JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כתב יד זה מציג פרוטוקול להכנה היסטולוגית של שקופיות מגלגלי עיניים של מכרסמים. בשיטה המוצעת, ניתן לדמיין בקלות את הרשתית הפנימית ולהעריך אותה תחת מיקרוסקופ אור. ההליך מוצג עבור גלגלי העיניים של עכברים וחולדות.

Abstract

גלגל עין מכרסם הוא כלי רב עוצמה לחקר הפתומנגנונים של מחלות עיניים רבות, כגון גלאוקומה, רטינופתיה יתר לחץ דם, ועוד רבים. ניסויים פרה-קליניים מאפשרים לחוקרים לבחון את יעילותן של תרופות חדשות, לפתח שיטות טיפול חדשות או לחפש פתומנגנונים חדשים המעורבים בהתפרצות המחלה או בהתקדמותה. בדיקה היסטולוגית מספקת מידע רב הדרוש כדי להעריך את ההשפעות של הניסויים שנערכו ויכולה לחשוף ניוון, שיפוץ רקמות, חדירה ופתולוגיות רבות אחרות. במחקר קליני, אין כמעט סיכוי לקבל רקמת עין המתאימה לבדיקה היסטולוגית, ולכן החוקרים צריכים לנצל את ההזדמנות שמציעה בדיקת גלגלי עיניים ממכרסמים. כתב יד זה מציג פרוטוקול להכנה היסטולוגית של קטעי גלגלי עיניים של מכרסמים. ההליך מוצג עבור גלגלי עיניים של עכברים וחולדות ויש לו את השלבים הבאים: (i) קצירת גלגל העין, (ii) שימור גלגל העין לניתוח נוסף, (iii) עיבוד הרקמה בפרפין, (iv) הכנת שקופיות, (v) צביעה עם hematoxylin ו eosin, (vi) הערכת הרקמה תחת מיקרוסקופ אור. עם השיטה המוצעת, הרשתית ניתן לדמיין בקלות ולהעריך בפירוט.

Introduction

גלגל העין הוא מבנה דמוי גלובוס המהווה את איבר הראייה. ניתן לחלק את החלק הפנימי של גלגל העין לשני מקטעים: החלק הקדמי, הכולל את הקרנית, הקשתית, הגוף הריסי, העדשה, החדר הקדמי והחדר האחורי, והמקטע האחורי, הכולל את גוף הזגוגית, הרשתית, כורואיד, סקלרה, ראש עצב הראייה. החדר הקדמי ממוקם בין הקרנית לבין הקשתית 1,2. הקשתית היא מבנה מעגלי עם פתח במרכז שנקרא אישון. בצומת הקרנית והקשתית, יש את זווית הניקוז, שם מערכת מיוחדת של trabeculae מנקזת את ההומור המימי מגלגל העין למערכת הוורידית. החדר האחורי קשור בקשתית, בגוף הריסי ובעדשה, כמו גם ברצועות המתח המחזיקות את העדשה במקומה. מאחורי העדשה נמצא גוף הזגוגית, שהוא המבנה הגדול ביותר של גלגל העין. גוף הזגוגית נצמד לרשתית ומייצב את מיקומה. הרשתית מוקפת בכורואיד ובסקלרה1. האנטומיה של גלגל העין מסוכמת באיור 1.

דופן גלגל העין מהווה שלוש שכבות. השכבה החיצונית ביותר היא הסקלרה, המגנה על גלגל העין מפני פציעה ושומרת על צורתו. בקוטב הקדמי של גלגל העין, לובן העין הופך לקרנית שקופה. מתחת לסקלרה, קיים מבנה כלי דם הנקרא uvea, שתפקידו העיקרי הוא להזין את מבני העין. האובה יוצרת את הכורויד, ובתוך הקוטב הקדמי, הגוף הריסי והקשתית1. השכבה הפנימית ביותר היא הרשתית, שהיא מבנה מיוחד מאוד של העין, המורכב מנוירונים, תאי גלייה ותאי אפיתל פיגמנטיים. תאי העצב ברשתית כוללים את תאי קולטני האור (מוטות ומדוכים), תאים אופקיים, תאים דו-קוטביים, תאים אמקריניים ותאי גנגליון רשתית (RGCs). תאים אלה מאורגנים בשכבות מורכבות, ותפקידם לקבל ולעבד גירויי אור 2,3. תאי הגליה של הרשתית מרכיבים את תאי מילר, אסטרוציטים ומיקרוגליה, הנמצאים בכל שכבות הרשתית. התפקודים הרבים של תאי גליה כוללים תזונה של נוירונים, תמיכה במחסום הדם-רשתית, תמיכה מבנית של תאי עצב לשמירה על המבנה השכבתי של הרשתית, ויסות חילוף החומרים של נוירונים, הפרשת חלבונים פעילים ביולוגית המווסתים תפקוד, גדילה והישרדות של נוירונים, וויסות התהליכים האימונולוגיים בתוך הרשתית4. תאי אפיתל פיגמנט מהווים את השכבה החיצונית ביותר של הרשתית ופועלים כמחסום בין הכורואיד לבין הפוטורצפטורים. תאים אלה מווסתים את ההובלה הדו-כיוונית של מוצרי פסולת וחומרי מזון וגם מגנים על הרשתית מפני נזק מוגזם הנגרם על ידי אור על ידי ספיגת אנרגיית אור ונטרול מיני חמצן תגובתי שנוצר מאור5.

ניתן לחלק את הרשתית לעשר שכבות: (i) אפיתל פיגמנט הרשתית, (ii) שכבת מקטע קולטני האור (מוטות ומדוכים), (iii) קרום מגביל חיצוני (ELM), (iv) שכבה גרעינית חיצונית (ONL), (v) שכבת פרספקס חיצונית (OPL), (vi) שכבה גרעינית פנימית (INL), (vii) שכבת פרספקס פנימית (IPL), (viii) שכבת תאי גנגליון (GCL), (ix) שכבת סיבי עצב רשתית (RNFL), ו-(x) קרום מגביל פנימי (ILM)2. שכבות הגרעין של הרשתית כוללות את ONL, INL ו-GCL, בעוד שהשכבות עם קשרים סינפטיים בין תאים כוללות את OPL ו-IPL6. גרעיני המוטות והמדוכים יוצרים את ה-ONL, והאקסונים שלהם מתרחבים לתוך ה-OPL, שם הם מתחברים לדנדריטים של תאים דו-קוטביים ואופקיים. בתוך ה-INL נמצאים גרעיני התאים האופקיים, הדו-קוטביים והאמקריניים. בתוך IPL, טרמינלים אקסונים של תאים דו קוטביים ו amacrine סינפסה עם דנדריטים של RGCs. בתוך GCL, RGCs מהווים את רוב גופי התא, אבל גם כמה תאים amacrine נקע ניתן למצוא שם. האקסונים של RGCs יוצרים את RNFL, ועוד - עצב הראייה 7,8,9.

מחלות עיניים רבות, כגון הפרעות נוירודגנרטיביות ברשתית, מובילות לעיוורון בלתי הפיך וחשוך מרפא10. ראייה נחשבת לאחד החושים החשובים ביותר11, ועיוורון קבוע מפחית משמעותית את איכות החיים של המטופל. כדי לקדם את ההבנה של מנגנוני הפתו-מנגנונים של מחלות רבות, מחקר פרה-קליני באמצעות תרביות תאים או מודלים של בעלי חיים מתבצע באופן נרחב. מחקרים פרה-קליניים המשתמשים בחיות ניסוי מספקים הזדמנות להעריך את הפתומנגנונים העומדים בבסיס מחלות עיניים ולפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות. מחלות עיניים יכולות להיות מודלות הן בבעלי חיים גדולים (קופים, פרות, כלבים וחתולים) והן בחיות קטנות (ארנבות, חולדות, עכברים ודגי זברה). השימוש בבעלי חיים גדולים יותר מאפשר גישה טובה יותר לעין בשל גודלה. ניסויים המבוצעים עם מכרסמים, לעומת זאת, בשל הרבייה המהירה יחסית שלהם, מאפשרים רבייה של זנים גזעיים המאופיינים ברגישות למחלות מסוימות12,13.

במודלים של בעלי חיים מתאפשרת אינקולציה, המאפשרת ביצוע בדיקה היסטופתולוגית מפורטת של גלגל העין, תוך הערכת פתולוגיות קלות המופיעות במבנים מסוימים של העין במהלך התפתחות המחלה - בדיקה שניתן לבצע לעיתים רחוקות מאוד בקרב בני אדם. הערכה היסטופתולוגית היא כלי בעל ערך רב בעת חקר הפתומנגנונים של הפרעות עיניות. בספרות שפורסמה, תיאורי המתודולוגיה לבדיקה היסטולוגית של גלגלי העיניים מוגבלים מאוד, ומדריכים שלב אחר שלב חסרים, מה שמקשה על מתחילים לשחזר. מחקר זה נועד לספק שיטה פשוטה ותמציתית להכנת שקופיות היסטולוגיות והערכת הרשתית של חולדה ועכבר.

Protocol

המחקר בוצע בהתאם להנחיות המוסדיים. גלגלי העיניים ששימשו במחקר זה התקבלו מבעלי חיים שנכללו בניסוי שנערך על בסיס אישור המחקר מספר WAW2/122/2020 שהונפק על ידי ועדת האתיקההמקומית השנייה באוניברסיטת ורשה למדעי החיים בוורשה, פולין. הפרוטוקול שלנו פותח על ידי בדיקת עכברים בגילאי 11 ו-44 שבועות וחולדות בגילאי 6, 12 ו-16 שבועות.

1. הכנת גלגלי עיניים של עכבר

הערה: פרוטוקול זה מציג את השיטה להכנת מקטעים של גלגלי עיניים של עכברים ופותח באמצעות גלגלי עיניים שנקטפו מ: נקבות עכברי C57Bl/6 בנות 11 שבועות (משקל ממוצע 21 גרם), נקבות עכברי C57Bl/6 בנות 44 שבועות (משקל ממוצע 25 גרם), נקבות DBA/2 עכברים בנות 11 שבועות (משקל ממוצע 21.5 גרם), ונקבות DBA/2 עכברים בגילאי 44 שבועות עם גלאוקומה (משקל ממוצע 25 גרם).

  1. חינוך
    1. השתמש במלקחיים קטנים כדי לפתוח את העפעפיים. לחץ על העפעפיים כדי שגלגל העין יצנח.
    2. נתחו את גלגל העין מהשקע על ידי חיתוך הרקמה שמאחורי גלגל העין בעזרת מספריים קטנים וחדים. לאחר הסרת גלגל העין מהמסלול, חתכו את רקמת החיבור הבולטת ואת השרירים הפריוקולריים.
      1. סמן את גלגלי העיניים להתמצאות טובה יותר, למשל, על ידי קשירת תפר קטן על גדם הגיד של שריר הרקטוס הלטרלי של גלגל העין כדי לסמן את הצד הטמפורלי של גלגל העין.
  2. קיבוע רקמות
    1. הניחו את גלגל העין המושמע בצינורות מיקרוצנטריפוגות בנפח 1.5 מ"ל והניחו לו לנוח בתמיסה של 4% של פרפורמלדהיד (PFA) המומס במי מלח חיץ פוספט (PBS) למשך 24 שעות.
    2. לאחר מכן, לטפל גלגל העין במשך 24 שעות בתמיסה 10% של סוכרוז, ולאחר מכן להסיר ולהניח אותו במשך 24 שעות בתמיסה 20% של סוכרוז, ולבסוף, להסיר ומניחים במשך 24 שעות בתמיסה 30% של סוכרוז.
      הערה: לאורך כל התהליך, שמור על גלגל העין בטמפרטורה נמוכה של 4 ° C. יש להימנע מנקבי מחטים לחדירת סוכרוז כדי למזער את הסיכון לנזק לגלגל העין.
  3. הקפאת רקמות ואחסונן
    1. הסר את גלגל העין מתמיסת הסוכרוז וייבש אותו על ידי טבילה קלה במגבת נייר.
    2. מניחים את גלגל העין בצינור מיקרוצנטריפוגה נקי של 1.5 מ"ל ומקפיאים ב - 80 מעלות צלזיוס לעיבוד עתידי.
      הערה: אם הוא מאוחסן ב- 80°C, גלגל העין יכול להישאר בר קיימא עד 12 חודשים עד לעיבוד עתידי.
  4. הכנת שקופיות
    1. הפשירו את גלגל העין בטמפרטורת החדר. העבירו אותו מצינור המיקרוצנטריפוגה לקסטה ושטפו תחת מים זורמים במשך 20 דקות כדי לשטוף את הסוכרוז.
    2. יש לייבש את גלגל העין על ידי הכנסתו לתוכו, ולאחר מכן הוצאתו מהתמיסות הבאות תחת מכסה אדים: 70% תמיסה של אלכוהול אתילי (EtOH) למשך 10 דקות, 80% תמיסה של EtOH למשך 10 דקות, 96% תמיסה של EtOH למשך 10 דקות, 99.9% תמיסה של EtOH למשך 10 דקות ואצטון למשך 5 דקות.
    3. נקה את גלגל העין על ידי הנחתו בקסילן למשך 5 דקות מתחת למכסה אדים.
    4. ממיסים את הפרפין על ידי הכנסת פרפין מוצק לתוך והכנסתו לאינקובטור מעבדה המוגדר לטמפרטורה גבוהה מטמפרטורת ההתכה שצוינה על ידי יצרן הפרפין (טמפרטורת ההתכה של פרפין היא בין 46 ° C ל 68 ° C). לאחר הפרפין נמס לחלוטין (הזמן תלוי בכמות הפרפין המשומש), להעביר את גלגל העין לתוך הכד עם פרפין ולשמור חם באינקובטור במשך 1 שעות. במהלך 1 שעה של חדירת פרפין לתוך הרקמה, מערבבים את הפרפין כל 10 - 15 דקות.
      הערה: בשלב זה ניתן להשתמש במעבד רקמות המאפשר חדירת פרפין תוך כדי ערבוב התמיסה בשלב זה.
    5. הטמע את גלגל העין בבלוק פרפין כמתואר להלן.
      1. פתח את הקלטת והסר את הכיסוי העליון. בחרו תבנית מתכת ושפכו כמות קטנה של פרפין כדי לכסות את תחתית התבנית. מוציאים את גלגל העין מהקלטת בעזרת מלקחיים ומניחים אותו על הפרפין בתבנית. הניחו את גלגל העין על צידו כדי להבטיח חיתוך במישור הקשת.
        הערה: הנחת גלגל העין על צידו (עם הקוטב הקדמי לצד אחד והקוטב האחורי לצד השני) תאפשר חיתוך במישור הקשת. בדרך זו יתקבלו חתכים דרך הקרנית, הקשתית, הגוף הרירי, האישון, הפריפריה והרשתית המרכזית.
      2. מצננים בקצרה את התבנית על צלחת קירור המוגדרת ל - 15 מעלות צלזיוס כדי שהפרפין יתמצק מעט כדי לעגן את הרקמה למקומה. בזהירות לכסות את הרקמה עם פרפין ואת תחתית קלטת כדי ליצור בלוק. הניחו את הבלוק על צלחת קירור כדי להתמצק באופן מלא. לאחר מכן, הסירו את הבלוק מתבנית המתכת והחזירו את קוביות הפרפין לצלחת הקירור למשך 15 דקות לפחות כדי להתקרר לפני החיתוך.
    6. אבטחו בלוק פרפין במיקרוטום. הגדר את microtome כדי לחתוך את הפרפין עודף מן הבלוק (אנחנו להגדיר אותו לחתוך 15 מיקרומטר) ולחתוך עד למרכז גלגל העין. שנו את הגדרות המיקרוטום כדי לחתוך מקטעים דקים יותר (הגדרנו אותו לחתוך 3.5 מיקרומטר) והניחו את המקטע על שקופית. אם אתם משתמשים במיקרוטומה עם אמבט מים צמוד, הסירו את עודפי המים מהמגלשה בעזרת רקמה לחה.
      הערה: המטרה היא להשיג לפחות 3 חתכים דרך האישון. ככל שהחוקר פחות מנוסה, כך יש להשיג יותר קטעים כדי להבטיח חלוקה ברמת התלמיד. מקם כמה מקטעים בשקופית אחת. כמו כן, עבור חוקרים פחות מנוסים, לחתוך את הרקמה עבה יותר, למשל, למקטעים 4 מיקרומטר או 5 מיקרומטר עובי. השימוש במיקרוטום עם אמבט מים צמוד הופך את תהליך העברת חלקי הרקמה למגלשות להרבה יותר קל בהשוואה לשימוש במיקרוטומים ללא אמבטיות מים. נקודה נוספת שראוי לציין היא כי העדשה עשויה להיות קשה לחתוך דרך. כדי למזער את הסיכון לנזק לרקמות על ידי העדשה הפריכה, השתמשו רק בלהבי מיקרוטום חדים המיועדים לחתוך רקמות קשות. שקול להשתמש בלהב אחד לחיתוך ואחר לחיתוך חלקים כדי למזער את הקהות הלהב.
    7. הכניסו את המגלשה לחממת מעבדה לטמפרטורה של 56°C למשך 30 דקות.
    8. הסר את השקופית מהאינקובטור והתחל להכתים אותה עם המטוקסילין ואאוזין (H&E) באופן ידני על ידי הצבה והסרה ברצף של השקופית אל ומהתמיסות הבאות. התחילו עם 7 דקות קסילן, 5 דקות קסילן (עוד עם תמיסה נקייה), ו-5 דקות קסילן (עוד עם תמיסה נקייה). לאחר מכן עם 2 דקות 96% EtOH, 1 דקות 96% EtOH (עוד עם תמיסה נקייה), 1 דקות 96% EtOH (עוד עם תמיסה נקייה).
    9. לשטוף 5 דקות מים זורמים, ואז 2 דקות hematoxylin של מאייר, 2 דקות hematoxylin של Mayer (עוד עם פתרון נקי), 5 דקות מים זורמים, 5 דקות מים זורמים (אחר, נקי).
    10. הוסף 1% אאוסין למשך 2 דקות, ואחריו 1 דקות 96% EtOH, 30 s 96% EtOH (עוד עם תמיסה נקייה), 30 s 96% EtOH (עוד עם תמיסה נקייה), 2 דקות קסילן, 1 דקות קסילן (עוד עם תמיסה נקייה), 2 דקות קסילן (עוד עם תמיסה נקייה).
      הערה: לחלופין, השתמש במכתים אוטומטי של שקופיות.
    11. אטם את המגלשה באמצעות אוטם שקופיות אוטומטי. השקופית מוכנה לאחסון והערכה תחת מיקרוסקופ אור.
      הערה: לחלופין, בצע איטום שקופיות באופן ידני על ידי הנחת שכבה דקה של תושבת פוליסטירן על הרקמה המוכתמת וכיסויה בכיסוי זכוכית.
      אזהרה: צעדים הכוללים PFA, EtOH, אצטון וקסילן צריכים להתבצע תחת מכסה אדים במעבדה.

2. הכנת קטע גלגלי עיניים של חולדות והרכבה של שקופיות

הערה: פרוטוקול זה מציג את שיטת הכנת המקטעים של גלגלי העיניים של חולדות ופותח באמצעות גלגלי העיניים שנקטפו מ: חולדות SHR זכרים בני 6 שבועות (משקל ממוצע 115.5 גרם), חולדות SHR זכרים בני 12 שבועות עם יתר לחץ דם עורקי (משקל ממוצע 262.5 גרם), חולדות WKY זכרים בני 6 שבועות (משקל ממוצע 143.5 גרם), חולדות WKY זכרים בני 12 שבועות (משקל ממוצע 265 גרם), חולדות לואיס זכרים בני 12 שבועות (משקל ממוצע 310 גרם), וחולדות לואיס זכרים בני 16 שבועות עם סוכרת מושרית (משקל ממוצע 259 גרם).

  1. חינוך
    1. השתמש במלקחיים קטנים כדי לפתוח את העפעפיים. לחץ על העפעפיים כדי לצנוח את גלגל העין.
    2. נתחו את גלגל העין מהשקע על ידי חיתוך הרקמה שמאחורי גלגל העין בעזרת מספריים קטנים וחדים.
      הערה: סמן את גלגלי העיניים להתמצאות טובה יותר, לדוגמה, על ידי קשירת תפר קטן על גדם הגיד של שריר הרקטוס הלטרלי של גלגל העין כדי לסמן את הצד הרקתי של גלגל העין.
  2. קיבוע רקמות
    1. הניחו את גלגל העין בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל והניחו לו לנוח בתמיסה של 4% של פרפורמלדהיד (PFA) המומס במי מלח חיץ פוספט (PBS) למשך 24 שעות.
    2. לאחר מכן, לטפל גלגל העין במשך 24 שעות בתמיסה 10% של סוכרוז, ולאחר מכן להסיר ומניחים אותו במשך 24 שעות בתמיסה 20% של סוכרוז, ולבסוף להסיר ולהניח אותו במשך 24 שעות בתמיסה 30% של סוכרוז.
      הערה: לאורך כל התהליך, שמור על גלגל העין בטמפרטורה נמוכה של 4 ° C. יש להימנע מנקבי מחטים לחדירת סוכרוז כדי למזער את הסיכון לנזק לגלגל העין.
  3. הקפאת רקמות ואחסונן
    1. הסר את גלגל העין מתמיסת הסוכרוז וייבש אותו על ידי טבילה קלה במגבת נייר.
    2. הניחו את גלגל העין בצינור מיקרוצנטריפוגה נקי של 1.5 מ"ל והקפיאו בטמפרטורה של -80°C לעיבוד עתידי.
      הערה: אם הוא מאוחסן בטמפרטורה של -80°C, גלגל העין יכול להישאר בר קיימא עד 12 חודשים עד לעיבוד עתידי.
  4. הכנת שקופיות
    1. מוציאים את גלגל העין מהמקפיא ומצינור המיקרוצנטריפוגה. חותכים את גלגל העין לשניים לאורך מישור הקשת בעזרת אזמל חד. הסר והשלך את העדשה.
      הערה: שלב זה הוא הקל ביותר לביצוע על גלגל עין קפוא, שנלקח טרי מהמקפיא. במהלך חיתוך גלגל העין, העדשה עלולה לפגוע ברקמה שמסביב. כדי למזער את הסיכון לנזק, השתמש באזמל חד מאוד והישאר זהיר.
    2. הפשירו את גלגל העין בטמפרטורת החדר. מעבירים את שני החצאים לקסטה ושוטפים תחת מים זורמים במשך 20 דקות כדי לשטוף את הסוכרוז.
    3. יש לייבש את גלגל העין על ידי הכנסתו לתמיסות הבאות ולאחר מכן הוצאתו מתחת למכסה אדים: 70% תמיסה של אתיל אלכוהול (EtOH) למשך 15 דקות, 80% תמיסה של EtOH למשך 15 דקות, 96% תמיסה של EtOH למשך 15 דקות, 99.9% תמיסה של EtOH למשך 15 דקות ואצטון למשך 7 דקות.
    4. נקה את גלגל העין על ידי הנחתו בקסילן למשך 7 דקות מתחת למכסה אדים.
    5. ממיסים את הפרפין על ידי הכנסת פרפין מוצק לתוך והכנסתו לאינקובטור מעבדה המוגדר לטמפרטורה גבוהה מטמפרטורת ההתכה שצוינה על ידי יצרן הפרפין (טמפרטורת ההתכה של פרפין היא בין 46 ° C ל 68 ° C). לאחר הפרפין נמס לחלוטין (הזמן תלוי בכמות הפרפין המשמש), להעביר את גלגל העין לתוך הכד עם פרפין ולשמור חם באינקובטור במשך 1 שעות. במהלך 1 שעה של חדירת פרפין לתוך הרקמה, מערבבים את הפרפין כל 10 - 15 דקות.
      הערה: בשלב זה ניתן להשתמש במעבד רקמות המאפשר חדירת פרפין תוך כדי ערבוב התמיסה בשלב זה.
    6. הטמע את גלגל העין בבלוק פרפין כמתואר להלן.
      1. פתח את הקלטת והסר את הכיסוי העליון. בחרו תבנית מתכת ושפכו כמות קטנה של פרפין כדי לכסות את תחתית התבנית. מוציאים את גלגל העין מהקלטת בעזרת מלקחיים ומניחים אותו על הפרפין בתבנית. מניחים חצי גלגל עין אחד עם החלק התחתון של הכוס למעלה, ואת השני - למטה.
        הערה: הנחת חצאי גלגל העין כאשר חצי אחד עם החלק התחתון של הכוס למעלה, והשני - למטה יאפשר חיתוך רקמות במישור הקשת. בדרך זו יתקבלו חתכים דרך הקרנית, הקשתית, הגוף הרירי, האישון, הפריפריה והרשתית המרכזית.
      2. מצננים בקצרה את התבנית על צלחת קירור מוגדרת ל - 15 מעלות צלזיוס כדי שהפרפין יתמצק מעט ויעגן את גלגל העין למקומו. בזהירות לכסות את גלגל העין עם פרפין ואת תחתית קלטת כדי ליצור בלוק. הניחו את הבלוק על צלחת קירור כדי להתמצק באופן מלא. לאחר מכן, הסירו את הבלוק מתבנית המתכת והחזירו את קוביות הפרפין לצלחת הקירור למשך 15 דקות לפחות כדי להתקרר לפני החיתוך.
    7. אבטחו בלוק פרפין במיקרוטום. הגדר את microtome כדי לחתוך את הפרפין עודף מן הבלוק (אנחנו להגדיר אותו לחתוך 15 מיקרומטר) ולחתוך עד שאתה מגיע למרכז גלגל העין. שנו את הגדרות המיקרוטום כדי לחתוך מקטעים דקים יותר (הגדרנו אותו לחתוך 3.5 מיקרומטר) והניחו את המקטע על שקופית. אם אתה משתמש במיקרוטום עם אמבט מים סמוך, הסר את עודפי המים מהמגלשה עם רקמה לחה.
      הערה: המטרה היא להשיג לפחות 3 חתכים דרך האישון. ככל שהחוקר פחות מנוסה, כך יש להשיג יותר קטעים כדי להבטיח חלוקה ברמת התלמיד. מקם כמה מקטעים בשקופית אחת. כמו כן, עבור חוקרים פחות מנוסים, לחתוך את הרקמה עבה יותר, למשל, למקטעים 4 מיקרומטר או 5 מיקרומטר עובי. השימוש במיקרוטום עם אמבט מים צמוד הופך את תהליך העברת חלקי הרקמה למגלשות להרבה יותר קל בהשוואה לשימוש במיקרוטומים ללא אמבטיות מים.
    8. הסר את השקופית והתחל להכתים עם המטוקסילין ואאוזין (H&E) באופן ידני על-ידי הצבה והסרה ברצף של השקופית אל הפתרונות הבאים ומהם. התחילו עם 7 דקות קסילן, 5 דקות קסילן (עוד עם תמיסה נקייה), ו-5 דקות קסילן (עוד עם תמיסה נקייה). לאחר מכן עם 2 דקות 96% EtOH, 1 דקות 96% EtOH (עוד עם תמיסה נקייה), 1 דקות 96% EtOH (עוד עם תמיסה נקייה).
    9. לשטוף 5 דקות מים זורמים, ואז 2 דקות hematoxylin של מאייר, 2 דקות hematoxylin של Mayer (עוד עם פתרון נקי), 5 דקות מים זורמים, 5 דקות מים זורמים (אחר, נקי).
    10. הוסף 1% אאוסין למשך 2 דקות, ואחריו 1 דקות 96% EtOH, 30 s 96% EtOH (עוד עם תמיסה נקייה), 30 s 96% EtOH (עוד עם תמיסה נקייה), 2 דקות קסילן, 1 דקות קסילן (עוד עם תמיסה נקייה), 2 דקות קסילן (עוד עם תמיסה נקייה).
      הערה: לחלופין, השתמש במכתים אוטומטי של שקופיות.
    11. אטם את המגלשה באמצעות אוטם שקופיות אוטומטי. השקופיות שהוכנו מוכנות לאחסון והערכה תחת מיקרוסקופ אור.
      הערה: לחלופין, בצע איטום שקופיות באופן ידני, על ידי הנחת שכבה דקה של תושבת פוליסטירן על הרקמה המוכתמת וכיסוי על ידי כיסוי זכוכית.
      אזהרה: צעדים הכוללים PFA, EtOH, אצטון וקסילן צריכים להתבצע תחת מכסה אדים במעבדה.

3. הערכת קטעי גלגל העין

  1. סריקת שקופיות
    1. הכנס את השקופית לסורק שקופיות היסטופתולוגי וסרוק את המקטעים באמצעות מצב הסריקה: 40x. שמור את התמונות כקבצים דיגיטליים ברזולוציה גבוהה.
  2. ניתוח שקופיות
    1. פתח את הקובץ הסרוק באמצעות תוכנת הצגת תמונות. מצא חתכי אישונים ונתח שלושה חתכים עוקבים.
    2. מצא את החלק העבה ביותר של הרשתית והגדל את התמונה ל- 20x על ידי לחיצה על תיבת ההגדלה בפינה השמאלית העליונה ובחירת 20x. הזז את העכבר לרמה של ELM בחלק העבה ביותר של הרשתית ולחץ על הלחצן הימני בעכבר, בחר הוסף הערות וסרגל.
    3. הזז את העכבר לכיוון ILM ולחץ על הלחצן הימני. תן כותרת למדידת RT וסמן את התיבות הצג כותרת והצג אורך. בדרך זו יימדד עובי הרשתית (RT), והמדידה תוצג במיקרומטר. תוצאות מייצגות מוצגות באיור 2 ובאיור 3.
    4. השתמש בסרגל, מדוד את העובי של כל שכבת רשתית, כולל ONL, OPL, INL ו- IPL, ותייג אותם. תוצאות מייצגות מוצגות באיור 4 ובאיור 5.
    5. כדי לספור את מספר התאים בתוך GCL, לקבוע אורך קבוע מראש של הרשתית. לדוגמה, עבור רשתית העכבר, השתמש בקטע אחד של 500 מיקרומטר, ועבור רשתית החולדה, השתמש בחמישה חתכים של 100 מיקרומטר.
    6. בעזרת הסרגל, מדדו את המרחק שנבחר לאורך ה-GCL. לחץ על הלחצן הימני בעכבר ובחר הוסף הערות > נשמר > RBC אחד. לחץ על כל תא המזוהה כגוף עגול ומוכתם בהמטוקסילין לאורך ה- GCL לאורך הרשתית שנקבע מראש. ספירת מספר התאים המוקפים. תוצאות מייצגות מוצגות באיור 6 ובאיור 7.
    7. לאחר ניתוח שלושה מקטעים עוקבים, ציירו את הממוצע עבור כל המדידות.

תוצאות

עם השימוש בפרוטוקול המוצג, ניתן להעריך בפירוט את האנטומיה והמורפולוגיה של מבנים ספציפיים של גלגל העין. הצוות שלנו מתמקד בחקר הפתומנגנונים של ניוון עצבי בהפרעות רשתית, כגון גלאוקומה, רטינופתיה סוכרתית ורטינופתיה יתר לחץ דם. כדי להעריך את המאפיינים של ניוון עצבי ברשתית, ה...

Discussion

בדיקה היסטולוגית של גלגל העין של העכבר והחולדה היא כלי רב עוצמה בתחום רפואת העיניים הניסויית. זה יכול לספק מידע חדש הקשור לשינויים במבני העין במהלך מחלות עיניים, אשר אחרת לא היה נצפה בהגדרות קליניות. הפרוטוקולים המתוארים מציגים שיטה פשוטה לביצוע ניתוח היסטולוגי של הרשת?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

Acknowledgements

העבודה, כולל חולדות, מומנה כחלק מפרויקט TIME 2 MUW - מצוינות בהוראה כהזדמנות לפיתוח האוניברסיטה הרפואית של ורשה במימון משותף של הקרן החברתית האירופית במסגרת התוכנית האופרטיבית פיתוח חינוך ידע לשנים 2014-2020, מספר הסכם המימון המשותף: POWR.03.05.00-00-Z040/18-00. העבודה, כולל עכברים, בוצעה כחלק מפרויקט שיושם בשנים 2020 עד 2022, במימון סובסידיה למדעים שהושגה על ידי האוניברסיטה הרפואית של ורשה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetone Chempur 111024800
Dumont Tweezers #5, 11cm, 0.05 x 0.01mm TipsWorld Precision Instruments14095small, microsurgical forceps
EosinMar-Four4P.05.2001/LAqueous solution
Ethyl alcohol 96 %Chempur CH.ET.AL.96%CZDA.CH
Ethyl alcohol 99.9 %Chempur CH.ETYL.ALK.99,9%BWUse to prepare 70% and 80% solutions of EtOH
Glacier - 86 °C Ultralow Temperature Freezer NU-9483ENuAire13027D0034Freezing temperature - 80 °C
Glass slidesMar-FourMI.15.01673Ground glass slides with a double-sided matte field for description
Leica CV5030 Fully Automated Glass CoverslipperLeica Biosystems 14,04,78,80,101Automated slide sealer 
Mayer's hematoxylinChempur 124687402
Metal base molds 15 mm  x 15 mmLeica Biosystems 3803081
Microme HM 340 EThermo Scientific90-519-0Microtome
Microtome razor bladesMar-FourHI.N.35Cutting angle 35°
Micro-Twin biopsy cassetteMar-FourLN.13874550
Microwave Hybrid Tissue ProcessorMilestone
Multistainer Leica ST5020Leica Biosystems Automated slide stainer 
NanoZoomer 2.0-HT slide scannerHamamatsuC9600Histopathological slide scanner
NDP.view2 Image viewing softwareHamamatsuU12388-01Image viewing software
Paraffin Pathowax PlusMar-Four4P.PWP.010Melting temperature 56 °C - 58 °C
ParaformaldehydeSigma - Aldrich441244-1KGPrepare a 4% solution in PBS
PBS TabletsMerck Millipore524650-1EAUse to prepare a solution of phosphate buffer saline, per manufacturer's instructions
Pierce Microcentrifuge Tubes, 1.5 mLThermo Scientific69715
Refrigerator-freezer EN14000AWElectrolux925032562-00refrigeration 4 °C
Scalpel bladeSwann-MortonT.OST.SKAL00.024
SucroseChempur 427720906
SuperCut Spring Scissors, 12.5cm, CurvedWorld Precision Instruments501925curved, small microsurgical scissors
Tape for automatic sealersMar-FourKP-3020/SMRH001
XyleneChempur CH.KSYL.5l.METAL.OP 

References

  1. Kels, B. D., Grzybowski, A., Grant-Kels, J. M. Human ocular anatomy. Clin Dermatol. 33 (2), 140-146 (2015).
  2. Gupta, M. P., Herzlich, A. A., Sauer, T., Chan, C. C. Retinal anatomy and pathology. Dev Ophthalmol. 55, 7-17 (2016).
  3. Masland, R. H. Neuronal diversity in the retina. Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).
  4. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Prog Retin Eye Res. 51, 1-40 (2016).
  5. Boulton, M., Dayhaw-Barker, P. The role of the retinal pigment epithelium: Topographical variation and ageing changes. Eye (Lond). 15 (Pt 3), 384-389 (2001).
  6. Baden, T., Euler, T., Berens, P. Understanding the retinal basis of vision across species. Nat Rev Neurosci. 21 (1), 5-20 (2020).
  7. Nguyen-Ba-Charvet, K. T., Chédotal, A. Development of retinal layers. C R Biol. 337 (3), 153-159 (2014).
  8. Adams, T., Chernoff, E., Wilson, J., Dharmarajan, S. Reactive muller glia as potential retinal progenitors. InTech. , (2013).
  9. Salman, A., Mcclements, M. E., Maclaren, R. E. Insights on the regeneration potential of müller glia in the mammalian retina. Cells. 10 (8), 1957 (2021).
  10. Marchesi, N., Fahmideh, F., Boschi, F., Pascale, A., Barbieri, A. Ocular neurodegenerative diseases: Interconnection between retina and cortical areas. Cells. 10 (9), 2394 (2021).
  11. Enoch, J., Mcdonald, L., Jones, L., Jones, P. R., Crabb, D. P. Evaluating whether sight is the most valued sense. JAMA Ophthalmol. 137 (11), 1317-1320 (2019).
  12. Struebing, F. L., Geisert, E. E. What animal models can tell us about glaucoma. Prog Mol Biol Transl Sci. 134, 365-380 (2015).
  13. Bouhenni, R. A., Dunmire, J., Sewell, A., Edward, D. P. Animal models of glaucoma. J Biomed Biotechnol. 2012, 692609 (2012).
  14. Wilding, L. A., Uchihashi, M., Bergin, I. L., Nowland, M. H. Enucleation for treating rodent ocular disease. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (3), 328-332 (2015).
  15. Lin, C. H., et al. A protocol to inject ocular drug implants into mouse eyes. STAR Protoc. 3 (1), 101143 (2022).
  16. Lozano, D. C., Twa, M. D. Development of a rat schematic eye from in vivo biometry and the correction of lateral magnification in sd-oct imaging. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6446-6455 (2013).
  17. Castro, G., Navajas, E., Farah, M. E., Maia, M., Rodrigues, E. B. Migration, integration, survival, and differentiation of stem cell-derived neural progenitors in the retina in a pharmacological model of retinal degeneration. ISRN Ophthalmol. 2013, 752161 (2013).
  18. Chai, G. R., Liu, S., Yang, H. W., Chen, X. L. Quercetin protects against diabetic retinopathy in rats by inducing heme oxygenase-1 expression. Neural Regen Res. 16 (7), 1344-1350 (2021).
  19. Igarashi, T., et al. Tyrosine triple mutated aav2-bdnf gene therapy in a rat model of transient iop elevation. Mol Vis. 22, 816-826 (2016).
  20. Zhang, W., et al. Therapeutic efficacy of neural stem cells originating from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in diabetic retinopathy. Sci Rep. 7 (1), 408 (2017).
  21. Dorfman, D., Aranda, M. L., Rosenstein, R. E. Enriched environment protects the optic nerve from early diabetes-induced damage in adult rats. PLoS One. 10 (8), e0136637 (2015).
  22. Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. J Clin Invest. 102 (4), 783-791 (1998).
  23. Steinle, J. J., Kern, T. S., Thomas, S. A., Mcfadyen-Ketchum, L. S., Smith, C. P. Increased basement membrane thickness, pericyte ghosts, and loss of retinal thickness and cells in dopamine beta hydroxylase knockout mice. Exp Eye Res. 88 (6), 1014-1019 (2009).
  24. Polley, E. H., Walsh, C. A technique for flat embedding and en face sectioning of the mammalian retina for autoradiography. J Neurosci Method. 12 (1), 57-64 (1984).
  25. Turner, K. W. Hematoxylin toluidine blue-phloxinate staining of glycol methacrylate sections of retina and other tissues. Stain Technol. 55 (4), 229-233 (1980).
  26. Cheng, J., et al. Correlation of optical coherence tomography and retinal histology in normal and pro23his retinal degeneration pig. Transl Vis Sci Technol. 7 (6), 18 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved