A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול לייצור ואימות פונקציונלי של תאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T רגישים להיפוקסיה. פרוטוקול זה מציג את הדור מבוסס הלנטיוירוס של תאי CAR-T רגישים להיפוקסיה ואת אפיונם, כולל אימות של ביטוי CAR תלוי היפוקסיה וציטוטוקסיות סלקטיבית.

Abstract

מחקרים מקיפים הוכיחו את ההבטחה של טיפול תאי קולטן אנטיגן כימרי T (CAR-T) בטיפול בממאירויות המטולוגיות. עם זאת, הטיפול בגידולים מוצקים נותר מאתגר, כפי שמודגם על ידי חששות הבטיחות המתעוררים כאשר תאי CAR-T תוקפים תאים נורמליים המבטאים את אנטיגני המטרה. חוקרים בחנו גישות שונות לשיפור הסלקטיביות של הגידול בטיפול בתאי CAR-T. אסטרטגיה מייצגת אחת לאורך קו זה היא בניית תאי CAR-T רגישים להיפוקסיה, אשר מתוכננים על ידי היתוך תחום פירוק תלוי חמצן למויטי CAR ומתוכננים להשיג ביטוי CAR גבוה רק בסביבה היפוקסית - מיקרו-סביבה גידולית (TME). מאמר זה מציג פרוטוקול ליצירת תאי CAR-T כאלה והאפיון התפקודי שלהם, כולל שיטות לניתוח השינויים בביטוי CAR וביכולת ההרג בתגובה לרמות חמצן שונות שנקבעו על ידי תא אינקובטור נייד. תאי ה-CAR-T שנבנו צפויים להדגים ביטוי CAR וציטוטוקסיות באופן רגיש לחמצן, ובכך לתמוך ביכולתם להבחין בין TME היפוקסי לבין רקמות נורמליות נורמוקסיות לצורך הפעלה סלקטיבית.

Introduction

טיפול בתאי T (CAR-T) קולטן אנטיגן כימרי היווה פריצת דרך משמעותית בטיפול בסרטן. מאז שמנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) אישר את הטיפול הראשון ב-CAR-T לטיפול בלימפומה מתקדמת/עמידה ובלוקמיה לימפובלסטית חריפה בשנת 2017, 1,2,3, 10 טיפולי CAR-T המכוונים ל-CD19 או אנטיגן להבשלת תאי B (BCMA) קיבלו אישור ברחבי העולם4. עם זאת, למרות מחקר מקיף, שחזור היעילות יוצאת הדופן של טיפול CAR-T בטיפול בממאירויות המטולוגיות נותר מאתגר עבור היישום שלו על גידולים מוצקים 5,6,7,8.

Protocol

במחקר זה, HER2-BBz-ODD, מכונית רגישה להיפוקסיה המכוונת ל- HER2 (מזהה גן: 2064) הושוותה למקבילתה הרגילה, HER2-BBz. השרטוטים של שתי המכוניות מודגמות באיור 1A, אשר מראה כי HER2-BBz-ODD נגזר מ-HER2-BBz על-ידי הוספת רצף ה-ODD למסוף C של CD3ξ. בניית וקטורים לנטי-ויראליים המבטאים את שני ה-CARs ויצירת הלנטיוירוס המתאים על ידי טרנספקציית תאים 293T תוארה בעבר31.

1. יצירת תאי CAR-T רגישים להיפוקסיה על ידי זיהום לנטיויראלי

  1. הפשירו תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים (PBMCs) בהקפאה במהירות של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. העבירו את מרכזיות ההפשר....

תוצאות

מיזוג תחום ה-ODD של HIF-1α ל-CAR moiety מייצג אסטרטגיה ראשונית ליצירת CAR רגיש להיפוקסיה. המכונית הממוקדת ב-HER2 הרגישה להיפוקסיה שנותחה במחקר זה, בשם HER2-BBz-ODD, נבנתה באמצעות אסטרטגיה זו על-ידי שילוב רצף ה-ODD ב-HER2-BBz הקונבנציונלי שלה (איור 1A). במחקר זה השתמשנו בהתמרה לנטיו.......

Discussion

חששות בטיחות הם נושאים משמעותיים שיש לטפל בהם כדי שכל טיפול בתאי CAR-T יתקדם לשימוש קליני. ניצול התכונות הייחודיות של תאי הגידול או TME הפך לכיוון מחקר עיקרי המתמקד בפיתוח תאי CAR-T המכוונים לרקמות הגידול באופן סלקטיבי. תכנון CAR-T רגיש להיפוקסיה הוא אסטרטגיה אטרקטיבית בכיוון ז?.......

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהתוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח של סין (2016YFC1303402), המגה-פרויקט הלאומי על מחלות זיהומיות מרכזיות (2017ZX10202102, 2017ZX10304402-002-007), והתוכנית הכללית של ועדת הבריאות העירונית של שנחאי (201740194).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL Centrifuge tubeQSP509-GRD-QSupernatants and cells cellection
Protocol Step 2,3,4
10% ExpressCast PAGENCM biotechP2012Immunoblotting
Protocol Step 3
10x PBSNCM biotech20220812Cell culture
Protocol Step 4
10 mL pipetteYueyibioYB-25HPipetting
Protocol Step 1
10xTRIS-Glycine-SDS electrophoresis bufferEpizyme3673020Immunoblotting
Protocol Step 3
15 mL Centrifuge tubeThermo Scientific339650Supernatants and cells cellection
Protocol Step 1
25 cm2 EasYFlaskThermo Scientific156367Cell culture
Protocol Step 3,4
4x Protein SDS PAGE Loading BufferTakara9173Immunoblotting
Protocol Step 3
6-well flat-bottom tissue culture platesThermo Scientific140675T Cells culture
Protocol Step 1
96-well black flat-bottom tissue culture platesGreiner655090Cytotoxicity assay
Protocol Step 4
96-well ELISA platesCorning3590ELISA
Protocol Step 5
96-well plate shakerQILINBEIERMH-2Shake
Protocol Step 4
96-well U-bottom tissue culture platesThermo Scientific268200Supernatants cellection
Protocol Step 4,5
anti-FLAG antibodySigmaF1804-50UGImmunoblotting
Protocol Step 3
CarbinolSinopharm10010061Immunoblotting
Protocol Step 3
Carbon dioxide incubatorThermo Scientific360Cell culture
Protocol Step 1,2,3,4
Cell counting plateHausser scientific1492Cell counting
Protocol Step 1,3,4
CELLection Pan Mouse IgG KitThermo Scientific11531DMouse IgG magnetic beads
Protocol Step 1
CentrifugeThermo Scientific75002432Cell culture
Protocol Step 1,3,4
Chemiluminescence gel imaging systemBIO-RAD12003154Immunoblotting
Protocol Step 3
Cobalt chloride solution (0.5 M)bioleaperBR4000203Hypoxic condition
Protocol Step 2,3,4
DMEMCorning10-103-CVCell culture
Protocol Step 4
Electronic balanceSartoriusPRACTUM612-1CNweigh
Protocol Step 5
FBSBI04-001-1ACSCell culture
Protocol Step 3,4
GAPDH Mouse mAbABclonalAC002Immunoblotting
Protocol Step 3
Gel electrophoresis apparatusBIO-RAD1645070Immunoblotting
Protocol Step 3
GloMax Microplate ReadersPromegaGM3000luciferase activity measurement
Protocol Step 4
Goat anti-Mouse IgG (H+L)YeasenP1126151Immunoblotting
Protocol Step 3
High speed microfreezing centrifugeeppendorf5810 RCell culture
Protocol Step 1
Human IFN-γ ELISA SetBD555142ELISA
Protocol Step 5
Items: Recombinant Human IFN-γ Lyophilized Standard, Detection Antibody Biotin Anti-Human IFN-γ , Capture Antibody Purified Anti-Human IFN-γ, Enzyme Reagent Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (SAv-HRP)
Human IL-2 ELISA SetBD555190ELISA
Protocol Step 5
Items: Recombinant Human IL-2 Lyophilized Standard, Detection Antibody Biotin Anti-Human IL-2 , Capture Antibody Purified Anti-Human IL-2, Enzyme Reagent Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (SAv-HRP)
IL-15R&D systemsP40933T Cells culture
Protocol Step 1
IL-21NovoproteinGMP-CC45T Cells culture
Protocol Step 1
IL-7R&D systemsP13232T Cells culture
Protocol Step 1
Inverted microscopeOlympusCKX41Cell culture
Protocol Step 1,3,4
JurkatATCCTIB-152CAR-Jurkat construction
Protocol Step 3
LSRFortessaBDLSRFortessaFlow cytometry
Protocol Step 2
Luciferase Assay SystemPromegaE1501luciferase reporter assay
Protocol Step 4
Items: Passive lysis buffer, firefly luciferase substrate
Microplate readerBioTekHTXELISA
Protocol Step 5
mobile CO2/O2/N2 Incubator ChamberChina Innovation Instrument Co., Ltd.Smartor118Hypoxic condition
Protocol Step 2, 3, 4
Mouse Anti-Hexa Histidine tagSigmaSAB2702218Immunoblotting
Protocol Step 3
NcmBlot Rapid Transfer BufferNCM biotechWB4600Immunoblotting
NcmECL UltraNCM biotechP10300Immunoblotting
Protocol Step 3
Items: NcmECL Ultra Luminol/Enhancer Reagent (A) ,NcmECL Ultra Stabilized Peroxide Reagent (B) 
NovoNectin -coated 48-well flat platesNovoproteinGMP-CH38CAR-T cells construction
Protocol Step 1
OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride) tablet setSigmaP9187Substrate Reagent
Protocol Step 5
Items: OPD tablet (silver foil),urea hydrogen peroxide tablet (gold foil)
PE-conjugated anti-DYKDDDDKBiolegend637310Flow cytometry
Protocol Step 2
Protamine sulfateSigmaP3369-1OGLentivirus infection
Protocol Step 1
Protein Marker 10 Kda-250 KDaEpizymeWJ102Immunoblotting
Protocol Step 3
 Purifed NA/LE Mouse Anti-Human CD3BD566685T Cells culture
Protocol Step 1
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28BD555725T Cells culture
Protocol Step 1
PVDF membraneMillipore168627Immunoblotting
Protocol Step 3
RPMI 1640Corning10-040-CVRCCell culture
Protocol Step 3
Skim milk powderYeasenS9129060Immunoblotting
Protocol Step 3
SKOV3-LucATCCHTB-77Cytotoxicity assay
Protocol Step 4
Trypsin-EDTANCM biotechC125C1Cell culture
Protocol Step 4
Tween 20Sinopharm30189328Immunoblotting
Protocol Step 3
Water bathkeelreinNB014467Heating
Protocol Step 1
X-VIVO 15 LONZA04-418QSerum-free lymphocyte culture medium
Protocol Step 1

References

  1. Boardman, A. P., Salles, G. CAR T-cell therapy in large B cell lymphoma. Hematol Oncol. 41 (S1), 112-118 (2023).
  2. Chen, Y. -. J., Abila, B., Mostafa Kamel, Y. CAR-T: What is next. Cancers. 15 (3), 663 (2023).
  3. Barsan, V., et al.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

TCAR T

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved