JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים את ההכנה שלב אחר שלב של הגברה איזותרמית מבוססת רקומבינאז מעורבבת מראש, ליופילית ותגובות מבוססות Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), אשר ניתן להשתמש בהן לזיהוי סמנים ביולוגיים של חומצות גרעין של פתוגנים של מחלות זיהומיות או סמנים גנטיים אחרים בעלי עניין.

Abstract

אבחון מולקולרי על ידי זיהוי מבוסס Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) הוא בעל דיוק אבחוני גבוה ותכונות המתאימות לשימוש בנקודות טיפול, כגון זמני אספקה מהירים לתוצאות, קריאות פשוטות נוחות וללא צורך במכשירים מסובכים. עם זאת, התגובות יכולות להיות מסורבלות לביצוע בנקודת הטיפול בשל מרכיביהן הרבים ושלבי הטיפול הידניים. בזאת, אנו מספקים פרוטוקול ממוטב שלב אחר שלב לזיהוי חזק של פתוגנים וסמנים גנטיים של מחלות עם הגברה איזותרמית מבוססת רקומבינאז וריאגנטים מבוססי קריספר, אשר מעורבבים מראש ולאחר מכן מיובשים בהקפאה בפורמטים קלים לאחסון ומוכנים לשימוש. ריאגנטים מעורבבים מראש ומיובשים בהקפאה ניתנים להתייבשות לשימוש מיידי ושומרים על יעילות הגברה וזיהוי גבוהה. אנו מספקים גם מדריך לפתרון בעיות נפוצות בעת הכנה ושימוש בריאגנטים מעורבבים מראש ומיובשים בהקפאה לאבחון מבוסס קריספר, כדי להפוך את פלטפורמת הזיהוי לנגישה יותר לקהילות האבחון/בדיקות גנטיות רחבות יותר.

Introduction

אבחון מבוסס קריספר לזיהוי סמנים ביולוגיים של חומצות גרעין דווח לראשונה בשנת 2017 1,2,3,4, ומאז, הוכח כאבחון הדור הבא עם בדיקות שאושרו על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA), במיוחד לזיהוי RNA של תסמונת נשימה חריפה חמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2), במספר מדינות 5,6,7,8 . מעבר למחלת הקורונה 2019 (COVID-19), הטכנולוגיות הוכחו כיעילות לאיתור וירוסים וחיידקים מגוונים 9,10,11,12,13, מוטציות ומחיקות של מחלות גנטיות, וניתן להנדס אותן לאיתור סמנים ביולוגיים של חלבונים ומולקולות קטנות 2,12. אבחון מבוסס קריספר משלב לעתים קרובות שיטות הגברה איזותרמיות - כגון הגברה של רקומבינאז פולימראז (RPA) או הגברה איזותרמית בתיווך לולאה (LAMP)14,15 - עם זיהוי מבוסס קריספר באמצעות אנזימים הקשורים לקריספר מונחה RNA (Cas) עם פעילות אנדונוקלאז "בטחוני" לאחר זיהוי מטרה3. השימוש הכפול בהגברה איזותרמית וגילוי מבוסס קריספר מעניק מספר תכונות רצויות לטכנולוגיות, במיוחד דיוק אבחון גבוה המתקרב לזה של תגובת שרשרת פולימראז סטנדרטית זהב (PCR), ויכולת לריבוב וזיהוי הבדלי רצפים קטנים, כולל פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים 1,9.

עם זאת, הגרסאות המדויקות ביותר של אבחון מבוסס קריספר מכילות רכיבים ושלבים מרובים ועשויות להיות מסובכות לביצוע עם אנשים שאינם מומחים או בנקודת הטיפול (POC). כדי להתמודד עם אתגר זה של הרחבת השימוש באבחון מדויק ביותר מבוסס קריספר להגדרות POC, פיתחנו פרוטוקולים להכנת הגברה איזותרמית מעורבבת מראש, ליופילית, מבוססת רקומבינאז ותגובות זיהוי מבוססות קריספר, קלות לשימוש ולאחסון7. פרוטוקולים אלה צריכים להשלים פרוטוקולים מצוינים קיימים על אבחון מבוסס קריספר14, המכילים מידע נוסף על ייצור רכיבים ביוכימיים הדרושים לאבחון מבוסס קריספר7, הנחיות תכנון1, ופורמולציות המשתמשות בטכניקות הגברה איזותרמיות חלופיות 2,14,15,16 ואנזימי Cas 12. בסופו של דבר, אנו מקווים שאבחון מבוסס קריספר יוכל לסייע במימוש זיהוי גרעין מהיר, זול ורגיש בסביבות שבהן נדרשים ניתוחים ניידים ונטולי מכשירים 1,9,17.

אנו משתמשים בעיקר בשילוב של זיהוי מבוסס RPA ו- Cas13 בפרוטוקולים שלנו. RPA פועל בטמפרטורות סביבה קרובות (37-42 ° C), ולכן, יש דרישות אנרגיה וציוד נמוכות. תגובות הגברה איזותרמיות אחרות דורשות טמפרטורות גבוהות יותר (LAMP, 60-65°C; הגברת תזוזת גדיל (SDA), 60°C; תגובת הגברה מעריכית (EXPAR), 55°C; והגברה תלוית מנחת מסוקים (HDA), 65°C)2. גם העיצוב של פריימרים RPA אינו מורכב, בניגוד לפריימרים LAMP, וניתן להרחיב אותו להגברה מרובבת 7,9,14. למרות שריבוב מעבר לשתי מטרות עם RPA קשה בפועל, ישנן הנחיות ברורות כיצד לתכנן פריימרים RPA מרובבים כדי למזער הפרעות18.

בעוד שזיהום נשיאה נותר בעיה גדולה בתהליך העבודה הדו-שלבי, האמפליקונים שנוצרו של RPA הם קטנים בגודלם ונוטים פחות לגרום לזיהום נשיאה בהשוואה לאמפליקונים שרשוריים גדולים מ- LAMP14. פריימרים RPA ניתן לתכנן על פי הנחיות תקן14: הם בדרך כלל 25-35 נוקלאוטיד ארוך עם טמפרטורות התכה של 54 עד 67 ° C. גודל האמפליקון צריך להיות קטן מ-200 זוגות בסיסים. ניתן להוסיף את אנזים השעתוק ההפוך (RT) ל-RPA כדי לאפשר הגברה מ-RNA, ובשעתוק לאחור-RPA (RT-RPA), אנזים נוסף ריבונוקלאז H (RNase H) מתווסף בדרך כלל בכמויות קטנות כדי לסייע בפתרון הרנ"א המתקבל: DNA היברידי ולקדם את תגובת ההגברה 5,19. כדי לאפשר שעתוק T7 לזיהוי מבוסס Cas13, ניתן למקם את מקדם T7 RNA פולימראז בקצה 5' של פריימר RPA קדמי.

לאחר שאמפליקונים נוצרים מ-RPA, ניתן לזהות אותם באמצעות אנזימי Cas מתוכנתים של crRNA. בין אנזימי Cas שונים שניתן להשתמש בהם לזיהוי אמפליקון, אנו מעדיפים גרסאות Cas13 ממוקדות RNA בשל פעילות המחשוף הגבוהה שלהם1 והעדפות מחשוף פולינוקלאוטידים מאופיינות היטב 7,9, שהאחרון שבהם יכול לשמש לזיהוי מרובה. רצף crRNA עבור Cas13 מתוכנן להיות משלים (משלים הפוך) לאתר המטרה ב-RNA המיוצר עם רצפי ספייסר וחזרה ישירה (DR). רצף crRNA ופריימרים RPA לא צריכים לחפוף, כדי למנוע זיהוי מבוסס Cas לא רצוי של מוצרי הגברה מחוץ למטרה, אשר מגביר רקע ותוצאות חיוביות שגויות14.

זיהוי מבוסס Cas מסתמך על שיטות זיהוי שונות כדי לנטר את הפיצול של מולקולות חומצות גרעין מדווח (כתבי RNA עבור תגובות מבוססות Cas13)1,2,14. שיטות גילוי שונות כוללות קולורימטריה, קריאות אלקטרוכימיות, פלואורסצנטיות, קריאות רצף ורצועות זרימה רוחביות2. אנו מתמקדים בקריאת הפלואורסצנטיות בהינתן מגוון פלואורופורים וכתבים כגון ציאנין 5 (Cy5), רודאמין X (ROX) וקרבוקסיפלואורסצאין (FAM), שניתן לעורר ביעילות באמצעות מקור אור LED כחול יחיד, והפלואורסצנטיות שלהם מנותחת על ידי קורא מיקרו-לוחות או מחזור תרמיבזמן אמת 7,14. בנוסף, קריאת פלואורסצנטיות קלה להגדרה ומאפשרת ניטור רציף, המאפשר כימות בזמן אמת. ניתן לשלב הגברה מוקדמת של RPA מרובב וזיהוי מבוסס Cas13 באמצעות אנזימי Cas עם קריאות פלואורסצנטיות צבעוניות לזיהוי סימולטני של מטרות גנטיות מרובות 2,7.

בפרוטוקולים שלנו, אנו מגבירים תחילה באופן איזותרמי רנ"א עם RT-RPA על-ידי הוספת דגימת רנ"א לצורה הליופילית של מגיב RT-RPA (איור 1). במהלך RT-RPA, מקדם T7 מתווסף למגבר הדנ"א הדו-גדילי שנוצר. לאחר מכן, מוצרי RPA מועברים לזיהוי מבוסס Cas13 ליופילי, המכיל גם T7 RNA פולימראז. תגובת זיהוי זו תמיר אמפליקונים של DNA ל-RNA (באמצעות T7 RNA פולימראז), אשר ניתן לזהות בקלות באמצעות Cas13 מתוכנת crRNA. Cas13 המופעל על ידי מטרה יבקע מולקולות כתב כדי לייצר אות פלואורסצנטי 2,7,14 הניתן לזיהוי. בעוד שהפרוטוקולים כאן מתייחסים לזיהוי על ידי Leptotrichia wadei (LwaCas13a), ניתן להרחיב אותם לזיהוי סימולטני מרובב של עד ארבע מטרות באמצעות אנזימים אורתוגונליים Cas13 ו- Cas12 7,9. תגובות זיהוי מבוססות RPA ו- Cas יכולות גם להיות משולבות לצינור יחיד, אם כי באובדן רגישות14.

figure-introduction-7116
איור 1: זרימת עבודה לזיהוי מבוססת קריספר. זרימת העבודה מדגימה זיהוי של שני גני מטרה. ראשית, אזורי עניין בתוך יעד הדנ"א מוגברים באופן איזותרמי באמצעות RPA; התגובה יכולה להתבצע באמצעות שעתוק לאחור (RT-RPA) בעת זיהוי מטרות RNA. לאחר מכן, שעתוק T7 ממיר אמפליקונים dsDNA לרנ"א, אשר בתורו מזוהים על ידי קומפלקסים Cas13-crRNA המסוגלים לעורר פעילות RNase בטחונות בעת קשירת המטרה. מחשוף של כתבי פלואורסצנטיות מרווים מייצר אותות פלואורסצנטיים שניתן לנטר באמצעות קורא מיקרו-לוחות, לדמיין על ידי טרנסילטור LED, או להשתמש בהם עם מחזור תרמי בזמן אמת. קיצורים: CRISPR = מקובצים במרווחים קבועים של חזרות פלינדרומיות קצרות; RT = תמלול הפוך; RPA = הגברת רקומבינאז פולימראז; Cas = חלבון הקשור לקריספר; LED = דיודה פולטת אור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

המאפיינים העיקריים של הפרוטוקולים המוצגים כאן הם ניסוחים premixing עבור lyophilization. ערבוב מקדים מפשט את השימוש בתגובה ומשפר את יכולת השחזור, אך רכיבים רבים בזיהוי מבוסס RPA ו- Cas - במיוחד שעתוק לאחור וכמה גורמים משלימים כמו ATP אינם יציבים בתמיסה. לכן, אנו מגבשים את הפתרונות המעורבבים מראש כך שניתן יהיה לייבש אותם בהקפאה לאחסון לטווח ארוך ולשינוע ופריסה קלים 1,9,20. ריאגנטים מעורבבים מראש ומיובשים בהקפאה מסייעים גם הם לשפר את רגישות הזיהוי, מכיוון שניתן להוסיף נפח דגימה גבוה יותר (ולכן, קלט DNA/RNA גבוה יותר) כדי לשחזר את התגובה10. בנוסחאות שלנו, אנו משתמשים בעיקר בטרהלוז21 כמגן קריוגני בתגובות זיהוי מבוססות RPA ליופיליות ו- Cas7. בנוסף לשימור ריאגנטים, טרהלוז גם מקדם את התגובות באמצעות הגדלת ייצוב האנזים 16,22,23,24 והפחתת טמפרטורות ההתכה של dsDNA 23. חקר מייצבים אחרים 5,7,21,25,26 מעבר לטרהלוז עשוי להניב ניסוחים אופטימליים עוד יותר לתרחישי שימוש שונים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת ריאגנטים מעורבים מראש RT-RPA lyophilized

  1. הכנת ציוד
    1. הכינו דיואר חנקן נוזלי או מגש להקפאת הבזק של תגובות. מלאו את הדיואר או המגש בחנקן נוזלי.
    2. מייבש בהקפאה
      1. בדוק מים מרוכזים בצינורות ניקוז ואת פנים החדר; מוציאים את המים במידת הצורך.
      2. נקו את פנים התא ואת מתלה המתכת צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל עם תמיסת טיהור RNase, ואחריה 70% אתנול.
      3. סגור את דלת התא ואת שסתום שחרור הוואקום.
      4. הפעילו את מייבש ההקפאה.
      5. הגדר ידנית את טמפרטורת המדף ל -30 ° C.
    3. ציוד ביולוגיה מולקולרית
      1. נקו את הדברים הבאים עם תמיסת טיהור RNase: פיפטות (פיפטה), מתלי קצה פיפטה, מערבל מערבולת, מיניצנטריפוגה מסתובבת וסמן קבוע.
      2. נקו את הפריטים הבאים במי ברז, ולאחר מכן נגבו בנייר מגבונים: מתלים מפלסטיק לצינורות מיקרוצנטריפוגות וקופסת קצף לקרח.
      3. הכינו גוש חימום (המשמש להמסת תמיסת הטריגליצין) על ידי ניקויו בתמיסת טיהור RNase ואתנול 70%. לאחר מכן, הפעל אותו והגדר את הטמפרטורה ל -60 מעלות צלזיוס.
  2. הכנת תגובות RPA מעורבות מראש
    הערה: נוסחה זו מיועדת ל-10 תגובות (באמצעות שלושה כדורי RPA).
    1. בדוק אם יש משקע בתמיסת הטריגליצין לפני השימוש. אם יש שקעים, יש להמיס אותם על ידי דגירה בטמפרטורה של 60°C וערבוב יסודי לפני השימוש. קררו את תמיסת הטריגליצין לפני הוספת ריאגנטים רגישים אחרים לחום.
      הערה: משקעים יכולים להיווצר בקלות אם הצינור נשאר בטמפרטורת החדר לתקופה ממושכת.
    2. מוציאים מהמקפיא שלושה צינורות רצועת כדורי RPA; הקש על צינורות הרצועה על ידי הטחתם בעדינות על ספסל המעבדה כדי לעקור את הכדורים הלבנים.
    3. מעבירים את כל שלושת הכדורים לצינור מיקרוצנטריפוגה A בנפח 1.5 מ"ל.
    4. פיפטה 25 μL של מים נטולי נוקלאז כדי לשטוף את כל אבקת RPA שנותרה בצינורות הרצועה ולהעביר את תמיסת השטיפה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל B.
    5. הוסף 10 μL של תמיסת טריגליצין 0.57M ו- 10 μL של תערובת פריימר (10 μM כל אחד) לצינור מאסטרמיקס B.
    6. מערבולת ערבוב צינור B; לאחר מכן סובבו מטה והניחו את הצינור על קרח.
    7. הוסף 28.4 μL של חיץ 5x RPA (מוכן מ 500 μL של 50% (w/v) PEG20000, 250 μL של 1 M Tris pH 7.4, ו 100 μL של 100 mM dithiothreitol (DTT)) לצינור מאסטרמיקס B ולערבב היטב על ידי הקשה חזקה או ניעור מספר פעמים.
      הערה: אנו מייצרים את הפתרון באופן זה כדי לעזור לדלל/להפחית את צמיגות ה-PEG בצינור המאסטרמיקס, לפני הוספת הכל לכדורי RPA מסיסים.
    8. העבר כדורים שנאספו בצינור A משלב 1.2.3 לתוך צינור Mastermix B ולאחר מכן הפוך את צינור Mastermix מספר פעמים כדי לערבב. שימו לב אם התמיסה נראית הומוגנית ומונופאזית (היא גם תיראה מעט אטומה) ולאחר מכן, הניחו את הצינור על קרח.
      הערה: אם הערבוב אינו יסודי, PEG עלול לגרום לתמיסה/מתלה להיפרד פאזה.
    9. הוסף 0.71 μL של 200 Unit/μL RT ו- 2.84 μL של 5 Unit/μL RNase H לצינור המאסטרמיקס. הקש בעדינות או הפוך את צינור Mastermix למעלה ולמטה פעמים רבות. סובבו מטה והניחו את הצינור על קרח.
      הערה: אנו מוסיפים אנזימים אלה לאחר ערבוב כבד של שלבים מוקדמים יותר מכיוון ש- RT ו- RNase H רגישים לגזירה עקב ערבוב; אין יותר מערבולות לאחר הוספת RT/RNase H.
    10. Aliquot 8.4 μL של פתרון mastermix ל 10 צינורות 1.5 מ"ל מקורר מראש ומניחים את הצינורות על קרח. לשם כך, טבלו את קצה הפיפט בתמיסת מאסטרמיקס ומשכו את תמיסת המאסטרמיקס לתוך הקצה לאט ובהתמדה כדי למנוע היווצרות בועות אוויר ולהבטיח מדידת נפח מדויקת. הוציאו את תמיסת המאסטרמיקס לצינור מקורר מראש של 1.5 מ"ל.
      הערה: עם 8.4 μL aliquoted, מניסיוננו, יישאר ~ 1-2 μL השעיה בצינור Mastermix. הנסיין יכול לכוונן מעט את עוצמת הקול כדי להבטיח מספיק ריאגנטים לכל 10 התגובות. השתמש בטכניקות פיפטינג נכונות בעת טיפול בתמיסות צמיגיות.
    11. לאחר השלמת aliquoting, מניחים את הצינורות במדף מתכת שקוע בחנקן נוזלי כדי להכין אותם לליופיליזציה. אפשר לצינורות להיות שקועים בחנקן נוזלי למשך 5 דקות.
      הערה: כמו lyophilization מסיר תמיסה עודפת, זה מאפשר לנו להוסיף יותר קלט DNA/RNA, אשר מסייע להגביר את הרגישות. תגובות RPA מיובשות מראש מיובשות בהקפאה ניתן לאחסן ב -20 ° C במשך 8 חודשים. ליופיליזציה מסייעת בשחזור אם ניסוי נתון מבוצע באמצעות תערובות RPA שהוכנו באותה אצווה, כך שביצוע אצווה גדולה יותר גם עוזר.
  3. ליופיליזציה
    1. במייבש ההקפאה, בדקו את טמפרטורת הקולט והמדף. במידת הצורך, המתן עד שטמפרטורת האספן תגיע ל -75 ± 5 מעלות צלזיוס וטמפרטורת המדף תגיע ל -30 ± 1 מעלות צלזיוס.
    2. כסו את הצינורות הפתוחים במדף המתכת ביריעת נייר ניגוב, הניחו את מדף המתכת יחד עם הצינורות הפתוחים במדף מייבש ההקפאה וסגרו את דלת המדף.
    3. בחר את התוכנית המוצגת בטבלה 1 ולחץ על התחל. לאחר 30 דקות של שלב הייבוש המשני (20 ° C, <0.1 mbar; הטמפרטורה מוחזקת עד אינסוף על ידי הגדרת זמן הצעד ל "אינסופי"), לחץ על הפסק את התוכנית.
      הערה: אנו מאפשרים לצינורות להתחמם במייבש ההקפאה כדי למנוע עיבוי מים.
    4. שחררו את הלחץ על ידי פתיחת שסתום שחרור הוואקום ולאחר מכן הסירו את המדף מהמדף. מכסים את הצינורות מיד ומאחסנים את התגובות הליופיליות ב -20 מעלות צלזיוס.
      הערה: ניתן לאחסן תגובות מעורבות מראש של RPA ו-CRISPR-Cas13a בטמפרטורה של -20°C למשך 8 חודשים.

2. הכנת ריאגנטים לזיהוי CRISPR-Cas13a מעורבבים מראש

הערה: בצע את שלב 1.1 להכנת ציוד.

  1. הכנת תגובה מעורבת מראש CRISPR-Cas13a (10 תגובות)
    1. הסר את הפריטים הבאים מהאחסון והנח אותם על קרח: 10 μL של LwaCas13a (מיוצר בבית 7,8,14) (2 מ"ג / מ"ל), מאגר אחסון Cas, 10 ng / μL (225 nM) crRNA, 25 mM rNTP, 50 יחידות / μL T7 RNA פולימראז, 2 מיקרומטר של כתב פלואורסצנטי FAM.
    2. הכן פתרון עבודה של LwaCas13a ב 126 מיקרוגרם / מ"ל (900 ננומטר) על ידי הוספת 148.8 מיקרוליטר של מאגר אחסון Cas (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 0.6 M NaCl, 5% גליצרול, 2 mM DTT) ל 10 μL של 2 מ"ג / מ"ל LwaCas13a.
    3. הכינו את תגובת המאסטרמיקס CRISPR-Cas13a באופן הבא: 71 μL של מים נטולי RNase, 20 μL של 400 mM Tris pH 7.4, 20 μL של 60% (w/v) trehalose, 10 μL של 10 ng/μL (225 nM) crRNA (כאן, מכוון לגנים s ו-n של SARS-CoV-2), 8 μL של תערובת rNTP של 100 mM (25 mM כל אחד), 6 μL של 50 יחידות / μL T7 RNA פולימראז, 25 μL של 2 μM FAM fluorescence reporter, ו 10 μL של 126 μg / mL (900 nM) LwaCas13a. מערבבים היטב על ידי היפוך צינור Mastermix; לאחר מכן, ספין למטה.
    4. Aliquot 17 μL של mastermix לתוך 10 צינורות 1.5 מ"ל להציב על קרח. הניחו את הצינורות במדף שקוע בחנקן נוזלי ואפשרו לצינורות להיות שקועים בחנקן נוזלי למשך 5 דקות.
  2. ליופיליזציה
    1. במייבש ההקפאה, בדקו את טמפרטורות האספן והמדף והמתינו עד שטמפרטורת הקולט תגיע ל -75 ± 5 מעלות צלזיוס וטמפרטורת המדף תגיע ל -30 ± 1 מעלות צלזיוס.
    2. הכניסו את הצינורות למייבש ההקפאה. בחר את התוכנית המוצגת בטבלה 1 ולחץ על התחל. לאחר 30 דקות של שלב הייבוש המשני (25 ° C, <0.1 mbar; הטמפרטורה מוחזקת עד אינסוף על ידי הגדרת זמן הצעד ל "אינסופי"), לעצור את התוכנית.
    3. שחרר את הלחץ על ידי פתיחת שסתום שחרור הוואקום והסר את המדף מהמדף. מכסים את הצינורות מיד ומאחסנים את התגובות הליופיליות ב -20 מעלות צלזיוס.
      הערה: ניתן לאחסן ריאגנטים מעורבבים מראש מסוג RPA ו-CRISPR-Cas13a בטמפרטורה של -20°C למשך 8 חודשים.

3. הגברת חומצת גרעין RT-RPA

הערה: כדי למנוע זיהום צולב, יש להפריד אזורים ופיפטורים במקום העבודה לצורך הגברה מראש, הוספת דגימה והגברה לאחר הגברה. אנו ממליצים להשתמש בקצוות פיפטה מסוננים.

  1. מחממים מראש אינקובטור רעד תרמי ב 42 °C (75 °F).
  2. הוסף 1 μL של תערובת תמיסת מגנזיום אצטט (Mg(OAc)2) ואשלגן אצטט (KOAc) (המורכבת מ-196 mM Mg(OAc)2 ו-1.5 M KOAc) לצד הצינור המכיל את גלולת RT-RPA שעברה ליופיליזציה מעורבבת מראש (מסעיף 1).
    הערה: טריק להוספת תערובת Mg(OAc)2 ו- KOAc: יש למקם את הטיפה סביב סימן הנפח של 1 מ"ל של הצינור. כאן, הטיפה תהיה גלויה בבירור ולא סביר שתאבד מסגירת צינור או פעולות אחרות. ההגברה תתחיל לאחר סיבוב למטה כדי לאסוף את הטיפה בתחתית הצינור. בעת עיבוד יותר מתגובה אחת בכל פעם, ניתן להפעיל את ההגברה בו זמנית.
  3. השהה מחדש את גלולת RT-RPA על ידי הוספת 12.4 μL של דגימת ה- RNA (או דגימות הבקרה).
    הערה: רצף החיבור הוא דגימה שלילית/בקרה שלילית, RNA/DNA לבדיקה, דגימה חיובית/בקרה חיובית.
  4. כדי להתחיל את תגובת RT-RPA, סובב לזמן קצר את הפתרון הנוסף משלבים 3.2 ו-3.3 באמצעות מיניצנטריפוגה של ספין-דאון בטמפרטורת החדר למשך 3 שניות.
  5. מערבבים על ידי הקשה זהירה על הצינור ולאחר מכן לעשות עוד סיבוב קצר במשך 3 שניות.
  6. יש לדגור על התגובה בטמפרטורה של 42°C למשך 60 דקות על ידי הכנסתה לבלוק חימום שחומם מראש או באינקובטור לרעידה תרמית.
  7. לאחר סיום התגובה, הוציאו את צינורות התגובה והניחו אותם על קרח לפני שתמשיכו לשלב זיהוי CRISPR-Cas (סעיף 4).
    הערה: ניתן להשתמש במוצר המוגבר ב-RPA בתגובת הזיהוי באופן מיידי או לאחסן אותו ב-4°C למשך מספר ימים או ב-20°C למשך מספר חודשים.

4. זיהוי חומצות גרעין CRISPR-Cas13

  1. הפעל קורא microplate פלואורסצנטי, להגדיר ולחמם מראש את טמפרטורת החימום ל 37 °C, ובחר את התוכנית המוצגת בטבלה 2.
  2. מניחים צלחת של 384 בארות על קרח.
  3. השהה מחדש את תגובת הזיהוי המעורבב מראש של CRISPR-Cas (מסעיף 2) על ידי הוספת 17 μL של תמיסת מגנזיום כלוריד 8 mM. מערבבים על ידי הקשה זהירה על הצינור; לאחר מכן סובבו בקצרה במשך 3 שניות והניחו את הצינור על קרח.
  4. מעבירים 18 μL של תערובת התגובה המרחפת לכל באר של צלחת 384 באר מקוררת מראש על קרח.
  5. הוסף 2 μL של מוצר RPA מוכן בסעיף 3 לכל תגובה היטב.
  6. הסר את הצלחת מהקרח, הכנס אותה במהירות לקורא מיקרו-צלחות פלואורסצנטי שחומם מראש ולחץ על התחל.
    הערה: צלחת 384 בארות הונחה על קרח כדי לאפשר סנכרון של התחלת התגובה כאשר צלחת 384 בארות מועברת לקורא מיקרו-צלחות פלואורסצנטי שחומם מראש.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

אנו מדגישים את הקינטיקה של יצירת אותות פלואורסצנטיים FAM מהזיהוי המשולב של s ו-n גנים של SARS-CoV-2, וכיצד המידע שימש לקביעת תנאים אופטימליים עבור ניסוחי תגובה ליופיליים ומעורבבים מראש. בכל המקרים, כללנו דגימות עם ערכי Ct היטב בתוך מגבלת הזיהוי שנקבעה (LoD) (Ct ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ישנם שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. להפרדת אזורים, מומלץ להשתמש בחללים נפרדים למיצוי חומצות גרעין, הכנת מאסטרמיקס (אזור טרום הגברה), הוספת דגימה וזיהוי אמפליקון (אזור לאחר הגברה). כל אזור צריך להיות מוגדר באמצעות קבוצה נפרדת של כלים וציוד. אין להכניס כלים מאזור אחד לאזור אחר,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

M.P. ו- C.U. הגישו פטנט בתאילנד על פורמולציות לזיהוי מרובב של RNA SARS-CoV-2. ר.ק. מצהיר שאין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

C.U. מודה במימון מהבנק המסחרי סיאם תחת VISTEC-Siriraj Frontier Research Center, ומ-Thailand Science Research and Innovation (TSRI), קרן פונדמנטלית, שנת הכספים 2024, מענק מספר FRB670026/0457. R.K. ו- M.P. נתמכים על ידי קרנות סטודנטים ועוזרי מחקר מ- VISTEC, בהתאמה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
Betaine solutionSigma-AldrichB0300-1VL
DEPC-Treated waterInvitrogenAM9915G
Dithiothreitol (DTT)Merck3870-25GM
EpiScript reverse transcriptaseLucigenERT12925K
Gly-Gly-Gly Sigma-AldrichSIA-50239-1G
LwaCas13aProducing in-houseStrain name:Leptotrichia wadei, Abbreviation: Lwa, Protein name: LwaCas13a
Magnesium chloride solution, 1MSigma-AldrichM1028-10X1ML
NxGenT7 RNA polymeraseLucigen30223-2
Poly(ethylene glycol)Sigma-Aldrich81300-1KG
Potassium acetate solution, 5MSigma-Aldrich95843-100ML-F
Riobnucleotide Solution MixNEBN0466L
RNase HNEBM0297L
SucroseTCITCI-S0111-500G
Trehalose DihydrateSigma-AldrichSIA-90210-50G
Trizma hydrochloride solution, 1M, pH 7.4Sigma-AldrichT2194-100ML
TwistAmp Basic kitTwistDxTABAS03KIT
Equipment
BluPAD Dual LED Blue/White light transilluminatorBio-HelixBP001CU
Dry Bath Dual BlockELITE4-2-EL-02-220Model: EL-02
Fluorescence microplate readerTecan30050303Model: Infinite 200 Pro
Freeze dryerLABCONCO794001030FreeZone Triad Benchtop Freeze Dryer
Microplate 384-wellGreinerGDE0784076F-Bottom, small volume, Hibase, Med. Binding, Black
Real-time thermal cycler (CFX Connect Real-Time PCR System)Bio-Rad185-5201Model: CFX Connect Optics Module
Oligonucleotide
s-gene forward RPA primerIDTGAAATTAATACGACTCAC
TATAGGGAGGTTTCAAAC
TTTACTTGCTTTACATAGA
s-gene reverse RPA primerIDTTCCTAGGTTGAAGA
TAACCCACATAATAAG
n-gene forward RPA primerIDTGAAATTAATACGACTC
ACTATAGGAACTTCTC
CTGCTAGAATGGCTG
n-gene reverse RPA primerIDTCAGACATTTTGCTCTC
AAGCTGGTTCAATC
LwaCas13a-crRNA for the s geneSynthegoGAUUUAGACUACCCCAAAAAC
GAAGGGGACUAAAACGCAGCA
CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG
LwaCas13a-crRNA for the n geneSynthegoGAUUUAGACUACCCCAAAAACG
AAGGGGACUAAAACAAAGCAAG
AGCAGCAUCACCGCCAUUGC
FAM-polyU-IABkFQ reporterIDT56-FAM/rUrUrUrUrU/3IABkFQ
O-hannah_cytb_F RPA primerIDTGAAATTAATACGACTCACTA
TAGGGTACGGATGAACCATA
CAAAACCTTCACGCAATCG
O-hannah_cytb_R RPA primerIDTAAGATCCATAGTAGATTC
CTCGTGCGATGTGGATA
synT7crRNA13a_ O_hannah IDTGCGCATCCATATTCTTCAT
CTGCATTTAGTTTTAGTCC
CCTTCGTTTTTGGGGTA
GTCTAAATCCCCTATAGT
GAGTCGTATTAATTTC

References

  1. Gootenberg, J. S., et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  2. Kaminski, M. M., Abudayyeh, O. O., Gootenberg, J. S., Zhang, F., Collins, J. J. CRISPR-based diagnostics. Nat Biomed Eng. 5 (7), 643-656 (2021).
  3. Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and classification of CRISPR-Cas systems. Methods Mol Biol. (1311), 47-75 (2015).
  4. Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
  5. Arizti-Sanz, J., et al. Simplified Cas13-based assays for the fast identification of SARS-CoV-2 and its variants. Nat Biomed Eng. 6 (8), 932-943 (2022).
  6. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
  7. Patchsung, M., et al. A multiplexed Cas13-based assay with point-of-care attributes for simultaneous COVID-19 diagnosis and variant surveillance. CRISPR J. 6 (2), 99-115 (2023).
  8. Patchsung, M., et al. Clinical validation of a Cas13-based assay for the detection of SARS-CoV-2 RNA. Nat Biomed Eng. 4 (12), 1140-1149 (2020).
  9. Gootenberg, J. S., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 360 (6387), 439-444 (2018).
  10. Lee, R. A., et al. Ultrasensitive CRISPR-based diagnostic for field-applicable detection of Plasmodium species in symptomatic and asymptomatic malaria. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (41), 25722-25731 (2020).
  11. Myhrvold, C., et al. Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13. Science. 360 (6387), 444-448 (2018).
  12. Wu, H., et al. Versatile detection with CRISPR/Cas system from applications to challenges. Trends Analyt Chem. 135, 116150(2021).
  13. Yao, R., et al. CRISPR-Cas13a-based detection for bovine viral diarrhea virus. Front Vet Sci. 8, 603919(2021).
  14. Kellner, M. J., Koob, J. G., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Zhang, F. SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases. Nat Protoc. 14 (10), 2986-3012 (2019).
  15. Selvam, K., et al. RT-LAMP CRISPR-Cas12/13-based SARS-CoV-2 detection methods. Diagnostics (Basel). 11 (9), 1646(2021).
  16. Carter, C., Akrami, K., Hall, D., Smith, D., Aronoff-Spencer, E. Lyophilized visually readable loop-mediated isothermal reverse transcriptase nucleic acid amplification test for detection Ebola Zaire RNA. J Virol Methods. 244, 32-38 (2017).
  17. Bhardwaj, P., Kant, R., Behera, S. P., Dwivedi, G. R., Singh, R. Next-generation diagnostic with CRISPR/Cas: Beyond nucleic acid detection. Int J Mol Sci. 23 (11), 6052(2022).
  18. Twistamp. Twistamp® assay design manual. , (2023).
  19. Qian, J., et al. An enhanced isothermal amplification assay for viral detection. Nat Commun. 11 (1), 5920(2020).
  20. Ghouneimy, A., Mahas, A., Marsic, T., Aman, R., Mahfouz, M. CRISPR-based diagnostics: Challenges and toward point-of-care applications. ACSSynth Biol. 12 (1), 1-16 (2023).
  21. Jones, K. L., Drane, D., Gowans, E. J. Long-term storage of DNA-free RNA for use in vaccine studies. Biotechniques. 43 (5), 675-681 (2007).
  22. Fang, X., et al. Real-time monitoring of strand-displacement DNA amplification by a contactless electrochemical microsystem using interdigitated electrodes. Lab Chip. 12 (17), 3190-3196 (2012).
  23. Mok, E., Wee, E., Wang, Y., Trau, M. Comprehensive evaluation of molecular enhancers of the isothermal exponential amplification reaction. Sci Rep. 6 (1), 37837(2016).
  24. Wan, J., et al. Development of a test kit for visual loop-mediated isothermal amplification of Salmonella in spiked ready-to-eat fruits and vegetables. J Microbiol Methods. 169, 105830(2020).
  25. Curti, L. A., et al. Evaluation of a lyophilized CRISPR-Cas12 assay for a ensitive, specific, and rapid detection of SARS-CoV-2. Viruses. 13 (3), 420(2021).
  26. Joung, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK one-pot testing. N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved