גידול ביופילם פולימיקרוביאלי רלוונטי לסיסטיק פיברוזיס כדי לחקור פנוטיפים קהילתיים

Summary

פרוטוקול זה מתאר מודל ביופילם פולימיקרוביאלי רלוונטי לארבעה מינים של סיסטיק פיברוזיס (CF), שניתן להשתמש בו כדי לחקור את ההשפעה של אינטראקציות בין מינים חיידקיים.

Abstract

רוב המודלים במבחנה חסרים את היכולת לחקור באופן מלא פנוטיפים חיידקיים הנובעים מהאינטראקציות המורכבות שנצפו בסביבות בחיים האמיתיים. זה נכון במיוחד בהקשר של זיהומים קשים לטיפול, כרוניים ופולימיקרוביאליים מבוססי ביופילם שזוהו בדרכי הנשימה של אנשים החיים עם סיסטיק פיברוזיס (CF), מחלה גנטית מרובת איברים. בעוד שמחקרי מיקרוביום רבים הגדירו את ההרכבים המיקרוביאליים שזוהו בדרכי הנשימה של אנשים עם CF (pwCF), אף מודל במבחנה עד כה לא שילב באופן מלא תכונות ריאה קריטיות הרלוונטיות ל-CF. לכן, קיים פער ידע משמעותי ביכולת לחקור את המנגנונים המניעים את הפתוגנזה של זיהומי ריאות מסוג CF ממינים מעורבים. במאמר זה אנו מתארים מודל של קהילה מיקרוביאלית של ארבעה מינים שפותח לאחרונה, כולל Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguinis ו-Prevotella melaninogenica הגדלים בתנאים דמויי CF. באמצעות שימוש במערכת זו, פנוטיפים רלוונטיים מבחינה קלינית כגון סרבנות מיקרוביאלית של מספר פתוגנים נצפו ונחקרו ברמה המולקולרית. התועלת של מודל זה במבחנה טמונה בזרימת העבודה הסטנדרטית שלו שיכולה להקל על המחקר של אינטראקציות בין מינים בהקשר של דלקות ריאה כרוניות של CF.

Introduction

אסטרטגיות שמטרתן לחסל חיידקים גורמי מחלות כמו אלה שזוהו בדרכי הנשימה של סיסטיק פיברוזיס (CF), מחלה גנטית מרובת איברים, נכשלות לעתים קרובות¹. כלומר, נוכחותן של קהילות מיקרוביאליות עמידות דמויות ביופילם הגדלות בסביבת ריאות CF עשירה בריר עלולה לגרום לזיהומים כרוניים הנפרשים על פני עשורים רבים². יתר על כן, למרות שהשימוש במיקרוביאלים בקו הראשון (Abx) ומודולטורים הביא לתוצאות משופרות אצל אנשים עם CF (pwCF), הגישה הקלינית "באג אחד, זיהום אחד" המיושמת בדרך כלל נגד פתוגנים קנוניים של CF כגון Pseudomonas aeruginosa ו- Staphylococcus aureus לא הייתה יעילה בפתרון זיהומים קשים לטיפול שזוהו בריאות של אנשים אלה ^{3,4, 5,6,7}.

במהלך שני העשורים האחרונים, מחקרים רבים שינו את ההבנה שלנו לגבי מחלת ריאות כרונית של CF⁸. כלומר, דיווחים מצביעים על כך שזיהומים המתגלים בדרכי הנשימה של pwCF אינם נגרמים אך ורק על ידי פתוגן יחיד אלא הם רב-מיקרוביאליים בטבע⁸. יתר על כן, למרות שהפתוגנזה של זיהומי ריאות מסוג CF ממינים מעורבים עדיין אינה מובנת היטב, ראיות קליניות מראות כי pwCF הנגועים יחד הן ב- S. aureus והן ב- P. aeruginosa בדרכי הנשימה שלהם החמירו את תפקוד הריאות מאשר אנשים שהתיישבו על ידי אחד משני פתוגנים אלה⁹.

אינטראקציות בין מינים בין פתוגנים של CF משוערות כסיבה לכך שזיהומים רב-מיקרוביאליים מבוססי ביופילם אינם מוגרים בקלות באמצעות שימוש בטיפולי CF, ובסופו של דבר משפיעים על תוצאות המטופלים³. לתמיכה בכך, מחקרי מבחנה הראו כי אינטראקציות בין חיידקים כגון P. aeruginosa, S. aureus ואחרים יכולות להשפיע על פנוטיפים רלוונטיים מבחינה קלינית כגון תגובת Abx לתרופות CF בקו הראשון, כולל ונקומיצין וטוברמיצין ^6,10,11. לכן, עדיין יש לבחון מחדש את אסטרטגיות הטיפול הנוכחיות שמטרתן למגר פתוגנים של CF בהקשר של זיהומים ממינים מעורבים.

תקן הזהב בניהול זיהומי ריאות CF מבוססי חיידקים מסתמך במידה רבה על השימוש בבדיקות רגישות מיקרוביאליות (AST) כדי להנחות התערבויות קליניות¹². עם זאת, AST נעשה בדרך כלל באמצעות מונוקולטורות חיידקיות הגדלות בתרביות עשירות ומעורבות היטב, אשר אינן משקפות את תנאי הגידול המיקרוביאליים שזוהו בדרכי הנשימה של CF ^3,13. בהתחשב בנתק המשמעותי בין תוצאות המטופלים לבין הצלחת הטיפול, דוחות קליניים תומכים כעת בפיתוח גישות חדשניות המשלבות תכונות קריטיות של ריאה CF^12,14.

מחקרים מעטים פיתחו מערכות מבחנה חיידקיות רלוונטיות ל-CF המכילות יותר משני פתוגנים ^15,16. עם זאת, מודלים אלה (1) אינם משקפים לחלוטין את האופי הפולימיקרוביאלי ודמוי הביופילם של ריאת CF ו-(2) אינם משתמשים בתנאים תזונתיים וסביבתיים הקרובים לאלה שזוהו בנתיב האוויר^{CF 15,16}. באמצעות כרייה של מערכי נתונים גדולים של 16S rRNA שמקורם ב-CF-ריאה וחישוב, ז'אן-פייר ועמיתיו פיתחו לאחרונה מודל תרבית משותפת במבחנה המשלב את התכונות הנ"ל¹⁰. מערכת זו כוללת P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. ו- Prevotella spp. גדל בתנאים דמויי דרכי נשימה CF ויציב עד 14 יום. המחברים דיווחו גם על צמיחה ספציפית לקהילה של Prevotella spp. וכמה שינויים בתגובת Abx של פתוגנים CF אלה באמצעות מנגנונים שנותרו לזיהוי¹⁰. מערכת מבחנה זו הציעה גם את האפשרות להתעמק בשאלות ממוקדות מכניסטית הקשורות לסרבנות Abx של גרסה נפוצה של P. aeruginosa המתגלה לעתים קרובות בדרכי הנשימה של pwCF¹⁰. לכן, מטרת פרוטוקול זה היא לספק לקהילת המחקר של CF זרימת עבודה ניסיונית סטנדרטית לגידול ביופילם במבחנה שיש לו פוטנציאל להתרחב עוד יותר כדי להתמודד עם מספר שאלות רלוונטיות ל-CF.

Protocol

הפרטים של כל הריאגנטים והציוד מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת מדיום כיח מלאכותי

הערה: לאורך פרוטוקול זה, מדיום כיח מלאכותי (ASM) מוגדר כמדיום הרלוונטי ל-CF שונה מ-SCFM2, שפורסם בעבר על ידי טרנר ועמיתיו¹⁷. להלן תיאור השלבים להכנת מדיום זה. ראה טבלת חומרים להכנת פתרונות מלאי ותנאי אחסון. גרסה זו של ASM שונה מטרנר ^{ואחרים,17} מכיוון שקיבולת האגירה בגרסה המקורית אינה מאפשרת pH יציב לאורך זמן. כלומר, פעילות התסיסה המבוצעת על ידי סטרפטוקוקוס spp. ואנאירובים כמו Prevotella spp. גורמת להחמצה של מדיום הגידול (תצפיות שלא פורסמו). לכן, ריכוז 3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS) הותאם מ-10 mM ל-100 mM.

הערה: הכנת תמיסת מלאי 2x ASM base (ASMb) מאפשרת הוספה של רכיבים כגון מוצין, אגר, מים וכו ', מבלי להשפיע על הריכוז הסופי של מולקולות הקיימות ב- ASM^10,18. ניתן להכין מראש את 2x ASMb ולאחסן ב 4 ° C למשך עד שבועיים במקום חשוך. אם המדיום הופך צהוב, להשליך.

1. כדי להכין 2x ASM בסיס מלא, בתוך נקייה המכילה 400 מ"ל של diH₂O, להוסיף את הדברים הבאים תוך כדי ערבוב:
   1. הוסף 6.50 מ"ל של 0.2 מ 'NaH₂PO₄. H₂O מלאי; 6.25 מ"ל של מניית 0.2 M Na₂HPO₄ ; 348 μL של 1 M KNO₃ מניה; 1.084 מ"ל של מניית 0.25 M K₂SO₄ .
   2. להוסיף 4.0 גרם של שמרים נשירה סינתטית ללא טריפטופן; 3.032 גרם של NaCl; 20.92 גרם של MOPS; 1.116 גרם של KCl ו- 0.124 גרם של NH₄Cl.
   3. הוסף 9.30 מ"ל של 1 M L-חומצה לקטית ציר; 2.70 מ"ל של מלאי גלוקוז 1.1 מ '; 1.75 מ"ל של 1 M CaCl 2.2H ₂O מניה; 1.20 מ"ל של מלאי N-אצטילגלוקוזאמין 0.25 מ"ל ו-1.00 מ"ל של מלאי FeSO_{4.7H 2}O של 3.6 מילימול.
   4. הוסף 660 μL של מלאי טריפטופן 0.1 M; 606 μL של 1 M MgCl_{2.6H 2}O מלאי; 0.60 גרם של חומצה deoxyribonucleic מזרע הרינג; 400 μL של 250 מ"ג/מ"ל 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) מלאי.
   5. לאחר הוספת כל הרכיבים, התאם את ה- pH ל- 6.80 עם מלאי NaOH של 5 M. השלם עד 500 מ"ל עם diH₂O. יש לעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר, ולאחסן ב-4°C.
2. להכנת ציר מוצין במינון 10 מ"ג/מ"ל (2x), השתמשו בבקבוק זכוכית נקי המכיל 250 מ"ל של diH₂O ותוך כדי ערבוב:
   1. הוסף 5.0 גרם של mucin מן הבטן חזיר - סוג II. מערבבים את המתלים במשך 10 דקות. השלם עד 500 מ"ל עם diH₂O.
   2. יש לעקר על ידי autoclaving ב 121 ° C במשך 15 דקות. יש לשמור על טמפרטורה של 4°C עד לניצול.
3. להקים מחדש את ASM.
   הערה: שלב זה צריך להתבצע ביום הניסוי.
   1. ערבבו יחס נפח של 1:1 בין מלאי ASMb 2x לבין מלאי מוצין 10 מ"ג/מ"ל.
   2. יש לערבב היטב לפני השימוש.

2. הכנת מדיה סלקטיבית קהילתית רב-מיקרוביאלית

הערה: להלן הכמויות הדרושות להכנת נפח של 1 ליטר מדיה.

1. להכנת אגר מלח מניטול (MSA) ואגר בידוד פסאודומונס (PIA), פעל לפי הוראות היצרן.
2. כדי להכין אגר סלקטיבי Prevotella (PSA), בבקבוק זכוכית נקי, הוסף את הדברים הבאים:
   1. 30.0 גרם של מרק סויה טריפטי (TSB). 15.0 גרם של אגר. 5.00 גרם של תמצית שמרים. 0.50 גרם של L-ציסטאין הידרוכלוריד.
   2. 10.0 מ"ל של 0.5 מ"ג / מ"ל מלאי המין. 100 μL של 10 מ"ג / מ"ל מלאי menadione.
   3. מוסיפים 940 מ"ל של diH₂O ומערבבים. יש לעקר על ידי autoclaving ב 121 ° C במשך 15 דקות.
   4. כאשר מקורר (כלומר, ניתן להחזיק את הבקבוק יחף), מוסיפים תוך כדי ערבוב: 50.0 מ"ל של דם כבשים מנותק. 2.00 מ"ל של 50 מ"ג / מ"ל מלאי קנמיצין. 150 μL של 50 מ"ג / מ"ל מלאי vancomycin. 500 μL של 10 מ"ג / מ"ל פולימיקסין B מלאי.
3. כדי להכין אגר סלקטיבי סטרפטוקוקוס (SSA), בבקבוק זכוכית נקי, הוסף את הדברים הבאים:
   1. 30.0 גרם של TSB. 15.0 גרם של אגר.
   2. מוסיפים 950 מ"ל של diH₂O ומערבבים. יש לעקר על ידי autoclaving ב 121 ° C במשך 15 דקות.
   3. כאשר מקורר (כלומר, ניתן להחזיק את הבקבוק יחף), מוסיפים תוך כדי ערבוב: 50.0 מ"ל של דם כבשים מנותק. 1.00 מ"ל של 10 מ"ג / מ"ל פולימיקסין B מלאי. 1.00 מ"ל של 10 מ"ג / מ"ל מלאי חומצה אוקסולינית.
      הערה: יוצקים לצלחות ושומרים על טמפרטורה של 4°C למשך חודש אחד לכל היותר. לפני השימוש, תנו לצלחות להתייבש בטמפרטורת החדר עד 24 שעות מראש לפני שהן מחוסנות. PSA אומת עם P. melaninogenica ו - Prevotella intermedia. SSA אומת עם S. sanguinis, וקבוצת Streptococcus milleri (Streptococcus constellatus, Streptococcus intermedius, ו - Streptococcus anginosus, המסומנים כ- SMG). מומלץ מאוד דה נובו לאמת את המדיה הסלקטיבית הזו אם רוצים לבדוק זנים חדשים.

3. הכנת מדיה נוזלית חיידקית ותנאי גידול

1. כדי לגדל באופן שגרתי P. aeruginosa ו - S. aureus, השתמש במדיום סטרילי עשיר (למשל, מרק ליזוגני (LB) או TSB).
   1. התחל נוזל לילה על ידי בחירת מושבה אחת שגדלה בעבר על צלחת אגר LB/TSB במשך 20-24 שעות ב 37 ° C.
   2. הגדילו את תרביות המרק בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה עם ניעור ב-250 סל"ד למשך 16-18 שעות.
2. כדי לגדל סטרפטוקוקוס spp., השתמשו במרק טוד יואיט סטרילי בתוספת תמצית שמרים 0.5% (THB-YE).
   1. התחל תרבית נוזלית בן לילה ממושבה אחת שגודלה בעבר על צלחת אגר TSB בתוספת דם כבשים 5% (צלחת אגר דם) למשך 24 שעות ב 37 ° C + 5% CO₂.
   2. לגדל את תרביות THB-YE באופן אנאירובי או ב 37 ° C + 5% CO₂ לילה מבלי לרעוד במשך 18-22 שעות.
3. כדי לגדל Prevotella spp., להכין 1 ליטר של Prevotella growth medium (PGM) על ידי הוספת הדברים הבאים לבקבוק נקי:
   1. 30.0 גרם של TSB. 5.00 גרם של תמצית שמרים. 0.50 גרם של L-ציסטאין הידרוכלוריד. 10.0 מ"ל של מלאי האמין של 0.5 מ"ג/מ"ל ו-100 מיקרוליטר של מלאי מנדיון של 10 מ"ג/מ"ל.
   2. הוסף 990 מ"ל של diH₂O. לעקר על ידי autoclaving ב 121 ° C במשך 15 דקות. עטפו את הבקבוק ברדיד אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור.
   3. לגדל מושבות Prevotella spp. על צלחת אגר דם מודגר אנאירובית ב 37 ° C במשך 48 שעות.
   4. יש לחסן מושבה אחת ב-PGM ולגדול במשך הלילה מבלי לרעוד בטמפרטורה אנאירובית של 37°C למשך 24 שעות.
      הערה: PGM יכול להישמר בטמפרטורת החדר עד שבועיים. מומלץ מאוד לבצע בדיקות סטריליות בכל מדיום גידול לפני השימוש. אם לא משתמשים בתא אנאירובי, ייתכן שיהיה צורך להתחיל לילה נוזלי של Prevotella spp. מ טלאי של מושבות.

4. הכנת ניסוי בתרבות משותפת

הערה: איור 1 מתאר זרימת עבודה ניסיונית מסוכמת. הגדרת הניסוי יכולה להיעשות בתנאים אוקסיים אם זמן ההכנה לוקח פחות מ 1 שעה. אם זה צפוי לקחת יותר זמן מזה, מומלץ מאוד לבצע את הניסוי באמצעות תא אנאירובי (עם 10% CO₂, 10% H₂, ו 80% N₂ גז מעורב). ניתן להשתמש בצנצנות אנאירוביות גם כדי לדגור על דגימות הניסוי.

1. הכנת המונוקולטורה והתרבויות המשותפות
   הערה: בצע את כל שלבי הצנטריפוגה במהירות של 10,000 x גרם למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. עבור התרביות המשותפות, ערבבו את דגימות החיידקים רגע לפני חיסון צלחות 96 הבארות. בדרך כלל, נפח של 1 מ"ל עבור זנים P. aeruginosa ו - S. aureus נאספים מתרביות הלילה. עבור Streptococcus spp. ו - Prevotella spp., נפחי הלילה עשויים לנוע בין 2-4 מ"ל. ניתן לכוונן אמצעי אחסון אלה בהתאם למספר התנאים שיש לבדוק.
   1. באמצעות הנוזל החיידקי מתרביות הלילה, בצע את השלבים הבאים:
      1. עבור הזנים P. aeruginosa ו-S. aureus, יש לשטוף פעמיים באמצעות מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS).
      2. עבור Streptococcus spp. ו - Prevotella spp., יש לשטוף פעם אחת עם PBS סטרילי.
         הערה: השתמשו בפיפט כדי להשליך בזהירות סופרנאטנטים, מכיוון שהכדורים יכולים ללכת לאיבוד בקלות.
      3. לאחר השטיפה, יש להשהות מחדש כל גלולה ב-1 מ"ל של 1x ASMb מדולל במים.
      4. בצע דילול של 1:10 של כל דגימה ב- PBS סטרילי ומדוד את OD₆₀₀.
      5. התאם את כל התרביות ל- OD₆₀₀ של 0.2 ב- ASM.
      6. באמצעות תרחיפים OD₆₀₀ = 0.2, לדלל ב- ASM את דגימות החיידקים ל- OD₆₀₀ סופי של 0.01 (עבור כל מיקרוב) עבור מונוקולטורה ותרביות משותפות.
      7. מערבולת ביסודיות במשך 5 שניות.
         הערה: לדוגמה, כדי להכין סך של 1 מ"ל של תרחיף ASM מונוקולטורה P. aeruginosa ב- OD₆₀₀ = 0.01, הוסף 50 μL של P. aeruginosa ב- OD₆₀₀ = 0.2 לנפח של 950 μL של ASM. עבור תרבית משותפת, לקחת 50 μL של כל P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. ו Prevotella spp. suspension ב OD₆₀₀ = 0.2 ולהוסיף 800 μL ASM.
      8. בעזרת פיפטה, הוסף 100 μl של מתלי מונוקולטורה ותרבות משותפת בשלוש בארות נפרדות של צלחת פלסטיק סטרילית שטוחה 96 בארות.
      9. לדגור על הצלחת (ללא טלטול) במשך 24 שעות ב 37 ° C בתנאים אנוקסיים.
         הערה: מתחי חמצן אחרים (למשל, מיקרוקסיה, נורמוקסיה) יכולים לשמש גם כאן. עם זאת, המודל פותח ואומת עם תנאים אנוקסיים. אשרו את החיסון ההתחלתי על ידי דילול סדרתי של תרחיפים חיידקיים מונו ותרבית משותפת, וציפוי על PIA, MSA, SSA ו- PSA מומלץ מאוד. ריכוז ההתחלה הממוקד עבור כל מין חיידקים הוא 1 × 10⁷ CFU/mL (P. aeruginosa), 3.5 × 10⁶ CFU/mL (S. aureus), 1.2 × 10⁶ CFU/mL (Streptococcus spp.), ו- 4.6 × 10⁶ CFU/mL (Prevotella spp). חיסון חיידקי יכול גם להיות שונה, כפי שתואר על ידי ז'אן-פייר ועמיתיו¹⁰.
2. החלף את המדיה לאחר היווצרות ביופילם.
   1. לאחר 24 שעות של דגירה, להסיר את התאים unconnected (planktonic) על ידי שאיפה באמצעות פיפטה רב ערוצית.
   2. לחדש את הביופילמים שנוצרו מראש עם 100 μL של ASM טרי או הטיפול הרצוי (למשל, אנטיביוטיקה, מטבוליטים, וכו ').
   3. לדגור על הצלחת במשך 24 שעות נוספות ב 37 ° C בתנאים אנוקסיים.
      הערה: ניתן לבצע צעדים אלה באופן אירובי אם הם מבוצעים במהירות (כלומר, פחות מדקה). אחרת, אנא השתמש בתא אנאירובי.

5. איסוף וציפוי הדגימות

1. לאחר 24 שעות נוספות של הדגירה, שואפים את התאים שאינם מחוברים (פלנקטוניים) עם פיפטה רב ערוצית.
   הערה: ניתן לשמור את החלק הפלנקטוני, לדלל אותו סדרתית ולצפות אותו על מדיה סלקטיבית או להשליך אותו.
2. שטפו בעדינות את הביופילמים פעמיים באמצעות 125 מיקרוליטר של PBS סטרילי והשליכו את הכרכים.
3. הוסף 50 μL של PBS סטרילי ונתק את הביופילמים על ידי גירוד עדין של התאים מהצלחת באמצעות משכפל של 96 פינים.
4. מעבירים את תאי הביופילם המרחפים לשורה A של צלחת סטרילית חדשה בת 96 בארות.
   הערה: לוח 96 הקידוחים יכיל PBS סטרילי בשורות B עד H.
5. בצע דילול סדרתי פי 10 של שברי הפלנקטוניק (במידת הצורך) והביופילם.
6. צלחת 3-5 μL של כל דגימת דילול על PIA, MSA, SSA ו- PSA.
7. הניחו לכתמי החיסון להתייבש.

6. דגירה על לוחות סלקטיביים וספירת יחידות יוצרות מושבה (CFU)

1. עבור P. aeruginosa ו - S. aureus, לדגור ב 37 ° C במשך 18-20 שעות.
2. עבור סטרפטוקוקוס spp, לדגור ב 37 ° C בתנאים אנוקסיים במשך 24 שעות.
3. עבור Prevotella spp, לדגור ב 37 ° C בתנאים anoxic במשך 48 שעות.
4. לאחר הדגירה, לספור את המושבות (~ 10-35 לכל נקודה) ולחשב את CFU לכל מ"ל.
5. התווה את הנתונים באמצעות כלי תצוגה חזותית.

תוצאות

כפי שמיוצג באיור 2, דווחו מספר פנוטיפים, כולל (1) ירידה במספר ספירות התאים בנות קיימא של P. aeruginosa ו-S. aureus כאשר גדלו קהילות פלנקטוניות מעורבות בהשוואה למונוקולטורה, (2) עלייה בצמיחה רב-מיקרוביאלית של תאי S. sanguinis , ו-(3) גידול קהילתי מעורב של P. melanin...

Discussion

התועלת של מערכת תרבית משותפת במבחנה זו, בעלת מידע קליני, טמונה ביכולתה לזהות תפקודים חיידקיים ספציפיים לחיידקים רב-מיקרוביאליים. כלומר, באמצעות השימוש במודל הזה דיווחנו על פנוטיפים מיקרוביאליים החל מגידול ספציפי לקהילה של Prevotella spp. (איור 2) ועד ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Fisher Scientific	NC0387928	Prepare a 250 mg/mL stock in chloroform directly in the bottle. Keep at -20°C. Final concentration 200 μg/mL in 2x ASM base.
3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS)	Sigma	M1254	Final concentration 200 mM in 2X ASM base.
96-pin replicator	Fisher Scientific	05-450-9	Disposable replicators can also be used. Cat #NC1567338.
96-well sterile standard plate with lid	Fisher Scientific	62406-081
Agar	Fisher Scientific	DF0145-17-0
AnaeroPack 2.5 L Rectangular Jar	Fisher Scientific	23-246-385
CaCl2*2H2O	Fisher Scientific	C79-500	Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 3.5 mM in 2x ASM base.
Defribrinated sheep's blood			To prepare growth plates for Streptococcus and Prevotella.
Deoxyribonucleic acid from herring sperm	Sigma	D7290	Final concentration 1.2 mg/mL in 2x ASM base.
FeSO4*7H2O	Fisher Scientific	AA1449830	Prepare a 1 mg/mL stock (3.6 mM) in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep wrapped in aluminum foil. Final concentration 0.0072 mM in 2x ASM base.
GasPaks	Fisher Scientific	B260678
Glucose	Fisher Scientific	D16-3	Prepare as a 20% stock (1.1 M) in water and sterilize by autoclave. Final concentration 6 mM in 2x ASM base.
Hemin	Sigma	51280	Dissolve 100 mg of hemin in 2 mL of 1 M NaOH and then bring up volume to 200 mL with water. Store in an amber bottle or a regular bottle wrapped with aluminum foil at 4 °C.
K2SO4	Fisher Scientific	P304-500	Prepare a 0.25 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 0.54 mM in 2x ASM base.
Kanamycin			Prepare a 50 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
KCl	Fisher Scientific	P217-500	Final concentration 30.0 mM in 2x ASM base.
KNO3	Fisher Scientific	P263-500	Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 0.70 mM in 2x ASM base.
L-cysteine hydrochloride	Fisher Scientific	AAA1038922
L-Lactic acid	Sigma	L1750	Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. pH adjust to 7.0. Final concentration 18.6 mM in 2x ASM base.
L-Tryptophan	Sigma	T0254	Prepare a 0.1 M stock in 0.2 M NaOH and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep refrigerated at 4 °C wrapped in aluminum foil. Final concentration 0.132 mM in 2x ASM base.
Mannitol Salt Agar	Fisher Scientific	B11407	Prepare using manufacturer's recommendations.
Menadione	Sigma	M5625	Prepare a 10 mg/mL stock solution dissolved in 96-100% ethanol. Conserve at 4 °C wrapped in aluminium foil. Vortex before use.
MgCl2*6H2O	Fisher Scientific	AA12288A9	Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 1.21 mM in 2x ASM base.
Mucin from porcine stomach - Type II	Sigma	M2378	Prepare a 10 mg/mL (2x) stock in water; mix thoroughly before autoclaving. Keep at 4 °C.
Na2HPO4	Fisher Scientific	S375-500	Prepare a 0.2 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 2.5 mM in 2x ASM base.
N-acetylglucosamine	Sigma	A8625	Prepare a 0.25 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep stock refrigerated at 4 °C. Final concentration 0.6 mM in 2x ASM base.
NaCl	Fisher Scientific	S271-500	Final concentration 103.7 mM in 2x ASM base.
NaH2PO4*H2O	Fisher Scientific	S369-500	Prepare a 0.2 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 2.6 mM in 2x ASM base.
NaOH	Fisher Scientific	S318-500	Prepare a 5 M stock solution. Use to adjust pH of 2x ASM base stock.
NH4Cl	Fisher Scientific	A661-500	Final concentration 4.6 mM in 2x ASM base.
Oxolinic acid			Prepare a 10 mg/mL stock solution 0.5 M NaOH. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Polymixin B			Prepare a 10 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Pseudomonas Isolation Agar	Fisher Scientific	DF0927-17-1	Prepare using manufacturer's recommendations.
Todd Hewitt Broth	Fisher Scientific	DF0492-17-6	Prepare using manufacturer's recommendations.
Tryptic Soy Broth	Fisher Scientific	DF0370-17-3	Prepare using manufacturer's recommendations.
Vancomycin			Prepare a 50 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Yeast Extract	Fisher Scientific	B11929
Yeast Synthetic Dropout without Tryptophan	Sigma	Y1876	Final concentration 8.0 mg/mL in 2x ASM base.