שיקוע רטוב של מחטי מיקרו-הזרקה תוך ניצול לחץ אוויר קבוע למשוב על פתיחת המחט

Summary

פרוטוקול זה מתאר הרכבה של מערכת פנאומטית להעברת אוויר בלחץ למחט במהלך תהליך שיקוע המחט. הפרוטוקול מתאר גם את תהליך השיקוע ליצירת מחטי מיקרו-הזרקה חדות וכיצד לאמוד את גודל הפתיחה היחסי של המחט.

Abstract

מחטי מיקרו-הזרקה הן כלי קריטי בהעברת ריאגנטים לשינוי גנום, רכיבי CRISPR (רנ"א מנחה, חלבון Cas9 ותבנית תורם), ורכיבי מערכת טרנספוזון (פלסמידים וטרנספוזאז mRNA) לעוברי חרקים מתפתחים. מחטי מיקרו-הזרקה חדות חשובות במיוחד במהלך הלידה של חומרים משנים אלה מכיוון שהן מסייעות למזער את הנזק לעובר המוזרק, ובכך להגדיל את הישרדותם של עוברים אלה בהשוואה להזרקה עם מחטים שאינן משופעות. יתר על כן, שיקוע המחטים מייצר מחטים עקביות יותר ממחט למחט בהשוואה למחטים הנפתחות על ידי שבירה אקראית של קצה המחט על ידי הברשה של קצה המחט כנגד חפץ (צד של כיסוי, פני השטח של העובר שיש להזריק וכו '). תהליך השיקוע הרטוב של מחטי מיקרו-הזרקה עם אוויר בלחץ קבוע המועבר למחט מאפשר לאדם המשופע את המחט לדעת מתי המחט פתוחה (נוכחות של בועות) וגם נותן אינדיקציה יחסית לגודל פתח המחט שנוצר. ניתן לקבוע את גודל הפתח היחסי במחט על ידי התאמת לחץ האוויר המועבר למחט עד להשגת שיווי משקל ובועות מפסיקות לזרום מקצה המחט. ככל שהלחץ שבו מגיעים לשיווי המשקל נמוך יותר, כך גודל המחט גדול יותר; ולהפך, ככל שהלחץ גבוה יותר, כך גודל המחט קטן יותר.

Introduction

שינוי גנטי של חרקים הוא תהליך שפותח במקור בדרוזופילה על ידי רובין וספרדלינג, ובמהלך השנים תהליך זה שונה ליצירת שינויים גנטיים במינים אחרים¹. התהליך מסתמך על מסירה מדויקת של רכיבי שינוי המוזרקים במיקרו לעוברים בחלון זמן ומיקום מסוים בתוך העובר ^{המתפתח 2,3,4}. מחטי מיקרו-הזרקה חדות הן כלי קריטי בתהליך השינוי הגנטי של חרקים מסוימים, כגון יתושים 4,5,6,7,8,9 וזבובי חול¹⁰, בעוד שהן פחות קריטיות עבור חרקים אחרים, כגון תולעי משי¹¹. מחטים חדות הן לעתים קרובות גורם מפתח בין הצלחה לכישלון כאשר מנסים ליצור חרק מהונדס גנטית ^2,4. בדרך כלל, מחטי זכוכית מיקרו-קפילריות נמשכות על ידי חימום זכוכית עד לנקודה שבה הזכוכית הופכת אלסטית, מה שמאפשר למשוך את הנימים לתוך מחט קצה סגורה מחודדת. לפני שניתן להשתמש במחט יש לפתוח אותה באופן שיוצר קצה חד להזרקה. באופן מסורתי, מחטים נפתחות על ידי צחצוח קצה המחט בעדינות כנגד משהו (קצה המגלשה / הכיסוי, או העובר, וכו ') שגורם כמות קטנה של זכוכית להתנתק מן הקצה, באופן אקראי יצירת קצה חד ^2,3. תהליך קצת פחות אקראי הוא שיפוע יבש, שבו המחט יורדת במהירות על פלטה שטוחה אופטית, מסתובבת שוחקת לפרק זמן קצר, מה שגורם לכמות קטנה של זכוכית להישבר מקצה המחט וליצור קצה חד. שיקוע יבש הוא קצת פחות אקראי מאשר צחצוח קצה המחט כנגד משהו. הפרוטוקול המתואר להלן לוקח את תהליך השיקוע צעד אחד קדימה על ידי אספקת אוויר דחוס למחט המשופעת ושיקוע אותה מתחת לשכבה נוזלית כך שבועות גלויות ברגע שהמחט נפתחה. פרוטוקול זה מפרט שיטה לייצור מחטי מיקרו-הזרקה חדות באופן אמין. שיקוע מתחת לשכבה נוזלית מהווה שיפור לעומת שבירה אקראית של המחט כפי שתואר לעיל, ושיקוע יבש מכיוון שהמשתמש מקבל משוב על תהליך השיקוע, המאפשר לאדם המשופע לדעת מתי המחט פתוחה ויחסית מה גודל פתח המחט. ידיעת גודל הפתיחה היחסי של קצה המחט יכולה לאפשר לאדם המשופע ליצור מחטים עם גדלי פתיחה שונים. לגדלים שונים של פתיחת מחטים יש יתרונות שונים; לדוגמה, גדלי פתיחת מחטים גדולים יותר יכולים להכיל תערובות הזרקה בעלות צמיגות גבוהה, בעוד שמחטי פתיחה קטנות יותר גורמות פחות נזק לעובר המוזרק.

האוויר מסופק למחט באמצעות וסת ומערכת צינורות אורתן המבוססת על מערכת הזרקה מווסתת לחץ אוויר שונה². בעוד האוויר מסופק למחט בלחץ קבוע, המחט משופעת מתחת לשכבת נוזל. תהליך השיקוע מורכב מתהליך חוזר בן חמישה שלבים: 1) הורדת המחט למשטח השוחק, 2) מתן אפשרות למחט להתקע לפרק זמן קצר, 3) הרמת המחט הרחק מהצלחת השוחקת תוך שמירתה מתחת לפני השטח של שכבת הנוזל, 4) עצירת הסחרור של הצלחת השוחקת כדי לבדוק את הופעת הבועות. אם אין בועות, שלבים 1 עד 4 חוזרים על עצמם עד להופעת בועות; 5) ברגע שיש בועות, ניתן לכוונן את לחץ האוויר כדי לקבוע את גודל הפתיחה היחסי של המחט. ככל שהלחץ הדרוש לעצירת היווצרות הבועות נמוך יותר, כך הפתח בקצה המחט גדול יותר.

Protocol

הערה: הפרוטוקול כמתואר להלן משתמש במיקרו-נימי Sutter BV-10 משופע. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות שונה לשימוש עם כל מודל microcapillary משופע.

1. הרכבה של ווסת, מד לחץ וצינורות אספקת אוויר

1. חותכים קטע של צינורות אורתן לחיבור מאספקת האוויר לבסיס הרגולטור (R; סעיף 1, איור 1). אורכו של סעיף זה יהיה תלוי במרחק מאספקת האוויר לרגולטור, אשר ימוקם ליד המשופע.
2. החלק מהדק צינור על צינור השופכן, ולאחר מכן דחף מחבר צינור לקצה הצינור. ודא שמחבר הצינור הוכנס במלואו על-ידי הצבת מחבר הצינור על משטח קשיח. בעת החזקת הצינור קרוב למחבר הצינור, לחץ את הצינור בחוזקה לתוך הצינור עד להחדרת מחבר הצינור במלואו. יחד, מהדק הצינור ומחבר הצינור יוצרים את החיבור HC (איור 1).
3. החלק את מהדק הצינור כלפי מעלה לקצה הצינור שבו מוכנס מחבר הצינור. סובב את מהדק הצינור מעל קצה המוט שהוכנס כך שייצור חיבור אטום.
4. הברג את מחבר הצינור לבסיס הרגולטור (R) ביד, ולאחר מכן סיים להדק את החיבור באמצעות מפתח ברגים קטן. ודא שהחיבור אטום אך אינו הדוק מדי.
5. ביציאה הצדדית של הרגולטור, הברג מחבר T (T) ביד, ולאחר מכן השתמש במפתח ברגים קטן כדי לסיים את ההידוק.
6. חתכו חתיכה קטנה של צינור אורתן (איור 1, סעיף 2), באורך של כ-3-5 ס"מ. הניחו שני מהדקי צינור על חתיכת הצינור, ואז הכניסו מחבר צינור לכל קצה של הצינור וסיימו את החיבורים (HC) כמתואר בשלבים 1.2-1.4 עבור כל קצה של הצינור.
7. הברג קצה אחד של הצינור הקצר לבסיס מד הלחץ, ולאחר מכן סיים את ההידוק עם מפתח ברגים כמו בשלב 1.5.
8. הברג את הקצה השני של הצינור הקצר לאחת היציאות במחבר T (T) המחובר לווסת בשלב 1.5.
9. חתכו קטע של צינור אורתן (איור 1, סעיף 3) לחיבור בין הרגולטור למחזיק המחט (NH). גודלו של סעיף זה יהיה תלוי במרחק מן שיפוע למיקום של הרגולטור.
10. הנח מהדק צינור על קטע הצינור ולאחר מכן הכנס מחבר צינור כמתואר בשלבים 1.2-1.4.
11. בצד השני של חלק זה של צינורות, מקם את מחבר הלואר הנשי (LC) המסופק עם מחזיק המחט (NH).
12. הסירו את מהדק התמך ואת מכונת הניילון (איור 2, f) מהמניפולטור. מהדק התמך ומכונת הכביסה נועדו להחזיק מיקרו-נימי זכוכית בלבד, הם אינם מיועדים להחזיק את המשקל הנוסף של מחזיק מיקרו-נימי, מוט מושחל וצינור אספקת אוויר.
13. חותכים פיסה מלבנית של יריעת אריזת גומי בגודל 1.5 ס"מ x 2 ס"מ כדי לעטוף את המוט המושחל במהדק פנדר האופניים. זה יעזור להחזיק את המוט המושחל ומחזיק המחט בצורה בטוחה יותר במהדק פנדר האופניים. בעזרת שתי צבת אף מחט, פותחים את תפס האופניים ומקפלים את פיסת אריזת הגומי המלבנית מעל המוט המושחל 3.5 ס"מ מקצה אחד של המוט כך שהוא יוצר U מעל המוט. הכנס את המוט המושחל המכוסה ביריעות גומי למהדק פנדר האופניים הפתוח והשתמש בצבת כדי לסגור את המהדק סביב המוט ויריעת הגומי. התקן את מהדק האופניים ומכלול מוטות הברגה על בורג המניפולטור, החלף את מהדק התמך ללא מכונת הכביסה מניילון, והדק את מהדק התמך עד שהוא מחזיק היטב את מכלול מוט ההברגה.
14. השחילו את מחזיק המחט על מוט ההברגה. ודא שמחבר הלואר מסתיים במיקום שלא יקשור את צינור השופכן כאשר הוא מחובר (איור 2, g).
15. חברו את מחבר הלואר הנקבי למחבר הלואר הזכרי (איור 2, g) של מחזיק המחט (איור 2, d).
16. חבר את הקצה החופשי של איור 1, צינור קטע 1 לאספקת האוויר (חיבור זה ישתנה בהתאם לאספקת האוויר שבה נעשה שימוש). אספקת האוויר צריכה להיות נקייה, אוויר יבש וללא שאריות שמן. אספקת האוויר יכולה להיות ממקור אוויר ביתי או גליל גז, אוויר דחוס או חנקן.

2. מחטי בורוסיליקט משופעות

1. משוך מחטי מיקרו-הזרקה באמצעות נימי מיקרו זכוכית בורוסיליקט עם ההגדרות הבאות במכשיר: חום: 305, Fil: 4, Vel: 70, Del: 235, Pul: 160, עם זמן לולאה של 12.24.
2. הרכיבו את מכלול השחזה בהתאם להוראות היצרן, המורכב מהצלחת השוחקת וטבעת התמך עם מגנטים¹².
   הערה: ייתכן שיהיה צורך לעטוף את הצלחת השוחקת ברצועה דקה של סרט שקוף כדי למנוע דליפה מוקדמת של פוטו-פלו (חומר הרטבה) מהצלחת השוחקת. זה נחוץ רק אם תמיסת חומר ההרטבה דולפת בטרם עת לתוך שמן הדום, מה שגורם לצלחת הטחינה להפסיק להסתובב. חומר ההרטבה מפחית את הסיכון לסימני ייבוש על מחטי הזכוכית לאחר שיקוע. השימוש בחומר הרטבה אינו קריטי לתהליך השיקוע, וניתן להחליף מים.
3. יש להניח 10 טיפות שמן על המשטח האופטי השטוח של הכן ולהניח עליו את מכלול הטחינה. התחל את מכלול השחזה.
4. הפעל את מקור האור כדי להאיר את פני השטח. ודא שמקור האור ממוקם מאחורי המשופע ומאיר בזווית של 45° לצלחת ולמחט השוחקות. זווית ההארה נחוצה כך שניתן יהיה לראות בקלות צל של המחט. בהגדלה של פי 90, סובבו את ראש המיקרוסקופ למקומו. עצרו לרגע את סיבוב הצלחת השוחקת ומקדו את המיקרוסקופ על פני השטח של הצלחת השוחקת.
5. הוסיפו לפתיל חומר הרטבה 1% עד שהפתיל רטוב לחלוטין. הוסיפו חומר הרטבה 1% לפני השטח של הצלחת השוחקת. יש לוודא שחומר ההרטבה מכסה את המשטח השוחק אך אינו דולף לטבעת התמך השחורה.
6. הניחו את הפתיל הרטוב מראש על פני הצלחת השוחקת בזמן שהיא מסתובבת. ודא שהפתיל נמצא בצד שמאל של הצלחת השוחקת (כשאתה מסתכל למטה מלמעלה) ונמתח משעה 11 עד 6 (עם הצלחת כפני שעון). ודא שהפתיל אינו רוכב על החלק השחור של טבעת התומך.
7. הכניסו מחט למחזיק המחט (איור 2, d) והדקו את טבעת התמך כדי להחזיק את המחט במקומה. פתחו את הרגולטור (איור 1, R) והגבירו את הלחץ ל-24 psi.
8. הרימו את מחזיק המחט על-ידי סיבוב ידית כוונון המסלול (איור 2, א) ודאו שהמחט מוגבהת מספיק גבוה כך שהיא גבוהה יותר מפני השטח של הצלחת השוחקת המסתובבת, ואז סובבו את כל המניפולטור כך שהמחט תתנדנד למקומה מעל הצלחת השוחקת המסתובבת. המחט שיש לשקוע צריכה להיות ממוקמת על הצלחת השוחקת המסתובבת כך שסיבוב הצלחת יתרחק מקצה המחט (איור 3A)
9. בהתבוננות מהצד, השתמשו בידית הכוונון הגסה (איור 2, a) כדי להוריד את המחט לכיוון משטח הצלחת השוחק. עצור כאשר המחט כמעט נוגעת בפני השטח של הנוזל.
10. השתמש בזום כדי להקטין את ההגדלה של המיקרוסקופ, ולאחר מכן הזז את המיקרוסקופ כך שהמחט תהיה במרכז שדה הראייה. ברגע במרכז הראייה, להגדיל את ההגדלה, התאמת המיקום של מניפולטור כך קצה המחט נשאר במרכז הראייה. פעם אחת בהגדלה מקסימלית, עצרו את צלחת השחזה ומקדו את המיקרוסקופ על פני השטח של הצלחת השוחקת, ואז מיד הפעילו מחדש את סיבוב הצלחת ברגע שהמשטח נמצא בפוקוס. ייתכן שהמחט אינה נראית לעין בשלב זה.
11. באמצעות ידית הכוונון הגסה של המניפולטור, הורידו את המחט לכיוון הצלחת השוחקת. בשדה הראייה, תמונה של המחט וצל (ים) של המחט יהיה גלוי. כאשר המחט והצל של המחט קרובים למגע, עברו לידית הכוונון העדינה של המניפולטור והמשיכו להוריד את המחט עד שנראה שהמחט והצללים שלה נוגעים. בשלב זה, קראו את הקליפר (איור 2, c) ושימו לב לקריאה. פני השטח של הלוח השוחק נמצאים בקריאת קליפר זו או מתחתיה.
    הערה: קשה לראות מתי המחט נוגעת בפני השטח של הצלחת השוחקת המסתובבת, כך שייתכן שהמחט לא נוגעת בצלחת השוחקת בשלב זה.
12. אפשר למחט להישאר ברמה זו של קריאת קליפר במשך 5-10 שניות.
13. באמצעות ידית הכוונון העדינה של המניפולטור, הרימו את המחט, וודאו שהיא נשארת מתחת לפני השטח של חומר ההרטבה. עצור את סיבוב הצלחת השוחקת למשך מספר שניות והתבונן אם בועות בורחות מקצה המחט. אם קיימות בועות, המשך לשלב 2.15. אם לא קיימות בועות, המשך לשלב 2.14.
14. החזירו את המחט לקריאת הקליפר באמצעות ידית הכוונון העדין של המניפולטור, ואז הזיזו אותה מעט נמוך יותר ובצעו קריאת קליפר חדשה, ואז חזרו על שלבים 2.12-2.13.
15. הפעל שוב את הצלחת השוחקת כדי לראות אם ניתן להבחין בהיווצרות בועות בזמן שהצלחת מסתובבת. אם עדות להיווצרות בועות נראית לעין במהלך סיבוב הצלחת, סביר להניח שפתח קצה המחט גדול מדי עבור מיקרו-הזרקות רגישות של עוברים, כגון זריקות עובר יתוש. אם היווצרות הבועות אינה נראית לעין במהלך סיבוב צלחת שוחקת, פתח המחט אידיאלי לשימוש בהליכים הדורשים מחט פתיחה חדה וקטנה.
16. השתמש בידית ההתאמה של מסלול המניפולטור כדי להרים את המחט מעל הצלחת השוחקת למצב גבוה מספיק מעל הצלחת כך שהמחט לא תפגע בשום דבר מכיוון שכל המניפולטור מסובב כדי להרחיק את המחט מהצלחת השוחקת והמיקרוסקופ.
17. ברגע שהמחט נמצאת במצב שבו ניתן להסיר אותה מבלי לפגוע בשום דבר, מורידים את לחץ האוויר לאפס, מוציאים את המחט ומניחים אותה בקופסת אחסון מחטים (צלחת פטרי עם סרט דבק כפול או חימר דוגמנות שיחזיק את המחטים המשופעות) עד לשימוש.

3. קביעת גודל הפתיחה היחסי של המחט המשופעת

הערה: קביעת גודל הפתיחה היחסי של המחט המשופעת נעשית בשלב 2.13. השלבים הבאים מתארים תהליך זה עוד יותר.

1. ברגע שנצפו בועות בשלב 2.13, כאשר הצלחת השוחקת אינה מסתובבת, הפחיתו לאט את לחץ האוויר על-ידי סיבוב ידית הכוונון של הווסת (איור 1, R) עד שהבועות יפסיקו לזרום מקצה המחט. שימו לב ללחץ שבו בועות מפסיקות לזרום מהקצה.
2. הגדל את לחץ האוויר עד שבועות זורמות שוב מקצה המחט. ככל שהלחץ גבוה יותר, כך פתח המחט קטן יותר.
3. המשך עם הזזת המחט למצב שבו ניתן להסיר אותה בבטחה שלבים 2.16-2.17.

תוצאות

ההליך המתואר לעיל מייצר מחטי מיקרו-הזרקה חדות באופן עקבי. מחטים חדות מאופיינות בכך שהן מסוגלות להחדיר לעוברי חרקים כוריון רכים, כגון עוברי יתושים, עם התנגדות מועטה או ללא התנגדות מקרום העובר. כאשר עוברים של יתושים מוזרקים במיקרו לצורך שינוי גנטי, קרום העובר אלסטי יחסית. ?...

Discussion

שינוי גנטי של יתושים מסתמך על מיקרו-הזרקה מדויקת של חומרי השינוי (פלסמידים, רנ"א מנחה או חלבונים) לעוברים קדם-בלסטודרם 3,4,5,6,7,8. קריטיות לתהליך זה הן מחטים חדות המנק...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mm O.D. microcapillaries	World Precision Instruments
Beveler pedestal oil	Sutter Instruments	008
Bicycle fender clip	VeloOrange	R-clip 4-pack	https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack
Boom Stand Microscope	AmScope		AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Stereo Microscope or equivalent
BV-10 Beveler	Sutter Instruments	BV-10
Diamond abrasive plate	Sutter Instruments	104F	Diamond abrasive plate - extra fine (0.2 µ to 1.0 µ tip sizes)
Gasket, Buna-N	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	11761-2-pkg	Used to seal connection on T  or L connectors, if not already included with these pieces
Hose Clamp	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	5000-2-pkg
Hose connector	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	CT4-pkg	Need 5 hose connectors
Microinjection Needle Holder	World Precision Instruments	MPH3-10	Needle holder for 1mm outer diameter microcapillaries
P-2000	Sutter Instruments		Any needle puller
Photo-Flo 200 Solution	B&H Photo, Video and Audio	BH #KOPF200P  MFR #1464510	wetting agent
Pressure Gauge	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	PG-100	0-100 psi gauge
Reference wick	Sutter Instruments	X050300
Reference wick holder	Sutter Instruments	M100019
Regulator	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	01-Mar	Need #10-32 ports for connections
Rubber Packing Sheet 6 inx 6 in	Danco	Model # 59849
T fitting	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	15002-2-pkg
Threaded Bar			Either a threaded rod or bar with threaded end. Threads must be 10-32.
Urethane tubing	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	URH1-0804-BLT-050