוסיפיקציה אנדוכונדרלית, עם היווצרות של יבלת סחוס סביב השבר; פגמים גדולים, כגון פגמים בגודל קריטי של 3.5 מ"מ אינם מחלימים לחלוטין ולכן משמשים למדל שבר עצם ללא איחוד¹⁶. במחקר זה, פרוטוקול קיבוע הלוח של עצם הירך האקסולוטלית לפני האוסטאוטומיה באמצעות דוגמה של פער שבר של 0.7 מ"מ נקבע במטרה הסופית להשוות את ריפוי עצם האקסולוטל לזה של עכבר⁹.

לאחר אוסטאוטומיה עברו השברים תהליך של תנודה אנדוכונדרלית, אם כי איטי יותר מאשר בעכברים, אולי בשל אורח החיים הימי של האקסולוטים וקצב חלוקת התאים האיטי יותר. בשיטה המוצגת כאן, אוסטאוטומיה מרווח 0.7 מ"מ עם קיבוע לוח קשיח מוצג; עם זאת, גדלים מרווחים אחרים וקיבועים גמישים למחצה, כמו גם לוחות מחומרים שונים, אפשריים. בסך הכל, השיטה המוצגת כאן יכולה לשמש לקיבוע עצם סטנדרטי ותהיה מועילה למחקרים המשווים התחדשות גפיים אקסולוטליות לריפוי עצם או לחקר ריפוי עצם באקסולוטלים בתנאים שונים כדי להבטיח קיבוע שבר סטנדרטי.

Protocol

ההליך הבא בוצע באישור שופט השלום בווינה (GZ: MA 58-65248-2021-26). בני 5-8 שנים, ≥ קצה חוטם לזנב בקוטר 20 ס"מ (חוטם עד קצה הזנב) אקסולוטלים ארוכים (Ambystoma mexicanum) שימשו לניתוחי שברים וקטיעות. גברים ונקבות כאחד שימשו לניתוחים. אקסולוטלים גודלו במכון המחקר לפתולוגיה מולקולרית. כאב וסיכון לזיהומים נוהלו באמצעות משככי כאבים ואנטיביוטיקה מתאימים כדי להבטיח תוצאה מוצלחת. הריאגנטים והציוד ששימשו למחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת בעלי חיים

1. רחצו את בעל החיים בתמיסת בנזוקאין 0.03% למשך כ-15-20 דקות עד שמגיעים לטשטוש מלא ואין תנועה רפלקסיבית עם נגיעת הגפיים בפינצטה.
2. הניחו את בעל החיים עם הצד הגחוני כלפי מטה על מגבות נייר רטובות ספוגות בתמיסת בנזוקאין 0.03% וכסו אותה במגבות נייר ספוגות בנזוקאין. עורם של בעלי חיים ימיים, כגון אקסולוטלים, רגיש לייבוש, ולכן חיוני לכסות את פני הגוף כדי למנוע התייבשות ולהבטיח נשימה עורית (עור).
3. מתחו את הגפה האחורית לניתוח באמצעות מלקחיים טבעתיים. אין להחיל ריאגנטים חיטוי, כגון אתנול, שכן העור axolotl רגיש לכימיקלים בקלות מגורה. במקום זאת, השתמש 0.7x PBS (A-PBS) עם 50 U/mL פניצילין ו 20 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין לניקוי הגפה ולאחר מכן להשקיית עצם לאחר ניסור.
   הערה: הזיהום בדרך כלל אינו מדאיג את הניתוחים המבוצעים באקסולוטלים. עם זאת, בשל האופי המימי של בעלי חיים אלה והתפרים המונחים על פני העור, אנו ממליצים על שימוש באנטיביוטיקה כדי למנוע כל זיהום של אתר הניתוח.

2. ניתוח

הערה: יש לעקר את כל כלי הניתוח. שיטות עיקור נפוצות כגון עיקור בחום, אוטוקלאבינג ושטיפה באתנול 70%, ולאחר מכן הסרה יסודית של שאריות האלכוהול, מתאימות למטרה זו. אם אתם מנתחים מספר בעלי חיים, יש לעקר כלים בין לבין באמצעות מעקר חרוזים חם או אתנול 70%.

1. בצע חתך אורכי לטרלי (1.5-2 ס"מ) עם אזמל מעל עצם הירך המשתרעת על פני כל הירך בגפה האחורית העליונה. כדי לעשות זאת, למשש את העצם לפני חיתוך העור.
2. בזהירות לעקור את השרירים והעצבים מאתר הניתוח מבלי לחתוך. השתמש במלקחיים קמורים כדי לעשות זאת ביעילות.
3. הניחו בעדינות מלקחיים מורכנים מתחת לעצם הירך כדי לחשוף אותה לקראת הניתוח.
4. הניחו לוחית קיבוע קשיחה בקוטר 7.75 מ"מ בעלת 4 חורים יחד עם דיאפיזה של עצם הירך, הימנעו מנגיעה במפרקים, ואבטחו אותה במצב מיושר עם מלקחיים.
5. השתמש בארבעה ברגי טיטניום בקוטר 2 מ"מ כדי לחבר את העצם לצלחת.
   הערה: הברגים המשמשים בפרוטוקול זה הם בעלי עיצוב מורכב ומורכבים מ-4 חלקים: החלק העיקרי (יוברג לתוך העצם), ראש בורג (מאפשר הוצאת הברגים והצלחת באמצעות מפתח הקופסה המרובע), צוואר צר יותר (המשמש כנקודת שבירה לאחר הידוק הבורג בעצם) וידית בורג (המשמשת לחיבור למברג ולמכשיר הנחיית המסור).
6. סדר חיבור הבורג חשוב. התחל תחילה עם הברגים הפנימיים, ולאחר מכן עם שני הברגים החיצוניים כדי לוודא שהצלחת מיושרת עם ציר העצם. השתמש מקדחה ידנית כדי ליצור את החור הראשון בעצם להחדרה קלה של הבורג, ואחריו חריץ בורג¹ . יש לקדוח באמצע היקף העצם כדי למנוע עצם דקה יותר בצד אחד, מה שעלול לגרום לשבר עצם ספונטני. השתמש בהשקיה עם PBS 0.7x + 1% Pen/Strep במהלך הקידוח. אין לנתק את הידית של הברג(ים) 1^st (אופציונלי: 1^st ו-2^nd).
7. יש למרוח את התקן הנחיית המסור על הברג(ים) 1^st (אופציונלי: 1^{st ו-2 nd} ) וליישר אותו עם העצם והצלחת.
   הערה: בפרוטוקול זה, לוחית, ברגים, התקן הנחיית מסור ומסור מסופקים על-ידי אותו יצרן וממוטבים כך שיתאימו זה לזה. מכשיר הנחיית המסור יכול להגיע בגדלים שונים כדי להתאים לצלחות וגדלי מסור שונים.
8. השתמש במכשיר הנחיית המסור כדי לקדוח ולהכניס את שאר הברגים. ודא יישור של הצלחת עם העצם. נתקו את ידיות הברגים.
9. מניחים חתיכת סרט פלסטיק (6-7 מ"מ על 4-5 ס"מ), מעוקרים על ידי ניגוב עם 70% אתנול ולאחר מכן autoclaved או מעוקר בחום (140 ° C במשך 4 שעות), מתחת עצם הירך כדי למנוע נזק לרקמות רכות במהלך תהליך אוסטאוטומיה.
   הערה: למטרה זו, חתיכת סרט פלסטיק, לחתוך שקית לעיקור בחום ניתן להשתמש.
10. הניחו מסור תיל בין העצם לסרט הגנה.
11. חותכים עצם באמצעות מסור תיל Gigly בקוטר 0.66 מ"מ, ויוצרים חתך יחיד של 0.7 מ"מ בעצם הירך. השתמש בהשקיה קבועה עם PBS 0.7x + 1% Pen/Strep במהלך הניסור כדי למזער נזק וחיכוך לרקמות.
12. הסר את המסור ואת מדריך המסור והשתמש במברג כדי לנתק את ידיות הבורג מהברגים.
13. הסר את סרט ההגנה והשקה את אזור הניתוח עם PBS 0.7x + 1% Pen/Strep.
14. כסו את החלק העליון של הצלחת ואת הברגים בשעוות דבורים סטרילית כדי להגן על העור והשרירים מפני גירוי בשולי הברגים.
15. הניחו את השרירים והעור על גבי שעוות דבורת העצם.
16. סגור את אתר החתך בתפר סינתטי 7.0 (פוליפרופילן/פוליאתילן) באמצעות תפרים פשוטים קטועים. תפר סינתטי משמש כדי למזער זיהום עם חיידקים ופטריות שנולדו במים.

3. ניהול לאחר הניתוח

1. כדי לעורר מחדש את החיה, הניחו אותה במיכל עם מי בריכה מלאכותיים טריים, בתוספת 50 U/mL פניצילין, 20 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו Butorphanol analgetic (0.5 מ"ג / ליטר מים).
2. התבונן בחיה כדי להתחיל להזיז זימים, לעשות צעדים, ולשחות - בדרך כלל בתוך 1 שעה לאחר הניתוח.
3. שמור את בעל החיים במשך 3 ימים במי בריכה מלאכותיים עם 50 U/mL פניצילין ו 20 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין לפני החזרתו למיכל ההחזקה. כדי להבטיח שיכוך כאבים, להוסיף Butorphanol (0.5 מ"ג / ליטר מים).
4. יש לוודא שהתפרים נשארים במקומם ומתרחש ריפוי פצעים תקין.

תוצאות

ההליך הכירורגי המתואר כאן (איור 1) נמשך בין 20 דקות ל-30 דקות ודורש מנתח ועוזר. לחלופין, השתמש במיקרוסקופ דיסקציה דו-עינית או במערכת זכוכית מגדלת.

איור 1...

Discussion

השיטה המתוארת כיום של קיבוע לוחית הירך ואוסטאוטומיה מאפשרת את יישומה בבעלי חיים ימיים, כגון Ambystoma mexicanum (axolotl). שיטה כירורגית זו שימשה לאחרונה להשוואת ריפוי שברים והתחדשות גפיים באקסולוטלים לריפוי שברים בעכברים⁹. כמו בעכברים, ניתן לחבר לוחית קיבוע בעלת 4 ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.66 mm Gigly wire saw	RISystem	RIS.590.120
7.0 Optilene suture	Braun	C3090538
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501	dilute to 0.03%  prior to using
Butorphanol (Butomidor 10 mg/mL)	Richter Pharma AG	-	dilute to 0.5 mg/L  prior to using
Drill bit 0.30 mm	RISystem	RIS.590.200
Dumont #5 Forceps - Standard/Inox	Fine Science Tools	11251-20
Hand drill	RISystem	RIS.390.130	better to have at least 3 pieces
Micro CT data analyzer	Bruker, Billerica, MA, USA	SkyScan NRecon software
Micro CT specimen scanner	Bruker, Billerica, MA, USA	SkyScan 1172
Moria MC31b Iris forceps - smooth, curved, 10 cm	Fine Science Tools	11373-12FST	2 pieces
MouseFix Drill-&Saw guide 1.75 mm, rigid	RISystem	RIS.301.102
MouseFix plate 4 hole, rigid	RISystem	RIS.401.110
MouseFix screw, L =2.00 mm	RISystem	RIS.401.100	need 4 per bone
Narrow Pattern Forceps	VWR	FSCI11002-12
penicillin/streptomycin	Gibco	15140-122
Ring forceps	Fine Science Tools	11103-09
scalpel #15	B Braun, Thermo Fischer Scientific	5518032
Square box wrench 0.50 mm	RISystem	RIS.590.111
Sterile bone wax, 2.5 g	Ethicon, Johnson & Johnson	W810
Student Fine Scissors - Straight/11.5cm	Fine Science Tools	91460-11