כימות צפיפות כלי הדם הריאתיים בעכברים על פני אונות

Summary

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט וחסכוני לביצוע כימות בלתי משוחד של צפיפות כלי הדם הריאתיים עבור רקמת ריאה של עכברים שלמים באמצעות צביעה יחידה של איזולקטין B₄.

Abstract

ההחלפה החריגה של אנגיוגנזה ריאתית קשורה לתפקוד לקוי של כלי הדם הריאתיים והיא קשורה קשר עמוק לשלמות דופן כלי הדם, ויסות זרימת הדם וחילופי גזים. במודלים של מורין, אונות הריאה מציגות הבדלים משמעותיים בגודל, בצורה, במיקום ובכלי הדם, אך השיטות הקיימות חסרות התחשבות בשינויים אלה בעת כימות צפיפות כלי הדם. מגבלה זו מעכבת את המחקר המקיף של תפקוד לקוי של כלי הדם הריאתיים ואת העיצוב מחדש הפוטנציאלי של זרימת כלי הדם על פני אונות שונות. הפרוטוקול שלנו מטפל בפער זה על ידי שימוש בשתי שיטות חתך לכימות שינויים בצפיפות כלי הדם הריאתיים, תוך מינוף הגודל, הצורה והפיזור של ענפי דרכי הנשימה על פני אונות נפרדות בעכברים. לאחר מכן אנו משתמשים בצביעת איזולקטין B₄ (IB₄) כדי לתייג תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של הריאה על פרוסות שונות, ולאחר מכן ניתוח צפיפות כלי דם בלתי משוחדים באמצעות התוכנה הזמינה בחינם ImageJ. התוצאות המוצגות כאן מדגישות דרגות שונות של שינויים בצפיפות כלי הדם על פני אונות הריאה עם ההזדקנות, תוך השוואה בין עכברים צעירים ומבוגרים. פרוטוקול זה מציע גישה פשוטה וחסכונית לכימות בלתי משוחד של צפיפות כלי הדם הריאתיים ומאפשר מחקר על היבטים פיזיולוגיים ופתולוגיים של כלי דם ריאתיים.

Introduction

תאי אנדותל (ECs) הם סוג מיוחד של תאים הממוקם על הציפוי הפנימי של כלי הדם, מכסה את כל העץ העורקי והוורידי וממלא תפקיד מכריע בשמירה על יציבות כלי הדם והאיברים¹. הריאות הן איברים וסקולריים מאוד וממלאים תפקידים פיזיולוגיים ופתולוגיים חיוניים בריאות, כגון יצירת דופן כלי הדם, ויסות זרימת הדם, הקלה על חילוף גזים, ויסות תגובות דלקתיות, שליטה בפעילות טסיות הדם, הפרשת חומרים מווסתים המעורבים בגדילת כלי הדם, תיקון ושמירה על איזון קרישה.

תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ריאתיים (LMECs) הם תאי אנדותל ספציפיים של רקמת ריאה, במיוחד במיקרו-כלי הדם (נימים) של הריאות, מה שמבדיל אותם מתאי אנדותל עורקיים ורידיים כלליים יותר בריאות. לתאים אלה תפקידים שונים, כולל ויסות טונוס כלי הדם, שליטה בחדירות כלי הדם, השתתפות בוויסות תגובות דלקתיות וויסות היווצרות פקקת. הם ממלאים תפקיד מכריע במחזור הדם הריאתי, ויסות חילופי הגזים והובלת חומרים מזינים, והם מעורבים בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים הקשורים לריאות, ככל הנראה להזדקנות². יתר על כן, החלפה חריגה של אנגיוגנזה ריאתית קשורה לתפקוד לקוי של כלי הדם הריאתיים³. תוך שימוש בסמן תאי אנדותל קונבנציונלי CD31 ולוקליזציה מרחבית (במיוחד, האזורים ההיקפיים של הריאות), לריסה ל. ועמיתיו הבחינו בירידה משמעותית בצפיפות תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים בעכברים מבוגרים (בני 18 חודשים) בהשוואה לעמיתיהם הצעירים יותר (בני 4 חודשים)⁴. בהקשר של פתולוגיה ריאתית הקשורה לאסתמה, Makoto H. et al. הדגימו עלייה משמעותית בהשראת כלי דם בדגימות ביופסיה של הסימפונות המוכתמות באנטי קולגן IV מחולי אסתמה בהשוואה לנבדקי ביקורת⁵. לאחרונה, על ידי הצגת טכניקות של העברה וסריקה של מיקרוסקופ אלקטרונים, Maximilian A. et al. דיווחו על עלייה ניכרת בצפיפות המספרית של תכונות הקשורות לאנגיוגנזה של התפשלות מעיים והנבטה בחולים שמתו מקוביד-19 או משפעת A (H1N1)⁶. ככל הנראה, בראשית כלי הדם החריגה קשורה לתפקוד ריאתי לקוי. עם זאת, אין כיום שיטה פשוטה וחסכונית לכימות שינויים בצפיפות כלי הדם.

במודלים של מורין, הריאות מחולקות באופן מסורתי לחמש אונות נפרדות: גולגולת ימנית, אמצעית ימנית, קאודלית ימנית, גולגולת שמאלית וקאודלית שמאלית. כל אונה מציגה מאפיינים ייחודיים במונחים של גודל, צורה, מיקום, וככל הנראה כלי דם, מה שתורם לחילופי גזים יעילים ולוויסות סינרגטי פוטנציאלי של מחזור הדם הריאתי. עם זאת, למיטב ידיעתנו, אין מתודולוגיות המסבירות את ההבדלים בין אונות ריאה אלה בעת חקירת שינויים מיקרו-וסקולריים ריאתיים.

מחקר זה מציג שיטה חדשה לחיתוך אונות בעכברים, תוך שימוש ב- IB₄, סמן מוגדר היטב של תאי מיקרו-אנדותל ריאה⁷, להערכה כמותית בלתי משוחדת של צפיפות כלי הדם הריאתיים . גישה חדשנית זו עונה על הצורך בהבנה מקיפה יותר של שינויים מיקרו-וסקולריים בריאות מורין על ידי התחשבות בתכונות הייחודיות של אונות בודדות של עכברים. כהדגמה, בעכברים מזדקנים, ירידה משמעותית ריאתית
צפיפות כלי הדם נצפתה במיוחד הן באונה הקאודלית והן באונה השמאלית. הפרוטוקול מדגיש את החשיבות של שילוב ניתוחים ספציפיים לאונה בחקירות של שינויים בנוף המיקרו-וסקולרי של ריאות מורין. יש לציין כי שיטה זו מספקת הפניות מחקריות יקרות ערך לחוקרים המחפשים הבנה מקיפה של התקדמות פיזיולוגית ופתולוגית של התפתחויות ריאות ונגעים, המשתרעת מעבר לאנגיוגנזה.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות האתיות של הוועדה לחקר בעלי חיים באוניברסיטת סצ'ואן (No K2023023).

1. הכנת קטעי פרפין לאונות ריאה של עכבר

1. לרכוש רקמת הריאה מן העכבר.
   1. בחר עכברי C57Bl/6 זכרים בגיל 6 שבועות ו -16 חודשים כדי להעריך את צפיפות כלי הדם בריאות עכבר בקבוצות גיל שונות.
   2. מתן 100 מ"ג/ק"ג נתרן פנטוברביטלי באמצעות הזרקה תוך צפקית בעכברים. הרדימו את העכברים על ידי פריקת צוואר הרחם לאחר הרדמה. פתח את חלל החזה וקבל רקמת ריאה.
2. הכינו קטעי פרפין.
   1. תקן את הרקמה על ידי הצבתה בתמיסת פרפורמלדהיד 4% שהיא פי 10 מנפח הרקמה כדי לשמר את המורפולוגיה והמבנה שלה ולמנוע התפרקות.
      הערה: לאחרונה פותחה שיטה חדשה לניפוח אוויר במהלך קיבוע זילוח כלי דם בריאות מורין. שיטה זו מדווחת כמשמרת מורפולוגיה ומיקום טובים יותר של דרכי הנשימה, תאי הנאדיות והאינטרסטיציום, מה שהופך אותם למתאימים יותר למחקרים היסטולוגיים של ריאות. שיטה זו מומלצת למעבדות עם הציוד המתאים ומתכלים עם מכשירים מתוצרת בית⁸.
   2. חתכו את אונת הריאה כדי לקבוע את כיוון ההטבעה (איור 1).
      1. לאחר 3 שעות של קיבוע, מפרידים את חמש אונות הריאה (תחת תצפית ישירה על העיניים) ומטמיעים בנפרד את האונות הגולגולתיות, האמצעיות והאביזריות של הריאה הימנית, עם מקטעים המכוונים לכיוון החיבור האנכי בין האונה לסימפונות.
      2. חותכים את האונה הקאודלית של הריאה הימנית ל-2 חתיכות ב-4 מ"מ משמאל לימין בכיוון המאונך לחיבור אונת הריאה-סימפונות, ומטמיעים את הפרוסות בגוש שעווה כשהמשטח החתוך פונה כלפי מעלה.
      3. בצע שלושה חתכים באונת הריאה השמאלית. בצע את החתך הראשון לרוחב מעל צומת הסימפונות הראשי, 2 מ"מ מתחת לחלק העליון. בצע את החתך השני לרוחב מעל צומת הסימפונות הראשי, 5 מ"מ מתחת לחלק העליון. בצע את החתך השלישי בקצה האונה, 8 מ"מ מתחת לחלק העליון. השליכו את פיסת הרקמה העליונה ועטפו את שלושת החלקים הנותרים בגוש שעווה כאשר משטח החיתוך פונה כלפי מעלה.
         הערה: בעת הטבעה של חתיכות ריאה מרובות יחד, ניתן להשתמש בנייר ניגוב במיקרוסקופ כדי לעטוף אותן לפני הכנסתן לקופסת הטבעה של רקמות כדי להמשיך בתהליך ההתייבשות.
      4. תקן מחדש את הרקמה בקיבוע למשך 24 שעות.
   3. הניחו את גוש הטישו במיכל ושטפו אותו תחת מים זורמים במשך 15 דקות.
   4. מניחים את הרקמה ברצף בתמיסות הבאות: 65% אתנול למשך 30 דקות, 75% אתנול למשך 30 דקות, 85% אתנול למשך 30 דקות, 95% אתנול I למשך 60 דקות, 95% אתנול II למשך 60 דקות, אתנול מוחלט I למשך 60 דקות, אתנול מוחלט II למשך 60 דקות, 70% אתנול למשך 120 דקות, 80% אתנול למשך 120 דקות, 90% אתנול למשך 120 דקות, 95% אתנול למשך 120 דקות, אתנול מוחלט I למשך 120 דקות ואתנול מוחלט II למשך 120 דקות.
   5. מניחים את הרקמה בקסילן I למשך 30 דקות ובקסילן II למשך 30 דקות.
   6. הניחו את הרקמה בשעווה רכה מתחת ל-54°C למשך שעה אחת, שעווה קשה I ב-58°C למשך שעה אחת, ושעווה קשה II ב-58°C למשך 30 דקות.
   7. בחרו גודל תבנית מתאים, מלאו אותו בכמות מתאימה של פרפין נוזלי והשתמשו במלקחיים כדי למקם את הרקמה במסגרת ההטבעה במרכז התבנית בכיוון הנכון. מניחים את התבנית והרקמה באזור ההקפאה של מכונת ההטבעה ולוחצים בעדינות על הרקמה בעזרת מלקחיים.
   8. כאשר הפרפין מתחיל להלבין מעט, מקמו במהירות את מסגרת ההטבעה החשופה על גבי התבנית ובצעו את הזרקת השעווה השנייה, תוך אטימת החורים בתחתית מסגרת ההטבעה. מעבירים את כל התבנית לשולחן ההקפאה ליציקה.
   9. לאחר הצמדת גוש השעווה לפרוסת וחשיפת משטח החיתוך החלק והשטוח באמצעות חיתוך גס ועדין, סובבו את ארכובה הגלגל של המיקרוטום כדי לחתוך פרוסות בעובי של 4 מיקרומטר.
   10. הניחו בצורה חלקה את החלקים שהוסרו על פני המים בסדר רציף. לאחר הארכת הקטעים במלואם, הפרידו את החלקים השבורים בצמתים שבין כל קטע.
   11. הטו מגלשת זכוכית מתחת למקטע, ובמגע הרימו את המגלשה לאט ובאופן שווה מפני המים בתנועה אנכית. החלקים יידבקו למגלשת הזכוכית.

2. צביעת אימונופלואורסנציה לאיתור כלי דם ריאתיים

1. הכניסו את הפרוסות המשובצות בפרפין לתנור של 65°C למשך 60 דקות.
2. הניחו את הפרוסות על מדף שקופיות ובצעו את השלבים הבאים בצנצנות צביעה: לטבול קסילן 1, קסילן 2 וקסילן 3 למשך 15 דקות כל אחד, ולאחר מכן לטבול בקסילן / אתנול (1: 1) למשך 5 דקות, 100% אתנול #1, 100% אתנול #2, 85% אתנול, 75% אתנול, ומים מזוקקים במשך 5 דקות כל אחד.
3. לדלל את תמיסת אחזור האנטיגן נתרן ציטראט שונה 50 פעמים עם מים deionized. מחממים את המיקרוגל על עוצמה גבוהה עד לרתיחה, ואז מניחים את המגלשה בתמצית האנטיגן. אפשר למגלשה להרתיח את תמצית האנטיגן למשך 15 דקות ולאחר מכן מצננים באופן טבעי לטמפרטורת החדר.
4. שטפו את המגלשות פעמיים עם PBS במשך 5 דקות כל אחת. חדיר עם 0.25% טריטון פעמיים במשך 10 דקות כל אחד.
5. הקיפו את הרקמה בעט אימונוהיסטוכימי ודגרו עליה עם 5% BSA בטמפרטורת החדר (RT) למשך שעה אחת. שטפו את המגלשות פעם אחת עם PBS למשך 5 דקות.
6. בצע צביעה מצומדת של Alexa-647 Fluor IB₄ ו-DAPI.
   1. שמור את IB₄ על קרח ודלל אותו 1:50 עם 1% BSA. מוציאים עודפי מים מסביב לעיגול, מוסיפים 50-100 מיקרוליטר של IB₄ המדולל לכל מקטע רקמה, ודגרים לילה ב-4°C (משלב זה ואילך, בצעו את כל ההליכים בחושך).
   2. שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחת. חדיר עם 0.25% טריטון למשך 10 דקות.
7. לדלל DAPI (10 מיקרוגרם/מ"ל) עם PBS ביחס של 1:10 ולהוסיף 50-100 μL לכל מקטע רקמה ב-RT למשך 5 דקות.
8. שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחת.
9. יש למרוח טיפה של אמצעי הרכבה נגד דהייה על השקופיות, תוך הימנעות מחשיפה לאור. האוויר יבש את המגלשה, ולאחר מכן צפה וצלם תמונות של הגרעין ואותות המטרה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

3. כימות צפיפות כלי הדם הריאתיים

1. רכוש תמונות.
   1. שימו לב לאותות צפיפות כלי הדם של הריאה ולאותות DAPI תחת יעד של פי 10 עבור כל אונת ריאה בקבוצות הגיל הצעירות והמבוגרות כאחד.
   2. תקנן את עוצמת מקור האור ואת זמן החשיפה לכל ערוץ בהתבסס על תוצאות התצפית. צלם את התמונות הדו-ערוציות המכסות את כל האזור של כל אונת ריאה. שמרו את התמונה בתבנית ND2 עם שני ערוצים (איור 2).
2. כמת באמצעות תמונה J (איור משלים 1).
   1. הפעל את תוכנת ImageJ.
   2. ייבאו תמונות שצוינו ל-ImageJ ולאחר מכן המשיכו לטעון ולבחור אותן. פצלו את הערוצים בהתאם. טען קובץ בתבנית ND2 הן עבור ערוצי DAPI והן עבור ערוצי IB₄ .
   3. נווט כדי לנתח > להגדיר קנה מידה > להגדיר את פרמטרי התמונה כ- 0.48 מיקרומטר לפיקסל (בהתאם לפרמטרי הצילום) > Global > אישור.
   4. הגדר את אותו טווח תצוגה כדי להתאים את אפקט הצגת התמונה. בחר תמונה> התאם > בהירות/ניגודיות > הגדרה. הגדר טווח תצוגה עבור כל אחד משני הערוצים בנפרד, IB₄: 0-10000; DAPI: 0-20000.
   5. כדי למנוע את ההשפעה של אותות רקע, בצע את השלבים הבאים: לחץ על תהליך > מתמטיקה > חיסור; חסר את אות הרקע בהתבסס על ערכי האות שזוהו על ידי הכלי מטה הקסם ברקע, IB₄: 3000; DAPI:300.
   6. לבחירת ערך הסף המתאים ביותר לתמונה המקורית, עברו אל 'תמונה' > 'שכפל'.
   7. בחר הן תמונה מקורית והן תמונה משוכפלת > הקלד > 8 סיביות.
   8. בחר ערך סף מתאים כדי לזהות במדויק את microvasculature הריאה. לחץ על תמונה > התאם > מצבי סף > (בחר את הסף המציאותי ביותר מול התרשים המקורי), סמן > רקע כהה > החל.
   9. סלק אותות חיוביים של IB₄ מכלי דם גדולים בריאה של עכבר, כולל עורקים וורידים: השתמש בכלי מטה הקסם כדי לבחור כלי דם גדולים יותר בהשוואה לתמונה המשוכפלת, ולאחר מכן לחץ על מחק (חזור על כך עד להסרת האותות החיוביים של IB₄ בתאי אנדותל של כלי דם גדולים יותר).
      הערה: אותות צביעה IB₄ מזוהים בתאי אנדותל של עורקים וורידים בריאת העכבר. כדי להשיג בדיקה ספציפית של התרחשויות microvasculature ריאתי, מומלץ להסיר באופן אחיד את מוקדי האות בתאי אנדותל של כלי דם גדולים יותר.
   10. ספור את מספר אותות היעד, לחץ על נתח > הגדר מדידות, וסמן שטח, הגבל לסף והצג תווית. לאחר מכן בחר נתח חלקיקים והגדר גודל: 0-אינסוף; מעגליות: 0.00-1.00; הצגה: מסכות מוגזמות; סמן את סכם ולחץ על אישור.
   11. בחר סכם תוצאות > קובץ > שמירה בשם.
3. ניתוח נתונים וסטטיסטיקה
   1. התאם וארגן את מספר המוקדים החיוביים של IB₄ ו- DAPI חיוביים, בהתאמה, באותה תמונה לטבלה מאוחדת.
   2. סכם את המספר הכולל של IB₄ מוקדים חיוביים ומוקדים חיוביים DAPI עבור כל אונה בקבוצות צעירות או בקבוצות גיל שצוינו.
      1. חשב את אחוז המוקדים החיוביים של IB4 (%) על ידי חלוקת המספר הכולל של מוקדים חיוביים IB₄ במספר הכולל של מוקדי צביעת DAPI בכל אונה בקבוצות שונות. הצג את מספר המוקדים החיוביים של IB₄ , את מספר מוקדי הצביעה של DAPI ואת אחוז המוקדים החיוביים של IB₄ (%) כפי שמוצג באיור 3A.
   3. הפעל את תוכנת ניתוח הנתונים וצור טבלת עמודות חדשה.
      הערה: GraphPad Prism 9 שימש כאן לניתוח סטטיסטי.
   4. ברצף קראו להם מקבוצה A לקבוצה J כ"אונה גולגולתית צעירה", "אונה גולגולתית ישנה", "אונה אמצעית צעירה", "אונה אמצעית ישנה", "אונה קאודלית צעירה", "אונה קאודלית ישנה", "אונה אביזר צעירה", "אונה אביזר ישן", "אונה שמאלית צעירה", "אונה שמאלית ישנה". לאחר מכן, הזן את המוקדים החיוביים המתאימים IB₄ (%) לתוך הטבלה (טבלה משלימה 1).
   5. השתמש במבחני t לא מזווגים להשוואה זוגית כדי להעריך הבדלים משמעותיים באזורים המתאימים בין שתי קבוצות הגיל. ערכו בסך הכל חמש השוואות לחמש אונות.
   6. צרו גרף להמחשת תוצאות (איור 3B). בחר תרשים עמודות וכלול ניתוח סטטיסטי באיור.

תוצאות

כדי להבחין בין הנגעים בסימפונות הראשיים לבין ענפים קטנים בדרכי הנשימה, חיוני לוודא כי המבנה הרציף של נגעים בשני סוגים אלה של דרכי הנשימה הוא ציין. ניתן להשיג זאת על-ידי ביצוע הליכי החיתוך וההטבעה המתוארים באיור 1. בהתחשב באונות הריאה הרבות בעכברים, אשר מכ?...

Discussion

לחקר צפיפות כלי הדם הריאתיים השלכות משמעותיות על הבנת תהליכים פיזיולוגיים ריאתיים וכן על הגדרת סמנים ביולוגיים למחלות בדרכי הנשימה. מחזור הדם הריאתי מתהדר בשטח פנים נימי נרחב העטוף בשכבה דקה של תאי אנדותל. הסמיכות ההרמונית של תאים אלה ותאי אפיתל מכתשית מעוררת קרום נאדי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A	Tissue Fixative
4',6-diamidino-2-phenylindole	MCE	HY-D0814	Nucleic Dyes
Alexa-647 Fluor Conjugated Isolectin B4	Thermo	I32450	Binding Microvessels
Anti-fluorescent Tablet Sealer	Abcam	AB104135	Sample Fixation
Antigen Repair Fluid	Biosharp	BL151A	Repair of Antigenic Sites
Biopsy Cassette	ActivFlo	39LC-500-1	Fixing and Positioning Tissue Samples
Bovine Serum Albumin	Sigma	B2064-50G	Sealing Solution
Cold Plate	Leica	HistoCore Arcadia H	Freezing Samples
Constant Temperature Electric Drying Oven	Taisite	101-0AB	High Temperature Repair
Disposable Microtome Blade	Leica	14035838383	Cutting Tissue Samples to Prepare Sections
Embedding Molds	Shitai	26155166627	Fixing Tissue Samples
Ethanol	Kelong	CAS 64-17-5	Tissue Dehydration Solution
Heated Paraffin Embedding Station	Leica	EG1150	Embedding Tssue Samples in Paraffin
HistoCore Water Bath	Leica	HI1220	Flatten and Fix Tissue Samples
ImageJ (Fiji)	NIH	1.54f	Quantitative Tool
Immunohistochemistry Pens	Biosharp	BC004	Water-blocking Agent
Medical Forceps	Shanghai Medical Equipment	N/A	Grasping, Manipulating, or Moving tissue samples
Microscope	Nikon	Ts2	Imaging Device
Mounting Media	Jiangyuan	Tasteless	Fixing and Preserving Tissue Sections
Paraffin Wax	SCHLEDEN	80200-0014	Fixing Tissue Structure
PBS	Beyotime	C0221A	Wash Buffer
Pentobarbital Sodium	Beijing Chemical Reagent Company	Q/H82-F158-2002	Anesthetic
Rotary Microtome	Biobase	Bk-2258	Preparing Slices
Sterile Scissors	Shanghai Medical Equipment	N/A	segmenting Tissue Samples
Surgical Scalpel	Shanghai Medical Equipment	N/A	Cutting Tissue Samples
Triton	Solarbio	T8200	Permeabilization Solution
Wash-Free Slide	PLATINUM PRO	PRO-04	Fixing Samples for Staining
Xylene	SUM	XK13-011-00031	Tissue De-waxing Solution