במאמר זה אנו מתארים מערכת נוקלאופקציה שנועדה לשפר את יעילות העברת הגנים בתאי גזע עצביים מורחבים (NSCs) שבודדו מהאזור התת-חדרי של המורין הבוגר. הממצאים מראים כי שיטה זו משפרת באופן משמעותי את ההפרעה הגנטית בתאי גזע גזעיים, עולה על היעילות של פרוטוקולי טרנספקציה מסורתיים ומשפרת את שיעור הישרדות התאים.
בידוד והתרחבות של תאי גזע עצביים (NSCs) מהאזור התת-חדרי (SVZ) של מוח העכבר הבוגר יכולים להיות מושגים בתווך בתוספת גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF) וגורם גדילה אפידרמלי (EGF) כמיטוגנים, המייצרים אגרגטים שבטיים הידועים בשם נוירוספרות. מערכת חוץ גופית זו היא כלי רב ערך לחקר פוטנציאל המל"ל. טרנספקציה של siRNAs או גנים הנישאים בפלסמידים יכולה לשמש כדי לגרום להפרעות לביטוי גנים ולחקור ביולוגיה של NSC. עם זאת, העברת חומצות גרעין אקסוגניות לתרביות NSC מאתגרת בשל היעילות הנמוכה של העברת תאי מערכת העצבים המרכזית (CNS). כאן, אנו מציגים מערכת נוקלאופקציה משופרת המשיגה יעילות גבוהה של העברת גנים ב- NSCs מורחבים מ- SVZ מורין בוגר. אנו מראים כי שיטה פשוטה יחסית זו משפרת הפרעות גנים בתאי גזע גזעיים בוגרים, ועולה על פרוטוקולי טרנספקציה מסורתיים עם שיעורי הישרדות העולים על 80%. יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם ב- NSCs מבודדים ראשוניים, ומספקת התקדמות מכרעת במחקרי תפקוד גנים באמצעות מניפולציה של ביטוי גנים באמצעות הפלה או ביטוי יתר בתרבויות נוירוספרה.
תאי גזע עצביים (NSCs) הם תאי גזע רב-פוטנטיים השוכנים במוח. תאים אלה הם בעלי יכולת התחדשות עצמית והתמיינות לשלוש השושלות העצביות: אסטרוציטים, אוליגודנדרוציטים ונוירונים1. כתוצאה מכך, תאי עצב עצביים ממלאים תפקיד מכריע בנוירוגנזה בוגרת אצל יונקים, תהליך שבו נוירונים חדשים נוצרים במוח2. NSCs שוכנים בעיקר בשני אזורים במוח הבוגר המכונים נישות נוירוגניות: האזור התת-חדרי (SVZ) לאורך דפנות החדרים הצדיים והאזור התת-גרגירי (SGZ) בתוך הבליטה המשוננת של ההיפוקמפוס 3,4. תאי גזע עצביים (הידועים גם בשם תאי B) ב-SVZ, הנישה הנוירוגנית הפעילה ביותר בעכבר הבוגר, מתחדשים מעצמם ומייצרים אבות מגבירי מעבר (TAPs או C cells) שמתמיינים לאחר מכן לנוירובלסטים (תאי A). נוירובלסטים אלה נודדים דרך זרם הנדידה הרוסטרלי (RMS) אל פקעות הריח (OB), שם הם עוברים התמיינות מלאה לנוירונים בין-עצביים, ומשתלבים במעגלים הקיימים 3,4,5,6.
הבנת יחסי הגומלין המורכבים של רמזים מולקולריים ואותות המווסתים תאי גזע עצביים בתוך נישות אלה חשובה כדי לרתום את הפוטנציאל שלהם ליישומים טיפוליים. לשם כך פותחו שיטות שונות לחקר אוכלוסיית תאים זו, החל מתרבית ראשונית סלקטיבית של תאי גזע גזעיים ועד לבחירת תאים באמצעות סמני שטח 7,8,9,10. כתב היד הנוכחי מפרט את הבידוד והטיפוח של SVZ NSCs במבחנה באמצעות מדיום סלקטיבי ללא נסיוב המכיל את שני המיטוגנים: גורם גדילה פיברובלסט בסיסי (bFGF) וגורם גדילה אפידרמלי (EGF). תווך זה מאפשר התפשטות תאים ושומר על הגבעול של תאי גזע עצביים המתקבלים מ- SVZ של מוחות עכברים בוגרים היוצרים צברים שבטיים חוץ גופיים, תלת ממדיים ולא דבקים הידועים כנוירוספרות9. תרביות נוירוספריות משמשות פלטפורמה מבוקרת למניפולציה וללימוד של המנגנונים והגורמים המולקולריים המשפיעים על התפשטות המל"ל, התחדשות עצמית, התמיינות והישרדות11. יש לציין כי מספר הנוירוספרות הראשוניות הנוצרות בתרבית מאפשר להעריך את מספר הנוירוספרות המלכליות הקיימות ב-SVZ in vivo, מה שהופך אותו לכלי רב עוצמה לחקר ההשפעות של תנאים שונים על מאגר NSC הבוגר12,13. יתר על כן, ברגע שהתרבות הראשונית מבוססת, NSCs יכולים ליצור אגרגטים חדשים (נוירוספרות משניות) כאשר הם עוברים דרך חלוקות סימטריות בתנאי התפשטות14. לפיכך, זריעה בצפיפות נמוכה של תאים נוירוספריים משניים (בדיקת שבטים) יכולה לשמש להערכת קצב ההתחדשות העצמית של תרביות אלה 4,15,16,17.
למרות הפוטנציאל של נוירוספרות בחשיפת המנגנונים השולטים ברגולציה של NSC, יש חוקרים המפקפקים בתוקפם של ממצאי מבחנה, וטוענים כי התנאים המלאכותיים שבהם תאים גדלים עשויים שלא לשכפל נאמנה את המיקרו-סביבה המורכבת in vivo של נישות נוירוגניות 18,19,20,21,22. נקודה שנויה במחלוקת נוספת סובבת סביב ההטרוגניות הנצפית בנוירוספרות. עם זאת, מאמינים כי שונות זו משקפת את החלוקות הסימטריות והא-סימטריות של המל"ל המתרחשות באופן טבעי ב-vivo23,24. יתר על כן, אימות שנערך לאחרונה תמך בשימוש בתרביות NSC לחיזוי מנגנונים הפועלים בתוך הנישה הנוירוגנית SVZ in vivo, ומספר מחקרים הוכיחו כי NSCs בתרבית במבחנה שומרים במדויק על הפרופיל הטרנסקריפטומי שנצפה in vivo11,25.
לכן, תרבויות נוירוספריות לא רק משמשות כשיטה לחקור את יכולות ההתפשטות וההתמיינות של NSC, אלא גם מציעות מערכת לחקר ההשפעה של גנים השולטים בביולוגיה של NSC. טכניקה מרכזית לחקר תפקוד גנים ב- NSCs היא הפרעה בביטוי גנים. siRNAs או גנים המועברים דרך פלסמידים יכולים להיות מועתקים לתרביות תאים, וכתוצאה מכך להפיל או להגביר את הרגולציה של גן המטרה. גישה רב-תכליתית זו מפחיתה באופן משמעותי את הזמן והעלות בהשוואה לביסוס תרביות באמצעות עכברי נוקאאוט מותנים, ומציגה אפיק מבטיח לפענוח הבסיס הגנטי של נוירוגנזה ובחינת סיכויים טיפוליים. שינוי הביטוי של גנים ספציפיים בתאי גזע מל"ל מאפשר לווסת את התנהגותם, ולהשפיע על תהליכים ביולוגיים חיוניים כגון התפשטות, התמיינות והגירה. עם זאת, האפשרות של הדבקת NSCs, במיוחד בתוך נוירוספרות עכבר, מציבה אתגרים בולטים. המבנה התלת-ממדי של נוירוספרות פוגע ביעילות הטרנספקציה, ולעתים קרובות התוצאה היא שיעורים נמוכים של העברת חומצות גרעין אקסוגניות מוצלחות, המגבילות את היקף המניפולציה הגנטית26,27. בנוסף, הליכי טרנספקציה יכולים להשפיע לרעה על יכולת הקיום והפונקציונליות של התא27. בהקשר זה, אנו מציגים את מערכת הנוקלאופקציה כשיטה להפחתת נזק לתאים, השגת שיעור הישרדות גבוה והבטחת יעילות גבוהה יותר במבחני העברת גנים המשמשים להפרעה לתרביות NSC.
כתב יד זה נועד להמחיש את ההליך לבידוד, הרחבה וגרעין של תאי גזע עצביים מהנישה הנוירוגנית SVZ הבוגרת כדי להפריע לגנים באמצעות מערכת התרבית הנוירוספרית. שיטה זו עולה על יעילותם של פרוטוקולי הטרנספקציה המסורתיים, ומציגה שיעורי הישרדות גבוהים משמעותית ויעילות משופרת של העברת גנים בין תאי היעד.
כל הניסויים שבוצעו עם בעלי חיים אושרו בעבר על ידי הוועדה האתית של אוניברסיטת ולנסיה ואושרו על ידי Conselleria de Agricultura, Ganadería y Pesca, Generalitat Valenciana (ספרד).
1. תרבות ראשונית של נוירוספרות
טבלה 1: פתרונות מדיה תרבותית. המתכון של מדיום הבקרה מתואר. תמיסת תערובת הורמונים מעורבבת מראש נעשתה. מלאי פתרונות הורמונליים ניתן להכין מראש כפי שצוין ומאוחסן ב -20 ° C. לפני תרבית תאים, להשלים את מדיום הבקרה עם EGF ו bFGF כדי להכין מדיום שלם. מפרטי אחסון, מלאי וריכוזי עבודה מסופקים עבור כל רכיב. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
2. הרחבת תרבויות נוירוספריות
טבלה 2: צלחות וצלוחיות המשמשות לגידול. הממדים והנפחים של לוחות הזריעה והצלוחיות הנפוצים ביותר מסופקים. הטבלה כוללת את הקוטר, שטח הגידול והנפח הבינוני המשמש לכל כלי שיט, יחד עם דוגמה למספר ה-NSCs שיש לזרוע בתנאי התפשטות (10,000 תאים לסמ"ק2). אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
3. נוקלאופקציה של תרבויות נוירוספריות
תנאי תרבית אופטימליים מאפשרים בידוד והרחבה של NSCs בוגרים שמקורם ב-SVZ במבחנה
תרביות של NSCs שמקורם ב-SVZ הבוגר שימשו כשיטת מבחנה רבת ערך לחקר המנגנונים המולקולריים ואותות הנישה המווסתים את ה-NSCs בתוך המיקרו-סביבות הספציפיות שלהם. הבדיקה הנוירוספרית המתוארת בכתב יד זה שימשה לבחינת ספירת המל"ל בתוך SVZ הבוגר. רקמת SVZ בודדה ממוחם של עכברים בני 3 חודשים, נותקה ותורבתה בתווך NSC מלא בתוספת EGF ו-bFGF או כל אחד בנפרד. לאחר 10 ימים במבחנה (DIV), הספירה הכוללת של הספירות הראשוניות שנוצרו תחת שלושת תנאי התרבית השונים האלה כומתה באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (איור 2A,B). באופן מדהים, הממצאים שלנו מראים שנוכחות של EGF הובילה להיווצרות מקסימלית של ספירות ראשוניות, וזה ניכר בספירה המופחתת של ספירות ראשוניות שנצפו בתרבויות עם bFGF בלבד (איור 2A,B). כדי להעריך את יכולת ההתחדשות העצמית של תאי גזע עצביים בתנאים בינוניים מגוונים, התאים עברו תת-תרבית וצופו בצפיפות נמוכה (5 תאים/μL) במדיה בתוספת שילובים של מיטוגנים שהוזכרו לעיל. כימות ספירות משניות גילה כי SVZ NSCs זקוקים לפחות ל-EGF כדי לחדש את עצמם ביעילות, וכי השילוב של EGF ו-bFGF משפר את יכולת ההתחדשות העצמית של תאים (איור 2B). יתר על כן, לצורך ניתוח מפורט של דינמיקת גדילה על פני תנאי מדיה מגוונים, נרשם מספר התאים שנזרעו והושגו לאורך 7 מעברים. עקומות גדילה שהתקבלו מתנאי מדיה שונים אישרו כי תרביות שקיבלו תוספת של EGF בלבד או בשילוב עם bFGF הציגו דינמיקת גדילה משופרת בהשוואה לתרבויות שקיבלו תוספת בלעדית של bFGF (איור 2C). יחד, ממצאים אלה מאששים כי שימוש בו זמנית הן ב-EGF והן ב-bFGF משפר את תשואת הטיפוח במבחנה של NSC.
על מנת לחקור את ספירת המל"ל בתוך SVZ בגילאים שונים לאחר הלידה ולהעריך את ההשפעה של הזדקנות עכברים על יעילות תרבית נוירוספרה, נותחה רקמת SVZ מעכברים בני חודש עד 12 חודשים. יש לציין כי הממצאים שלנו חשפו ירידה משמעותית במספר הספירות הראשוניות עם העלייה בגיל, והראו יעילות מרבית בספירת הספירות בסביבות גיל חודשיים עד ארבעה חודשים (איור 2D). בנוסף, כדי להעריך את יכולת ההתחדשות העצמית של NSCs במהלך תת-תרבית, NSCs מעכברים בגילאי 2 עד 4 חודשים עברו תת-תרבית ונזרעו בצפיפות שיבוט (5 תאים/μL) בתווך מלא. כימות מספר הספירות המשניות לאורך הקטעים הבאים הצביע על ירידה ניכרת ביעילות התרבות לאורך המעברים (איור 2E). בהתבסס על כל התצפיות הללו, מומלץ לבצע בדיקות התחדשות עצמית במהלך מעברים מוקדמים כדי לייעל עוד יותר את תנאי התרבית במל"ל.
נוקלאופקציה היא טכניקה יעילה ביותר למניפולציה של ביטוי גנים בתאי גזע עצביים בוגרים
בהתחשב בכך NSCs אינם ניתנים להעברה בקלות, כדי לתפעל ביטוי גנים, כאן אנו מציגים פרוטוקול של נוקלאופקציה עם שיעור גבוה יותר של העברת גנים מוצלחת ללא צורך להשתמש בהתמרה ויראלית. לאחר נתיחה וגידול של SVZ בודדים מעכברים בני 2 עד 4 חודשים, NSCs קיבלו נוקלאופקט עם פלסמיד נושא GFP כמתואר (איור 3A). זיהוי תאים חיוביים ל-GFP יומיים לאחר הנוקלאופקציה גילה יעילות שנעה בין 30% ל-50%, בהתאם לספרות קודמת28. כדי לבודד באופן ספציפי NSCs שעברו בהצלחה גרעינית, התאים מוינו לפי FACS בהתבסס על עוצמת הפלואורסצנטיות של GFP 3 עד 5 ימים לאחר הנוקלאופקציה (איור 3A-C). כ-40% מהתאים שנותחו לפני FACS הציגו רמות פלואורסצנטיות גבוהות של GFP, ולאחר מכן נבחרו על-ידי מיון (איור 3C). זריעה מחדש של GFP+ NSCs ממוינים הראתה שכל התאים היו חיוביים ל-GFP, מה שאימת את שיטת בידוד התאים המבוססת על נוקלאופקציה (איור 3D). יש לציין כי NSCs גרעיניים שמרו על כדאיות באמצעות מעברים עוקבים, ואישרו היתכנות נוקלאופקטיבית עבור NSCs בוגרים. תוצאות אלה מדגישות את היעילות של שילוב נוקלאופקציה ו- FACS כדי לבסס תרבות טהורה של NSCs מותאמים.
כדוגמה למודולציה גנטית בתאי גזע מלשכה בוגרים, נעשה שימוש בהנחתת גנים באמצעות נוקלאופקציה של RNA קצר (sh). באופן ספציפי, shRNA המכוון לגן פוליפפטיד N (Snrpn) גרעיני קטן, הנושא כתב CAG-GFP (shSNRPN) היה nucleofected בתרביות NSC שמקורן בעכברים בני חודשיים. הפחתת רגולציה של Snrpn אושרה על-ידי qPCR ואימונוציטוכימיה בתאים עם פלסמיד shSNRPN, אך לא עבור פלסמיד shSCRAMBLE (איור 3E,F)29. כדי להבהיר את ההשפעות של הפחתת הרגולציה של Snrpn על יכולת ההתחדשות העצמית של NSC, בוצעה בדיקה בצפיפות נמוכה בתאים בעלי גרעין (איור 3F,G). כימות של נוירוספרות משניות בתרביות נוקלאופקטיות חשף יכולת היווצרות נוירוספרה מוגברת עם הפחתת הרגולציה של Snrpn (איור 3G). בדיקה זו מדגישה את יכולת הנוקלאופקציה לתמרן ביטוי גנים בתאי גזע גזעיים בוגרים, ובאופן ספציפי יותר, מזהה את התפקיד של Snrpn בשמירה על גזעיות בתאי גזע בתאי גזע של NSCs בוגרים.
איור 1: תיאור מפורט של דיסקציה SVZ. (A) לאחר הסרת מוח העכבר, המוח כולו מועבר עם DPBS לכרית סיליקון לצורך דיסקציה. (B) OB והמוח הקטן מוסרים מהמוח באמצעות אזמל. (C) המוח מחולק לשתי המיספרות כדי להמשיך בדיסקציה בנפרד. (D) המוח נפתח לאורך הקו של כפיס המוח, מפריד את קליפת המוח והסטריאטום מההיפוקמפוס, המחיצה והדיאנצפלון, ובכך חושף את החדרים הצדיים. (ה-ו) ההיפוקמפוס, המחיצה והדיאנצפלון מוסרים בעקבות הגבול הגחוני של החדרים. (ז-י) הרקמה שמעבר לקצוות הרוסטרליים והקאודליים של SVZ וקליפת המוח מוסרת בעקבות כפיס המוח. (י-ק) הרקמה מוטה כך שה-SVZ פונה הצידה, מה שמאפשר את הסרת הרקמה הסטריאטלית מתחת ל-SVZ. (L) מתקבלת פיסת רקמה דקה המכילה את SVZ. קווים מקווקווים שחורים מציינים את אתר החיתוך. קווים מנוקדים שחורים מציינים את מיקום קובץ SVZ בכל שלב. קיצורים: OB = נורת ריח; CB = המוח הקטן. סרגל קנה מידה ב- A-H: 5 מ"מ; ב- I-L: 3 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: גם המיטוגנים EGF וגם bFGF נחוצים לתרבית אופטימלית ולהרחבה של תאי גזע גזעיים גזעיים במבחנה. (A) תמונות מיקרוסקופ עם ניגודיות פאזה של תרביות נוירוספריות ראשוניות ומשניות בתווך NSC בתוספת EGF ו-bFGF או כל מיטוגן בנפרד. (B) מספר הכדורים הראשוניים המתקבלים לכל עכבר ולכל באר בהתבסס על הרכב המיטוגן של מדיום התרבית: ללא מיטוגנים (אפור, n=9), EGF+bFGF (כחול, n=33), רק EGF (ירוק, n=20), או bFGF בלבד (ורוד, n=19; פאנל שמאלי). מספר הנוירוספרות המשניות שנוצרו בצפיפות נמוכה (5 תאים/μL) לכל באר בהתבסס על ההרכב המיטוגני של תווך התרבית): ללא מיטוגנים (אפור, n=11), bFGF (ורוד, n=18), EGF (ירוק, n=18) או EGF+bFGF (כחול, n=37; פאנל ימני). נעשה שימוש במבחן קרוסקל-וואליס עם ניתוח פוסט-הוק של דאן. (C) עקומות גדילה המראות את המספר הכולל של תאים שנוצרו לאחר 8 מעברים בתרביות נוירוספריות נפרדות בהתאם למיטוגנים הקיימים בתווך התרבית: bFGF (ורוד, n=5), EGF (ירוק, n=5) או EGF+bFGF (כחול, n=10). נעשה שימוש בניתוח רגרסיה ליניארית. (D) מספר הנוירוספרות הראשוניות שמקורן בעכברים בודדים שנותחו ופורקו מבעלי חיים בשלבי התפתחות שונים לאחר הלידה. נעשה שימוש בניתוח רגרסיה ליניארית. n מצוין בסוגריים. (E) מספר הנוירוספרות המשניות שנוצרו בצפיפות נמוכה (5 תאים/μL) באמצעות מעברים הבאים במבחנה כדי להעריך את יכולת ההתחדשות העצמית שלהן. נעשה שימוש במבחן קרוסקל-ואליס, וערכי p נכללים: *: p<0.05; **: עמ<0.01; עמ<0.001.: עמ<0.0001.: נ.ס: לא משמעותי. קווי שגיאה מייצגים את SEM. סרגל קנה מידה ב- A הוא 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: סכמה של תהליך הנוקלאופקציה ובחירת תאים מבוססי FACS של תאים בעלי גרעין. (A) סקירה כללית של תהליך הנוקלאופקציה ובחירת תאים מבוססי FACS של תאים בעלי נוקלאופקט. 1) תמיסת DNA פלסמיד משולבת עם תמיסת הנוקלאופקציה ומתווספת לתאים. תערובת זו מועברת לאחר מכן לקובט עבור nucleofection. 2) הקובט המכיל DNA ותאים מוכנס לנוקלאופקטור, שם מופעל שוק חשמלי. עבור תרביות נוירוספריות שבודדו מה-SVZ הבוגר, אנו ממליצים להשתמש בתוכנית A-031 NSC. 3) לאחר נוקלאופקציה, התאים מועברים לבקבוק המכיל תווך שלם בתוספת EGF ו- bFGF. 4) התאים ממוינים על ידי FACS בהתבסס על ביטוי המדווח הכלול בדנ"א הפלסמיד. 5) תאים ממוינים עוברים תרבית נוספת לניסויים הבאים. (B) אסטרטגיית בחירה מבוססת FAC ו-gating עבור NSCs בעלי נוקלאופקט. ראשית, תאים חיים נבחרים בהתבסס על FSC-A גבוה ו- SSC-A גבוה (גרף שמאלי), ולאחר מכן מכפילי תאים ושלישיות מסולקים על ידי ניתוח פרמטרים FSC-A לעומת FSC-H (גרף ימני). (C) FACS gating עבור תאים בעלי נוקלאופקט בהתבסס על ביטוי ה-GFP שלהם (SSC-A לעומת FITC-A fluorescence). (D) מיקרוסקופ ניגודיות פאזה ותמונות פלואורסצנטיות GFP של NSCs בעלי נוקלאופקט לפני (n=3) ואחרי (n=4) בחירת FACS (פאנל שמאלי). אחוז תאי GFP+ בעלי נוקלאופקט מתואר לפני ואחרי בחירת FACS (פאנל ימני). נעשה שימוש במבחן T. (ה) ניתוח PCR כמותי (qPCR) של ביטוי Snrpn בריבוי NSCs עם shRNA ספציפי ל-Snrpn (n=4). נוקלאופקציה באמצעות ערבול shRNA שימשה כבקרה (n=4). נעשה שימוש במבחן T. (F) תמונות אימונוציטוכימיות המציגות SNRPN (באדום) בתאי גזע עצביים (NSC) 7 ימים לאחר נוקלאופקציית shRNA (לוחות חיצוניים). DAPI נוצל כדי להכתים DNA. תמונות מייצגות המתארות נוירוספרות שמקורן בתאי גזע עצביים בתנאי shSNRPN ו-shSCRAMBLE (לוחות אמצעיים). (G) כימות מספר הנוירוספרות שנוצרו בתרביות NSC לאחר נוקלאופקציה עם shSNRPN (n = 8) או shSCRAMBLE (n = 8). נעשה שימוש במבחן T. ערכי p כלולים: *: p<0.05; **: עמ<0.01; עמ<0.001.: עמ<0.0001.: נ.ס: לא משמעותי. קווי שגיאה מייצגים את ה- SEM. סרגל קנה מידה ב- D, 10 מיקרומטר; ב-F, 100 מיקרומטר (תמונות בהגדלה גבוהה ב-F, 7 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
בשל היעדר סמנים מוחלטים לזיהוי אוכלוסיית NSC in vivo, ניתוח NSCs התבסס בעיקר על התבוננות בהתנהגות של תאים שבודדו מנישות נוירוגניות בתנאי ex vivo . עבודתם החלוצית של ריינולדס וייס הניחה את היסודות על ידי קביעת תנאי תרבית מדויקים, המאפשרים בידוד והרחבה של תאים בודדים מרקמת SVZ עכברית צעירה (בת חודשיים) בתנאים שאינם דביקים. תאים אלה מופצים בדרך כלל בתווך נטול סרום המכיל EGF ו- bFGF, תנאים המונעים לחלוטין התמיינות לנוירונים ולגליה תוך קידום התפשטות. ואכן, בתנאי תרבית אלה9, רוב התאים מתים בימים הראשונים בתרבית, אך תת-קבוצה קטנה מתחילה להתחלק ויוצרת בעיקר נוירוספרות צפות9. דיסוציאציה אנזימטית ותת-תרבית של צברי תאים אלה מאפשרים התפשטות תרבית, ומדגימים את יכולת ההתחדשות העצמית של תרביות אלה.
יש לציין כי תרביות נוירוספריות מראות פוטנציאל התפשטות עם תוספת של EGF בלבד, בעוד שתאי גזע עצביים הגדלים בתווך המכיל bFGF בלבד אינם מראים התפשטות תאים לטווח ארוך30. שתי הראיות מצביעות על EGF כמיטוגן העיקרי להתחדשות עצמית של המל"ל. עם זאת, נוכחותם של EGF ו- bFGF במדיום התרבית משפרת את יכולת ההתחדשות העצמית של NSCs31, כמו גם תורמת לאיזון פוטנציאל ההתמיינות לאסטרוציטים, נוירונים ואוליגודנדרוציטים 32,33,34,35. יתר על כן, השימוש בתערובת מוגדרת של הורמונים וגורמים במקום חלופות מסחריות להשלמת המדיום מבטיח את האיכות הגבוהה ואת יכולת השחזור של תרביות המל"ל. בתנאים אלה, תרביות NSC של עכברים יכולות להמשיך כשורות תאים יציבות מבלי לעבור הנצחה. אף על פי כן, דאגה בתרביות נוירוספריות היא הפוטנציאל של אוכלוסיות תאים מתפשטות לעבור טרנספורמציות גנטיות, תוך עקיפת מנגנוני ויסות מחזור התא ולהוביל לפנוטיפ בן אלמוות. לכן, למרות שתרביות נוירוספריות ניתנות להרחבה רבה, תרביות מעבר ל-10 מעברי מבחנה מושלכות בדרך כלל למחקרים, מכיוון שהן עשויות לעבור הזדקנות משוכפלת, ותאים עם תוכן כרומוזומלי חריג או דינמיקת גדילה לא סדירה עשויים להופיע. יתר על כן, השימוש בתרבויות נוירוספריות מבוססות לטווח ארוך חייב להיות מנוטר ברציפות. תרבויות נוירוספריות מציעות גם הזדמנות לבחון את המאפיינים והפוטנציאל שלהן בסביבה מבוקרת, ומספקות סביבה מדויקת ומתכווננת יותר שניתן לווסת ולנטר בצורה מדויקת יותר מאשר in vivo. באמצעות ניתוח קלונוגני או אוכלוסייה במבחנה, ניתן לכמת את יכולות ההתחדשות העצמית וההתרבות של תאים אלה, מה שמקל על זיהוי המנגנונים הבסיסיים השולטים בתכונות אלה.
עם זאת, למרות רשימת היתרונות הגדולה של עבודה עם מל" לים במבחנה, אופיו של פרוטוקול טיפוח זה ועדינותו של המל"ל מהווים אתגר בתחום. לדוגמה, מספר הנוירוספרות הראשוניות הנוצרות במהלך דיסקציה טיפוסית יכול להשתנות באופן משמעותי בהתאם למיומנות ולדיוק של הנסיין. תוצאות הנוירוספרות הראשוניות ממחישות שונות זו במספר הנוירוספרות הראשוניות המתקבלות מה-SVZ של עכברים בני חודשיים, בטווח שבין 500 ל-3000 נוירוספרות. גורמים שונים עשויים לתרום לשונות זו. ראשית, דיוק הדיסקציה ממזער רקמות פרנכימליות לא רצויות, המעכבות היווצרות כדור ראשוני. שנית, יצירת חתיכות קטנות של רקמת SVZ מאפשרת עיכול אנזימטי יעיל וטריטורציה, ובכך מפחיתה את אובדן התאים. זה מדגיש את הצורך בתרגול מוקדם מספיק של פרוטוקול הדיסקציה ופיתוח מכוונן של עיבוד רקמות במהלך הקמת תרביות נוירוספרה.
מגבלה נוספת של תרביות אלה נעוצה בעובדה שנוירוספרות יכולות לכלול גם תאי גזע עצביים וגם תאי אב, מה שמקשה על ההבחנה בין שתי אוכלוסיות אלה בתוך תרבויות ראשוניות. בעוד שסמנים שונים כמו GFAP, Nestin, Musashi ו-SOX2 דווחו כמבוטאים על ידי NSCs8, אף אחד מהם לא היה קשור באופן בלעדי ל-NSCs. טכניקות FACS מתפתחות המבוססות על ביטוי אנטיגן בפני השטח של התא אפשרו בידוד של NSCs וצאצאיהם. מחקרים אלה הוכיחו כי אבות מגבירי מעבר אינם מסוגלים ליצור נוירוספרות במעבר25,36. לכן, בעוד שהקשר בין תאי SVZ לבין תאים יוזמי נוירוספירה דורש עידון נוסף 18,19,20,21,22,23, היכולת של נוירוספרות לעבור באופן סדרתי לאורך תקופה ממושכת עשויה לשקף את נוכחותם של תאי גזע עצביים בתרביות.
מערכת תרבית נוירוספרית זו שימשה מודל חזק לחקר ההשפעה של מסלולי איתות וביטוי גנים בשמירה על יכולת ההתחדשות העצמית של NSC במבחנה15,29. גישה אחת לחקור היבטים אלה כוללת הדבקה של NSCs כדי לבטא יתר על המידה או להפיל גנים ספציפיים. ניתן להשיג זאת באמצעות טכניקות שונות, כולל שיטות ויראליות ולא ויראליות. בעוד שווקטורים נגיפיים משיגים לעתים קרובות יעילות העברת גנים גבוהה, יש להם מגבלות חשובות, כגון דרישות הבטיחות הגבוהות וייצור וקטורים הגוזל זמןרב 26. לעומת זאת, שיטות טרנספקציה קלאסיות כמו ליפופקציה ואלקטרופורציה משיגות שיעורי טרנספקציה נמוכים מאוד, מה שהופך אותן לבלתי ישימות עבור תאים קשים להעברה. טכנולוגיית הנוקלאופקציה מציעה גישה ידידותית למשתמש על ידי שילוב פתרונות נוקלאופקציה ספציפיים לסוג התא עם פרמטרים חשמליים ייחודיים לכל סוג תא37,38. זה מבטיח העברת DNA ישירות לתוך גרעין התא39, ומאפשר את שילוב ה- DNA באופן בלתי תלוי במחזור התא. כתוצאה מכך, נוקלאופקציה מתגלה כטכניקה בת קיימא להעברת תאים קשים להעברה כגון NSCsעכבר 28,40.
מגבלה אחת של שיטה זו היא כי מינימום של 2 x 106 תאים מומלץ והכרחי עבור כל nucleofection, אם כי בתנאים אופטימליים, מספר נמוך יותר של תאים ניתן להשתמש לכל nucleofection יחיד (כלומר, 5 × 105 תאים). חסרון נוסף של השיטה הוא שהאיכות והריכוז של הדנ"א המשמש לנוקלאופקציה משפיעים באופן משמעותי על יעילות העברת הגנים. מומלץ מאוד להשתמש בדנ"א מוכן ללא אנדוטוקסין כדי למנוע תמותת תאים מוגברת כתוצאה מנוכחות אנדוטוקסין. בנוסף, שימוש ביותר מ-6 מיקרוגרם של דנ"א כולל לנוקלאופקציה יכול להפחית באופן משמעותי הן את יעילות העברת הגנים והן את יכולת הקיום של התא. לבסוף, מתן פולס חשמלי הוא גם קריטי להישרדותם של תאים נוקלאופקטים.
בעבודה זו, הדגמנו את המניפולציה של ביטוי הגן Snrpn על ידי שימוש באסטרטגיה הכרוכה בהפחתת הוויסות של ביטויו באמצעות פלסמידים אפיזומליים. פלסמידים אלה אינם משולבים בגנום של התאים, וככל שתאי גזע גזעיים ממשיכים להתרבות במבחנה, הדנ"א שהוחדר ידולל לאחר מכן לאורך חלוקת התא, ובכך יאבד את השפעת המניפולציה הגנטית. לכן, אסטרטגיה זו היא בעלת ערך כדי ללמוד את ההשפעה של שינוי חריף בתקופה קצרה או לתאי תאריך לידה במבחנה. קיימות חלופות מסוימות להערכת השפעה ממושכת יותר של הפרעה גנטית. לדוגמה, מערכת אינטגרטיבית כגון piggyBAC מבוסס טרנספוזון יכול לשמש. מערכת זו מורכבת מהחדרת רצף הקידוד הרצוי הכלול בפלסמיד המוקף ברצפים הניתנים לטרנספוזיה וקו-נוקלאופקט התאים עם פלסמיד המכיל את הרצף עבור האנזים טרנספוזאז41. לחלופין, ניתן להשתמש בטרנספוזונים או במערכות CRISPR/Cas.
פיתוח נוסף של טכנולוגיות הדבקה יהיה צעד חשוב לקראת מבחני תפוקה גבוהה כדי להעריך את תפקידם של גנים שונים על הפיזיולוגיה של תאי גזע עצביים בוגרים. בשילוב עם שיטות טיהור והרחבה מתוחכמות יותר ויותר, מחקרים אלה יאפשרו הבנה של הביולוגיה במבחנה של תאי גזע גזעיים בוגרים והשוואת ההבדלים הביולוגיים בין נוירוספרות צפות לבין NSCs in vivo.
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ- Ministerio de Ciencia e Innovación ו- Agencia Estatal de Investigación (MCIN/AEI) (PID2019-110045GB-I00; PID2022-142734OB-I00 ו- EUR2023-143479) ל- SRF. EJV (FPU20/00795) ו- DSL (FPU22/03797) ממומנים על ידי תוכנית המלגות הספרדית Formación de Profesorado Universitario (FPU). LLC (PRE2020-094137) ו- JDM (PREP2022-000680) ממומנים על ידי תוכנית המלגות הספרדית Formación de Personal Investigador (FPI). CMM (CIACIF/2022/366) ממומן על ידי Generalitat Valenciana. MIL (CPI-22-481) ממומן על ידי מלגת Programa INVESTIGO (הדור הבא של האיחוד האירופי). מימון בגישה פתוחה מסופק על ידי Ministerio de Ciencia e Innovación.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22 μm pore-filter bottles (250 mL) | VWR | 514-0330P | |
0.22 μm pore-filter bottles (500 mL) | VWR | 514-0332P | |
12-well plate | LabClinics | PLC30012 | |
15 mL tube | Fisher | 10738771 | |
24-well plate | LabClinics | PLC30024 | |
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | BioWest | L0180-100 | |
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
48-well plate | ThermoFisher | 150687 | |
6-well plate | LabClinics | PLC30006 | |
96-well plate | Labclinics | PLC30096 | |
Accutase solution | Sigma | A6964-100ML | Referred as enzymatic solution |
Amaxa Mouse Neural Stem Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPG-1004 | |
Amaxa Nucleofector Iib | Lonza | 10700807 | |
Antibiotic/Antimitotic (A/A) | Sigma | A5955 | |
Apo-t-Transferrine | Sigma | T2252-1G | |
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Sigma | F0291 | |
Blasticidin | Sigma | 203350 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B4287-25MG | |
Cell strainer 40 μm | LabClinics | PLC93040 | |
Deoxynucleotide triphosphate (dNTPs) | NZYTech | MB08701 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
Dulbecco’s Phosphate Saline Buffer (DPBS) | Gibco | 14080-055 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) F12 1:1 | Gibco | 11320-074 | |
E. coli DH5α Competent Cells | ThermoFisher | EC0112 | |
Earles's Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco | 24010-043 | |
Epidermal Growth Factor - Human recombinant (EGF) | Gibco | 53003-018 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E-6511 | |
Fine Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
Fine Scissors Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Glucose | Sigma | G-7021 | |
GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7805 | Kit includes reagents for PCR |
Heparin | Sigma | H-3149 | |
Insuline | Sigma | I6634 | |
LB agar (Lennox) | LabKem | AGLB-00P-500 | |
LB broth (Lennox) | LabKem | LBBR-00P-500 | |
L-Cysteine | Sigma | C-8277 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030-024 | |
Neubauer chamber | Blaubrand | BR718620 | |
Nuclease free water | Labbox | WATR-00A-10K | |
NZYMaxiprep Endotoxin Free Kit | NZYTech | MB39901 | |
Papain Lyophilized | Worthington | LS003119 | |
Progesterone | Sigma | P-6149 | |
Putrescine | Sigma | P-7505 | |
Scalpel | Fine Science Tools | 10316-14 | |
shSCRAMBLE | Mission (Sigma) | SHC003 | |
shSNRPN | Mission (Sigma) | TRCN0000109285 | |
Sodium Selenite | Sigma | S-9133 | |
Spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
Sterile PES Syringe Filters (0.22 μm pore-filter) | Epica | SFPE-22E-050 | |
T12.5 cm2 Flask | Biofil | TCF012025 | |
T25 cm2 Flask | LabClinics | PLC70025 | |
T75 cm2 Flask | LabClinics | PLC70075 | |
Tweezers | Fine Science Tools | 91150-20 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved