אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

Summary

מתוארת אסטרטגיית הכנת דגימה להדמיית עוברים מוקדמים של דגי זברה בתוך כוריון שלם באמצעות מיקרוסקופ יריעות אור. הוא מנתח את הכיוונים השונים שהעוברים רוכשים בתוך הכוריון בשלבי 70% אפיבולי וניצן ומפרט אסטרטגיות הדמיה להשגת רזולוציה בקנה מידה תאי בכל העובר באמצעות מערכת יריעות האור.

Abstract

מיקרוסקופ יריעות אור הפך למתודולוגיה המועדפת להדמיה חיה של עוברי דגי זברה על פני סקאלות זמן ארוכות עם רעילות פוטוטוקסית מינימלית. בפרט, מערכת multiview, המאפשרת סיבוב דגימה, מאפשרת הדמיה של עוברים שלמים מזוויות שונות. עם זאת, ברוב מפגשי ההדמיה עם מערכת multiview, הרכבת דגימות היא תהליך בעייתי מכיוון שהדגימות מוכנות בדרך כלל בצינור פולימרי. כדי לסייע בתהליך זה, פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיות הרכבה בסיסיות להדמיית התפתחות מוקדמת של דגי זברה בין 70% אפיבולי לשלבי סומיט מוקדמים. באופן ספציפי, המחקר מספק נתונים סטטיסטיים על התנוחות השונות שברירת המחדל של העוברים היא בשלבי אפיבולי וניצן של 70% בתוך הכוריון. יתר על כן, הוא דן במספר הזוויות האופטימלי ובמרווח בין הזוויות הדרוש להדמיית עוברים שלמים של דגי זברה בשלבים המוקדמים של ההתפתחות, כך שניתן יהיה לחלץ מידע בקנה מידה סלולרי על ידי איחוי התצוגות השונות. לבסוף, מכיוון שהעובר מכסה את כל שדה הראייה של המצלמה, הנדרש לקבלת רזולוציה בקנה מידה סלולרי, פרוטוקול זה מפרט את תהליך השימוש במידע חרוזים מעל או מתחת לעובר לצורך רישום התצוגות השונות.

Introduction

הבטחת רעילות אור מינימלית היא דרישה עיקרית להדמיית עוברים חיים ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה לתקופות ארוכות. במהלך העשור האחרון, מיקרוסקופ גיליון אור הפך למתודולוגיה הנבחרת כדי לענות על דרישה זו 1,2,3,4,5,6,7. בקצרה, בטכניקה זו ששימשה לראשונה בשנת 2004 ללכידת תהליכים התפתחותיים⁸, שתי יריעות לייזר דקות מיושרות עוברות דרך העובר מקצוות מנוגדים, ומאירות רק את מישור העניין. מטרת גילוי ממוקמת באופן אורתוגונלי, ולאחר מכן האור הפלואורסצנטי הנפלט מכל הנקודות המוארות בדגימה נאסף בו זמנית. לאחר מכן מתקבלת תמונה תלת-ממדית על ידי הזזת העובר ברצף דרך יריעת האור הסטטית.

בנוסף, בצורה ספציפית של מתודולוגיה זו, המכונה מיקרוסקופ יריעות אור מרובות, ניתן להשעות את הדגימות בצינור פולימרי שניתן לסובב באמצעות רוטור, המאפשר הדמיה של אותו עובר מזוויות^{מרובות 9,10,11}. לאחר ההדמיה, התמונות מזוויות מרובות מתמזגות בהתבסס על סמני רישום, שהם בדרך כלל סמנים פלואורסצנטיים כדוריים בתוך העובר (למשל, גרעינים) או בתוך הצינור (למשל, חרוזים פלואורסצנטיים). הדמיה ואיחוי Multiview משפרים באופן משמעותי את הרזולוציה הצירית, ומספקים רזולוציה איזוטרופית בכל שלושת הממדים¹². אמנם זהו יתרון גדול, אך אתגר מרכזי של מתודולוגיית ריבוי תצוגות הוא הרכבה של דגימות, שבה יש להרכיב עוברים ולשמור אותם במקומם בצינורות במהלך כל מהלך ההדמיה.

לצורך ביצוע הדמיה מרובת תצוגות, כדי לשמור על העוברים במקומם ולמנוע תנועה בזמן ההדמיה, ניתן להטמיע עוברים באגרוז. עם זאת, זה מוביל לעתים קרובות לצמיחה והתפתחות מזיקות, במיוחד עבור עוברים בשלב מוקדם של דגי זברה¹³, מערכת המודל שנדונה כאן. אסטרטגיית הרכבה שנייה היא להשתמש בצינור דק שהוא רק מעט גדול יותר מקוטר העובר, שבו ניתן למשוך את העובר לתוך הצינור יחד עם תווך העובר, ולאחר מכן לסגור את החלק התחתון של הצינור עם פקק אגרוז¹⁴. בשיטה זו, מכיוון שהצינור מלא בתווך עוברי, לא ניתן להשתמש בסמני רישום כגון חרוזים פלואורסצנטיים לאיחוי הדעות השונות, ולכן הרישום מסתמך על סמנים בתוך העובר. באופן כללי, חרוזים פועלים כסמני רישום טובים יותר כאשר האות של הסמנים בתוך העובר מתפרק עם המעבר עמוק יותר לתוך הדגימה בשל מגבלות הארה וגילוי של כל מיקרוסקופ.

לפיכך, גישה שלישית, שתפורט כאן ושימשה בעבר 5,13,14,15,16, היא הדמיה של עוברים מוקדמים של דגי זברה עם כוריון שלם ומילוי הצינורית באחוז מינימלי של אגרוז, המכיל חרוזים כסמני רישום. בתרחיש זה, מכיוון שהתערבות ידנית למיקום עוברים בתוך כוריון אינה אפשרית, מחקר זה מספק נתונים סטטיסטיים על כיוון ברירת המחדל אליו נופלים עוברים מוקדמים של דגי זברה, במיוחד תוך התמקדות ב-70% שלבי אפיבולי וניצן. לאחר מכן הוא דן במספר התצוגות האופטימלי הדרוש להדמיית עוברים בשלב מוקדם ברזולוציה בקנה מידה סלולרי ומפרט את תהליך האיחוי באמצעות BigStitcher, תוסף מבוסס פיג'י 10,17,18. יחד, פרוטוקול זה, המשתמש במטרה של 20x/1 NA, נועד להקל על אמבריולוגים של דגי זברה להשתמש במערכות יריעות אור מרובות עבור הדמיה של עוברים עם גרעינים וסמנים של ממברנות משלב הגסטרולציה ועד לשלבי הסומיט המוקדמים.

Protocol

הליכי התחזוקה והניסוי של דגי הזברה ששימשו במחקר זה אושרו על ידי ועדת האתיקה המוסדית של בעלי חיים, vide Reference TIFR/IAEC/2023-1 ו-TIFR/IAEC/2023-5. עוברים שהתקבלו על ידי חציית דגים הטרוזיגוטיים המבטאים Tg(actb2:GFP-Hsa.UTRN)¹⁹ הוזרקו עם H2A-mCherry mRNA (30 pg) בשלב התא האחד. H2A-mCherry mRNA סונתז באמצעות פלסמיד pCS2+ H2A-mCherry (מתנה ממעבדת אוטס, EPFL) על ידי שעתוק חוץ גופי . עוברים המבטאים את שני הסמנים, המכונים Utr-GFP ו-H2A-mCherry, בהתאמה, בשאר הפרוטוקול, צולמו בשלבי אפיבולי וניצן של 70%. פרטי הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת דגימה להדמיית multiview

1. הכנת צינורות FEP/PTFE
   1. נקו את צינורות FEP/PTFE בהתאם לנהלים שתוארו קודם לכן¹⁴.
   2. לאחר הניקוי, חתכו את הצינורות לאורכים של 2-2.5 ס"מ לפי הדרישה ואחסנו אותם בצינורות מיקרוצנטריפוגות 2 מ"ל המכילים מים מזוקקים כפולים. צינורות ניתן לאחסן באופן זה במשך כחודש.
   3. לפני הכנת הדגימה, חממו את הצינורות בטמפרטורה של 70-75 מעלות צלזיוס למשך כ-25 דקות כדי ליישר את הצינורות. הימנע מצפיפות יתר בכל צינור מיקרוצנטריפוגה כדי למנוע גושים, ולהבטיח מספיק מקום ליישור צינור יעיל.
      הערה: יש ללבוש כפפות במהלך כל הליך הטיפול בצינור, מכיוון שכל חלקיק טביעת אצבע/אבק שנותר על הצינורות עלול להפריע להדמיה.
2. הכנת אגרוז
   1. הכן פתרונות מלאי E3 buffer 50x באופן הבא:
      1. מלאי 1 - 3.252 גרם של Na₂HPO₄, 0.285 גרם של KH₂PO₄, 11.933 גרם של NaCl, 0.477 גרם של KCl ב 1 ליטר של מים deionized
      2. מלאי 2 - 2.426 גרם של CaCl₂, 4.067 גרם של MgSO₄ ב 1 ליטר של מים deionized.
   2. כדי ליצור חיץ E3 אחד, הוסף 20 מ"ל כל אחד מתמיסות מלאי 1 ו- 2 במים נטולי יונים, 960 מ"ל.
      הערה: אין להוסיף מתילן כחול במאגר E3 המשמש להדמיה, שכן הוא גורם לפיזור אור.
   3. יש להמיס אגרוז ב-1x E3 ב-1x E3 על ידי חימום ב-70-75°C על בלוק חום תוך ערבוב עד שהתמיסה מתבהרת ללא גושים או גבישים.
   4. להדמיה מרובת תצוגות, הוסף חרוזים פלואורסצנטיים הזמינים מסחרית (ראה טבלת חומרים) לתמיסת אגרוז, המאפשרת רישום תמונה במהלך הניתוח. סוניק את החרוזים בטמפרטורת החדר בתדר 40 קילוהרץ למשך 20-30 דקות באולטרסאונד אמבט מים כדי לפרק את החרוזים.
   5. לאחר סוניקציה, להוסיף 1 μL של חרוזים ל 10 מ"ל של תמיסת agarose בצינור 15 מ"ל ולסובב את הצינור היטב כדי להבטיח פיזור אחיד של החרוזים.
      הערה: נפח תמיסת החרוזים שיש להוסיף לאגרוז תלוי בתמיסת המלאי והיצרן. נסו מגוון נפחים ובחרו ריכוז שבו החרוזים נראים מפוזרים היטב כאשר הם מצולמים במערכת היריעות הבהירות. יותר מדי חרוזים יכולים להצטבר למרות הסוניק והמערבולות, בעוד שמעט מדי חרוזים יכולים להשפיע על רישום התמונה.
   6. שמור את צינור האגרוז עם חרוזים נוספים באמבט מים סגור נשמר ב 37 ° C לפחות 30 דקות לפני הכנת הדגימה. זה מבטיח כי הטמפרטורה של agarose יורד מ 70 °C (70 °F) ל 37 °C (77 °F).
3. הכנת דוגמאות
   1. מקמו את הדגים בזוגות עם חוצצים בערב שלפני יום ההדמיה. הסירו את החוצצים למשך כ-15 דקות ואספו עוברים בהליך^{סטנדרטי 20}.
   2. לאחר שהעוברים מגיעים לשלב העניין להכנת הדגימה, יוצקים את כל 10 מ"ל האגרוז (עם חרוזים) שנשמר ב 37 מעלות צלזיוס על צלחת פטרי 6 ס"מ.
   3. המתן כ 2-3 דקות כדי להביא את הטמפרטורה נמוכה מ 33 ° C לפני העברת 10 עד 15 עוברים לתמיסת agarose.
      הערה: זהו צעד חשוב למניעת כל הלם חום אפשרי לעוברים שהוחזרו לאגרוז.
   4. יש לוודא כי חיץ E3 קטן ככל האפשר מתווסף לתמיסת האגרוז בעת החזרת העוברים. מערבלים את צלחת הפטרי כך שהחיץ הקטן שהיה מועבר מתפזר היטב.
   5. ללבוש כפפות עבור שאר הליך הכנת המדגם.
   6. קחו מיקרופיפטה של 200 μL עם קצה פיפטה מתאים והכניסו צינור ישר ונקי שהוצא מצינור המיקרוצנטריפוגה לקצה הפיפטה כפי שמוצג באיור 1A,B.
   7. שאפו מעט אגרוז לתוך הצינור, ואחריו 2-3 עוברים באמצעות מיקרופיפטה (איור 1C,D). ודאו שהעוברים קרובים לתחתית הצינורית (איור 1E), דבר שיהפוך חשוב בעת יצירת ההדמיה. כמו כן, ודאו שיש מעט אגרוז בין העוברים השונים (איור 1E) כדי שחרוזים באזור הזה יוכלו לשמש כסמני רישום.
   8. מבלי לשחרר את הלחץ מהפיפטה, נתקו את הצינור מקצה הפיפטה, והניחו אותו על מכסה צלחת הפטרי המלאה ב-E3 כדי שהאגרוז יתמצק (איור 1F).
   9. חזור על שלבים 1.3.6 עד 1.3.8 עד שכל העוברים בצלחת הפטרי מועברים לצינורות.
   10. לאחר שהאגרוז התמצק (פעולה שיכולה להימשך 5-10 דקות וניתן לאשר אותה על-ידי בדיקת האגרוז בצלחת הפטרי), העבירו את הצינורות לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל מלא ב-E3 (איור 1G).
   11. אחסן את הצינורות עם העוברים באינקובטור של 28 ° C או 33 ° C, לפי הצורך, לפני שתמשיך להדמיה multiview.

2. הדמיה מרובת תצוגות

הערה: שלב זה מציג הליך כללי להדמיה מרובת תצוגות של עוברי דגי זברה בשלבי התפתחותם המוקדמים. ניתן להתאים בקלות את השיטה המפורטת להלן לכל מערכת מיקרוסקופיה של יריעות אור מרובות.

1. איתור העובר
   הערה: מלא את תא הדגימה של המיקרוסקופ בתווך העובר²⁰ והגדר את הטמפרטורה של תא הדגימה לטמפרטורה המעניינת לפחות 10 דקות לפני ההדמיה.
   1. להרכיב את מחזיק המדגם כפי שתואר קודם²¹, עם זאת, עם שינוי אחד. מאחר שההדמיה תתבצע דרך הצינור, הכניסו את הצינורית עם העוברים ישירות לנימים בקוטר הימני, כך שהיא מוחזקת במקומה מבלי לדחוף את האגרוז החוצה ולהפריע לעוברים בתחתית (איור 1H).
      הערה: מכיוון שלתא הדגימה יש גובה מוגדר, הקפדה על מיקום העוברים בתחתית הצינורית במהלך הכנת הדגימה (כאמור בשלב 1.3.7) תאפשר למקם את העובר בשדה הראייה מבלי לפגוע ברצפת החדר.
   2. הכנס את מחזיק הדגימה למערכת multiview והשתמש בפקדי x ו- y כדי להביא את העובר למרכז שדה הראייה.
   3. השתמש בבקרת z של נווט הדגימה כדי להביא את העובר למיקוד.
   4. בשלב זה, הכיוון של העובר בתוך הכוריון יהיה גלוי בבירור, ואם זה לא משביע רצון, להכניס צינור חדש ולבחור את העובר עם כיוון של עניין.
2. יישור היריעות הבהירות
   1. ברגע שהעובר נמצא במקומו, הגדר את כל הגדרות הניסוי - לייזרים, נתיב אור, מסנן, מפצל קרן ומצלמה.
   2. בעת הגדרת פרמטרי הרכישה, אם התוכנה מספקת אפשרות לסריקת ציר, בחר אותה. סריקת ציר תפחית את אפקט ההצללה העולה מגיליון האור כשהיא נתקלת במבנים או באזורים אטומים בדגימה.
   3. התחל סריקה חיה של הדגימה. הגדר את גודל הסיביות, עוצמת הלייזר והזום הרצוי, אשר יקבע את עובי גיליון האור, ומכאן, את הרזולוציה הצירית.
   4. כדי ליישר את היריעות הבהירות, עברו תחילה לתאורה חד-צדדית ושנו את ההגדרות של שתי יריעות האור (שמאל וימין) ברצף. התקרב דיגיטלית לאזור במדגם שבו נראים מבנים ברורים של עניין.
      הערה: במחקר זה, נעשה שימוש בסמן גרעיני (H2A-mCherry) או בממברנה (Utr-GFP) ליישור היריעות. מומלץ לשנות את הגדרות גיליון האור בתוכנה, כך שהניגודיות החדה ביותר של האות מושגת באזור העניין.
   5. לאחר ששתי היריעות הקלות ממוטבות בנפרד כדי להשיג את האות הטוב ביותר, הפעל את שתי היריעות הבהירות. בצע סבב שני של יישור וודא שההבהוב הוא מינימלי, מה שמצביע על יישור טוב למדי של שני היריעונות.
   6. לאחר סיום היישור, הפעל את האפשרות להתיך באופן אוטומטי את התמונות שנוצרו על ידי שני הגיליונות, אם התוכנה מתירה זאת. לחלופין, ניתן תחילה ליישר באופן גס את היריעות הבהירות על ידי התמקדות בחרוזים סביב הדגימה ולאחר מכן לכוונן את היישור באמצעות מידע מהדגימה.
      הערה: בעת הדמיה עם שני פלואורופורים (כגון סמנים גרעיניים וממברנה), היישור האופטימלי הוא בדרך כלל שונה באופן שולי עבור שני המבנים. בתרחיש זה, בחר הגדרה המבוססת על אילוצים על עיבוד במורד הזרם. לדוגמה, אם רוצים לפלח את גבולות התא, תהליך יחסית אינטנסיבי יותר של עיבוד, יישרו את היריעות הקלות בהתבסס על סמן הממברנה.
3. הגדרת הדמיה מרובת תצוגות
   1. לאחר יישור היריעות הבהירות, הפעל את האפשרויות לביצוע ערימת z וכן הדמיה מרובת תצוגות.
   2. התחל סריקה חיה ונווט באמצעות נווט הדגימה כדי לבחור את התצוגה הראשונה. בתצוגה זו, הגדר את מרווח הזמן לפרוסה, ואחריו את הפרוסה הראשונה והאחרונה של ערימת z. הוסף מיקום זה בתיבת הדו-שיח מרובת תצוגות, המציינת את המיקום ואת מידע מחסנית z עבור תצוגה זו.
   3. מעבר לתצוגה הבאה על-ידי שינוי הזווית בנווט הדגימות. הגדר את מחסנית z עבור התצוגה השניה והוסף את המידע בתיבת הדו-שיח מרובת תצוגות.
   4. חזור על אותו הדבר עבור תצוגות נוספות.
      הערה: ודא שמספר מינימלי מסוים של פרוסות מצולם בכל תצוגה, כך שתהיה חפיפה מספקת בין התצוגות השונות, דבר שיסייע בסופו של דבר ברישום התצוגות במהלך העיבוד. מספר הפרוסות המינימלי יהיה תלוי במקדם הזום וכן במספר הזוויות שנבחרו להדמיה.
   5. לאחר הגדרת כל התצוגות, שמור מידע זה בקובץ טקסט (שנקרא 'מיקומי עוברים', למשל), שיכיל מידע מחסנית z, (x, y, z) קואורדינטות של הצינור וכן מפרט של הזווית עבור כל תצוגה. לאחר השמירה, נקה את כל המיקומים מתיבת הדו-שיח ריבוי תצוגות.
   6. מכיוון שההדמיה נעשית עם כוריון שלם, שהוא גדול יחסית, לא ניתן לראות את החרוזים בצינור עם אותן הגדרות. לכן, מידע חרוזים צריך להיות נרכש ממיקום אחר בצינור. כדי לעשות זאת, לתרגם לקואורדינטת 'y' שונה הרחק מהעובר שבו חרוזים גלויים. הוסף מיקום זה לתיבת הדו-שיח מרובת התצוגות ושמור מיקום זה בקובץ טקסט (בשם 'beads-y', לדוגמה).
      הערה: דמיינו את החרוזים קרוב ככל האפשר לדגימת העובר על מנת למזער את ההשפעות של הבדלים אפשריים בעקמומיות הצינור בשני המקומות. לכן, אם עוברים מרובים מותקנים בצינור, חשוב להשאיר מעט אגרוז בין הצינורות כדי לצלם חרוזים (כאמור בשלב 1.3.7).
   7. עבור לתיקייה שבה נשמרים קבצי הטקסט ושכפל את הקובץ 'עמדות עוברים' לקובץ חדש בשם 'מיקומי חרוזים'. החלף את קואורדינטת y עבור כל התצוגות בקובץ 'מיקום חרוזים' בקואורדינטת y מהקובץ 'חרוזים-y'. זה יבטיח שהחרוזים יצולמו עם אותו מספר צפיות, ערימות z וקואורדינטות x אך במיקום y שונה בצינור.
   8. חזור לתוכנת ההדמיה וטען את קובץ 'מיקומי החרוזים' בתוכנה. אם האפשרות סידרת זמן מופעלת, בחר מחזור אחד והתחל את הניסוי. שמור תמונות חרוזים כ'חרוזים', שישמשו לרישום התצוגות השונות במהלך עיבוד התמונה.
   9. לאחר צילום תמונות החרוזים, נקה את המיקומים וטען את קובץ 'עמדות העובר' הראשוני בתוכנה. הגדר את מספר המחזורים הרצוי עם מרווח זמן מתאים והתחל את הניסוי.

3. ניתוח תמונה מרובת תצוגות

הערה: לאיחוי תמונות מרובות תצוגות, תוסף FIJI, BigStitcher, שהוא הגרסה האחרונה של תוסף Multiview Reconstruction, משמש 10,17,18. ניתן להתקין את התוסף על ידי הוספת תוסף BigStitcher בפונקציה 'ניהול אתרי עדכון', אליו ניתן לגשת באפשרות 'עדכון' תחת תפריט 'עזרה'. לאחר ההתקנה, התוסף יופיע תחת תפריט 'תוספים'. השלבים הרחבים הכרוכים באיחוי הם כדלקמן: (1) הגדר זוגות קבצים .xml/.h5 הן עבור החרוזים והן עבור העוברים; (2) לרשום את כל התצוגות בקובץ החרוזים; (3) פונקציית התפשטות נקודות חילוץ (PSF) עבור החרוזים, שיכולה לשמש לדקונבולוציה (איור 2A); (4) להעביר את פרטי הרישום וה-PSF מקובץ החרוזים לקובץ העובר ולהתחיל בפירוק רב-תצוגתי. רוב השלבים הללו תוארו בעבר בפירוט²¹, וכאן מתוארים השלבים המעובדים באופן שונה.

1. הגדרת מערך נתונים .xml
   1. הגדר מערך נתונים חדש הן עבור החרוזים והן עבור העובר כ- 'beads.xml' ו- 'embryo.xml', בהתאמה, כפי שתואר קודם לכן²¹.
2. איתור ורישום באמצעות נקודות עניין
   1. לאחר הייצוא המוצלח של קובץ beads.xml, בחר את התצוגות הדרושות לרישום בתיבת הדו-שיח Multiview Explorer (איור 2B). לחץ לחיצה ימנית ובחר זהה נקודות עניין. המשך בשלבים כמתואר²¹.
   2. לאחר זיהוי נקודות עניין, בחר את כל התצוגות, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר הירשם באמצעות נקודות עניין. בצע את הפרוטוקול כמתואר²¹.
   3. בדוק היטב אם רישום החרוזים עבד בהצלחה. לאחר רישום מוצלח, חרוזים חופפים מתצוגות שונות מקבלים על גבי (איור 2C). כדי לבדוק כיצד בדיוק פעלה ההתאמה, בחר שתי תצוגות רצופות, עבור לאזור החופף ועבור בין שתי התצוגות כדי לבחון אם החרוזים המצולמים מזוויות שונות מונחים על גבי מונחים. חזור על פעולה זו עבור כל תצוגה עוקבת.
   4. אם החפיפה אינה מדויקת, נסה שוב את הרישום על ידי הרפיית המשמעות הנדרשת לרישום ו / או השגיאה המקובלת של חפיפה (המכונה 'שגיאת RANSAC' בתיבת הדו-שיח 'רישום').
   5. לאחר הרשמה מוצלחת, לחץ על שמור בחלון 'Multiview Explorer' כדי לשמור את קובץ .xml המעודכן.
      הערה: שמור גם את קובץ יומן הרישום, מכיוון שהוא מכיל מידע מפורט נוסף על יעילות הרישום. כדי לתרגם את פרטי הרישום מהחרוזים לעובר, בצע את השלבים המתוארים להלן.
   6. פתח את קובץ bead.xml בעורך טקסט לפי בחירה והעתק את הבלוק כולו תחת "ViewRegistrations".
   7. פתח את embryo.xml והחלף את הבלוק "ViewRegistrations" בבלוק שהועתק מקובץ החרוזים. אם קיימים מספר ערוצים, החלף את פרטי הרישום עבור כל ערוץ כמפורט לעיל. ניתן להעביר את פרטי הרישום באופן ידני או באמצעות קוד MATLAB הכתוב בהתאמה אישית שניתן להוריד כאן: https://github.com/sundar07/Multiview_analysis
   8. פתח את הקובץ embryo.xml ב "BigStitcher" ולבדוק בזהירות אם הרישום עבד בהצלחה עבור העובר. חזור על אותו הדבר שנעשה עבור החרוזים, על ידי בדיקת החפיפה של מבנים מעניינים בכל שתי תצוגות עוקבות.
      הערה: לעיתים, רישום עוברים עשוי להיות פחות רצוי למרות שהחרוזים נרשמים בצורה מושלמת. זה אפשרי אם יש שינויים קלים בעקמומיות הצינור מהמיקום שבו החרוזים מצולמים למצב העובר. בנוסף, יכולות להיות תנועות עדינות של העובר בין ההשקפות כשהוא צף בחופשיות בתוך הכוריון. במקרה זה, לבצע סיבוב שני של רישום באמצעות סמן גרעיני בעובר.
   9. לשם כך, פתח את קובץ embryo.xml ב- "BigStitcher", לחץ לחיצה ימנית על כל התצוגות בעלות הסמן הגרעיני ובחר זהה נקודות עניין.
   10. שנה את שמות נקודות העניין ל'גרעינים' והמשך בשלבים כפי שבוצעו עבור חרוזים.
   11. בעת קביעת פרמטרים של "הפרש גאוסיאני", ודא כי רוב, אם לא כל, הגרעינים מזוהים וכי אין גילוי גרעיני חוץ רחמי. לאחר מכן, לחץ על סיום.
   12. לאחר מכן, רשום תצוגות אלה על-ידי בחירה באפשרות הירשם באמצעות נקודות עניין ובחר באפשרות מבוסס מתאר מדויק (תרגום משתנה). ודא שהאפשרות 'השווה את כל התצוגות ונקודות העניין' נבחרה והשתמש ב'גרעינים' כנקודות עניין. השתמש באפשרות לתיקון התצוגה הראשונה ואל תמפה לאחור.
   13. לרישום, השתמש במודל אפין עם רגולציה נוקשה ופרמטרי ברירת המחדל בתוסף.
   14. בדוק מחדש את הצלחת הרישום על ידי השוואה בין כל שתי צפיות רצופות.
   15. לאחר הרשמה מוצלחת, לחץ על שמור בחלון 'Multiview Explorer' כדי לשמור את קובץ .xml המעודכן.
   16. פתח את קובץ embryo.xml בעורך טקסט לפי בחירתך והעתק את פרטי הרישום מהסמנים הגרעיניים לערוצים האחרים.
3. חילוץ והקצאה של פונקציית התפשטות נקודתית
   1. כדי לבצע דה-קונבולוציה מרובת תצוגות, חלץ את PSF של מערכת ההדמיה מערכת הנתונים של החרוזים הרשומים והחל אותו על קובץ העובר.
   2. לקבלת מידע זה, בחרו בכל התצוגות בקובץ החרוזים ולאחר מכן לחצו לחיצה ימנית ובחרו אפשרויות ' פונקציות פריסה נקודתיות ' ו'חילוץ '.
   3. בתיבת הדו-שיח שמופיעה, ודא שהאפשרות השתמש בנקודות עניין תואמות והסרת הקרנות עוצמה מינימלית מ-PSF מסומנת, המשך עם גדלי PSF המוגדרים כברירת מחדל ולחץ על אישור.
      הערה: אם חילוץ PSF מוצלח עבור כל התצוגות, קובץ יומן הרישום יציג 'n/n PSF שחולצו'
   4. לאחר מכן, שמור מחדש את קובץ .xml. תופיע תיבת סימון מסומנת בעמודת PSF בתיבת הדו-שיח 'Multiview Explorer', ותיקיית 'psf' תיווצר בתיקייה המתאימה עם כל PSF שחולצו.
   5. פתחו את קובץ embryo.xml והקצו קובץ PSF לכל תצוגה בנפרד. לחץ לחיצה ימנית על "תצוגה" → לחץ על פונקציות כפולות נקודתיות → בחר הקצה → בחר מתקדם, ולאחר מכן הקצה PSF חדש לכל התצוגות שנבחרו. לחץ על עיון, עבור אל נתיב הקובץ .xml ופתח את תיקיית psf .
   6. בחר את PSF תואם עם מזהה המתאים בתצוגה שנבחרה ולחץ על אישור, ולאחר מכן תיבת הסימון PSF יופיע מסומן בחלון 'Multiview Explorer'.
   7. חזור על התהליך עבור כל התצוגות האחרות.
4. מיזוג ודה-קונבולוציה מרובי תצוגות
   1. לאחר הקצאת פונקציית כפולת הנקודות לכל התצוגות, לחץ לחיצה ימנית ובחר Multiview Deconvolution.
   2. בחר בתיבה התוחמת בתצוגות הנוכחיות שנבחרו. עבור עבודה זו, האצת OSEM ברירת המחדל ומספר האיטרציות פועלים היטב.
   3. בצע דגימת הפחתה של התמונות כנדרש אם נדרש חישוב מהיר יותר או אם זיכרון ה- CPU מוגבל.
      הערה: אם זיכרון ה-RAM הדרוש חורג מהזיכרון הקיים, תופיע הודעת שגיאת אזהרה בצבע אדום בתחתית החלון. אל תתחיל את deconvolution אם אזהרה זו צצה, כמו התוסף יתעכב ויפסיק להגיב בשלב כלשהו במהלך העיבוד.
   4. כדי להעריך את התקדמות deconvolution, בדוק את קובץ היומן, אשר יציג תוצאות כל 5 חזרות.
   5. כדי להגדיל את מהירות החישוב, בצע deconvolution multiview ב- GPU אם הותקן בעבר.
      הערה: בסוף תהליך זה, יופיע חלון תמונה מאוחה, שניתן לשמור כקובץ tiff.

תוצאות

כיוון הדגימה בצורה מדויקת הוא חלק חיוני בשימוש יעיל במיקרוסקופיה. עם זאת, כיוון ידני של דגימות אינו אפשרי לעתים קרובות בעת שימוש במערכת גיליון אור מרובה, בהתחשב בדרישה להכנת הדגימות בצינור. לכן, כדי לבדוק אם יש תנוחות סטריאוטיפיות שהעוברים תופסים בתוך הכוריון, עוברי דגי ...

Discussion

מיקום העובר בכיוון הנכון כדי לדמיין את אזור העניין הוא אחד השלבים המגבילים את הקצב שלעתים קרובות גורם לסשן מיקרוסקופיה כושל עבור המשתמש. הדבר נכון יותר במיקרוסקופ יריעות אור מרובות תצוגות, שם קשה לבצע מניפולציה ידנית של הכיוון מכיוון שהדגימות מוטמעות בתוך צינור. כדי לס?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414
Calcium Chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	12022
FIJI			Version: ImageJ 1.54f
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red, 0.5 μm mean particle size, aqueous suspension	Sigma-Aldrich	L3280
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	M2773
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit	ThermoFischer Scientific	AM1340	For in vitro transccription of H2A-mCherry plasmid
Potassium Chhloride	Sigma-Aldrich	P9541
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
PTFE Sleeving AWG 15L - 1.58 mm ID x 0.15 mm Wall +/-0.05	Adtech Innovations in Fluoroplastics	STW15	PTFE tubes
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	71640
Ultrasonic Cleaner	Labman	LMUC3	Ultrasonicator
Zeiss LightSheet 7 System	Zeiss