In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר הקמת אורגנואידים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) של רקמה מתאי אפיתל ראשוניים של פני השחלות האנושיות (hOSE). הפרוטוקול כולל בידוד של hOSE מהשחלות הטריות שנאספו, הרחבה תאית של hOSE, הליכי הפשרה בהקפאה וגזירת אורגנואידים. Immunofluorescence, ניתוח כמותי, והצגת השירות כפלטפורמת סינון כלולים.

Abstract

אפיתל פני השחלה (OSE), השכבה החיצונית ביותר של השחלה, עובר קרע במהלך כל ביוץ וממלא תפקיד מכריע בריפוי פצעים בשחלות תוך שיקום שלמות השחלות. בנוסף, OSE עשוי לשמש כמקור לסרטן שחלות אפיתליאלי. למרות שתכונות ההתחדשות של OSE נחקרו היטב בעכברים, הבנת המנגנון המדויק של תיקון רקמות בשחלה האנושית עדיין מעוכבת על ידי גישה מוגבלת לשחלות אנושיות ופרוטוקולים מתאימים לתרבית חוץ גופית . אורגנואידים ספציפיים לרקמות, הממוזערים במבחנה ומודלים המשכפלים היבטים מבניים ותפקודיים של האיבר המקורי, מציעים הזדמנויות חדשות לחקר הפיזיולוגיה של האיברים, מידול מחלות ובדיקות סמים.

במאמר זה אנו מתארים שיטה לבידוד אוז"ה ראשוני (hOSE) אנושי משחלות שלמות ולביסוס אורגנואידים של hOSE. אנו כוללים אפיון מורפולוגי ותאי המראה הטרוגניות בין התורמים. בנוסף, אנו מדגימים את היכולת של שיטת תרבית זו להעריך השפעות הורמונליות על צמיחת אורגנואידים של OSE על פני תקופה של שבועיים. שיטה זו עשויה לאפשר גילוי של גורמים התורמים להתחדשות OSE ולהקל על בדיקות סקר ספציפיות למטופל עבור OSE ממאיר.

Introduction

השחלה נחשבת לאחד האיברים הדינמיים ביותר בגוף, עוברת מחזורים קבועים של ריפוי פצעים ושיפוץ לאורך חיי הרבייה של הפרט. שחקן מרכזי המעורב בהתחדשות רקמת השחלה לאחר כל מחזור ביוץ הוא אפיתל פני השחלות (OSE)1. OSE היא שכבה בודדת שמקורה במזותליום המכילה תאי אפיתל שטוחים, קובואידים ועמודתיים המכסים את כל משטח השחלה2. לפני הביוץ, רקמת הסטרומה השחלתית על פני זקיק הביוץ עוברת הפרעה פרוטאוליטית כדי לאפשר שחרור של קומפלקס קומולוס-ביצית. האזור הפגוע, המכונה סטיגמת הביוץ, מתוקן לאחר מכן, עם סגירה מוחלטת של פני השחלה המושגת תוך פחות מ -72 שעות בעכברות3. היכולת היעילה ביותר של OSE להתרבות ולסגור את פצע הביוץ מדגישה את קיומה המשוער של אוכלוסיית תאי גזע תושבת4. בשל הזמינות המוגבלת של שחלות אנושיות מתורמים בגיל הפוריות, רוב הידע על מנגנוני תיקון OSE מגיע ממודלים של בעלי חיים. עם זאת, מאפיינים ספציפיים למין מעכבים את התרגום ממחקר שחלות מבוסס בעלי חיים לבני אדם5.

מחקרי מבחנה השתמשו בעיקר בתרבית תאים דו-ממדית (2D) של OSE אנושי, לפיה תאים גדלו בשכבה אחת המחוברת לפני השטח של צלחת תרבית, בשל עלות-תועלת ותרבית קלה 6,7,8. עם זאת, לגישה זו יש מגבלות המשכפלות את המורכבות של הדינמיקה של רקמת השחלה9. בהקשר זה, פלטפורמות תרבית תאים תלת-ממדיות עם דגש מיוחד על אורגנואידים בשחלות חוללו מהפכה במחקר השחלות10. אורגנואידים רקמתיים ממוזערים בייצוגי מבחנה של האיבר שממנו הם נגזרים, מציגים יכולת ארגון עצמי תלת-ממדית ומחקים פונקציות ומבנים מרכזיים של עמיתיהם in vivo 11. טכנולוגיה זו מציעה אפשרות לשפוך אור על שאלות יסוד הנוגעות להתפתחות, התחדשות ותיקון רקמות בשחלה האנושית10. בשנים האחרונות, חוקרים יישמו גם ידע על אורגנואידים בשחלות ליצירת אורגנואידים ספציפיים לסרטן השחלות (OC) למידול מחלות ורפואה מותאמת אישית 12,13,14.

בהתבסס על שיטות שונות המשמשות ליצירת אורגנואידים OSE עכבר ואורגנואידים של חצוצרה (FT)15,16, כמו גם אורגנואידים אנושיים של OSE12 ואורגנואידים FT17, אנו מתארים כאן פרוטוקול לגזירה של אורגנואידי OSE אנושיים משחלות אנושיות עם יישומים פוטנציאליים במחקרי התחדשות OSE. פרוטוקול זה מבודד ביעילות תאי OSE ראשוניים משחלות אנושיות שלמות וכולל תיאור שלב אחר שלב של התרחבות תאים דו-ממדית ויצירת אורגנואיד hOSE תלת-ממדי. אורגנואידי hOSE הציגו שונות (ספציפית לתורם) במורפולוגיה ובגדילה, והדגישו את התועלת שלהם למחקרים מותאמים אישית. בנוסף, פרוטוקול זה כולל תחזוקת אורגנואיד hOSE, העברה ואימונופלואורסנציה באותה צלחת תרבית. יתר על כן, הוא מספק תיאור של המורפולוגיה השונה שאורגנואידים hOSE יכולים לאמץ ומאפיין שינויים באימונופנוטיפ במהלך התרבית. לבסוף, הוא מציג תועלת על ידי חקירת ההשפעה של רמזים סביבתיים, כגון הורמונים בשחלות, על היווצרות וגדילה של אורגנואיד hOSE בהתבסס על מספר וגודל אורגנואיד hOSE.

היישום של טכנולוגיית אורגנואיד hOSE ישפר את הבנתנו את השחלה, עם דגש ספציפי על המנגנונים האחראים ליכולת ההתחדשות יוצאת הדופן שלה. ככל שהמודלים התלת-ממדיים של השחלות האנושיות ימשיכו להתפתח, ההסתמכות על מודלים של בעלי חיים במחקר השחלות תפחת, ותוביל לטיפולים חדשניים בתחום הרפואה הרגנרטיבית18.

Protocol

המחקר נערך בהתאם להנחיות הצהרת הלסינקי. תכנון המחקר הוגש לוועדה האתית הרפואית של המרכז הרפואי של אוניברסיטת ליידן (LUMC), והתקבל מכתב ללא התנגדות (B18.029) לפני המחקר. רקמת השחלה האנושית העיקרית ששימשה נאספה מאנשים טרנסגבריים שעברו ניתוח לאישור מגדרי בבית החולים VUmc (אמסטרדם, הולנד). הסכמה מדעת חתומה התקבלה מכל התורמים. כל החומרים המשמשים בפרוטוקול זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. בידוד תאי OSE ראשוני אנושי

  1. לאחר כריתת השחלות, מניחים את השחלות ב-0.9% NaCl או בתמיסת מלח סטרילית דומה ומעבירים אותה למעבדה על קרח.
  2. להעביר שחלות בודדות לצינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל 2-3 מ"ל של מדיום עיכול (טבלה 1) או מספיק כדי לכסות את השחלה.
    זהירות: אם השחלה אינה שלמה (חלק מהאיבר נחתך לניתוח היסטולוגי), חשוב לא לכסות חלק זה במדיום העיכול.
  3. יש להניח את הצינור באמבט חרוזים שחומם מראש (או באמבט מים) בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
  4. מעבירים בזהירות את השחלה לצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ המכילה 10 מ"ל של אמצעי איסוף (טבלה 1).
  5. יש לגרד בעדינות את משטח השחלה המכיל את תאי ה-hOSE באמצעות מגרד תאים. שטפו את המגרד בתווך וחזרו על השלב הזה לפחות שלוש פעמים (איור 1).
    אזהרה: אם השחלה אינה שלמה, הימנע הן מגרד והן מטביעה את האזור הפגוע כדי למזער זיהום עם סוגי תאים לא רצויים.
  6. מעבירים את תאי ה-hOSE בתווך האיסוף לתוך צינור של 15 מ"ל.
  7. סובב תאי hOSE במהירות של 240 x גרם למשך 5 דקות.
    1. אם הגלולה מראה צבע אדום, המעיד על זיהום עם תאי דם אדומים (RBC), להשעות את הגלולה עם 1 מ"ל של חיץ ליזה RBC. יש לדגור במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר (RT) עם צנרת מדי פעם, להוסיף 4 מ"ל PBS עם סידן ומגנזיום (PBS+/+), וצנטריפוגה ב-240 x גרם למשך 5 דקות. אם RBC נמשך, חזור על שלב זה.
  8. Cryopreserve גלולת תא hOSE (סעיף 2), להשתמש בו עבור תרבית דו-ממדית (סעיף 3) או אורגנואידים תלת-ממדיים (סעיף 4) (איור 1).

2. שימור בהקפאה-הפשרה של תאי hOSE

  1. שימור בהקפאה
    1. השהה מחדש את גלולת תא hOSE ב 1 מ"ל של מדיה הקפאת תאים.
    2. העברת תרחיף התא לקריוביאלים (2x קריובלים לשחלה).
    3. הניחו את הקריובלים במיכל הקפאה והניחו אותו בטמפרטורה של -80°C למשך הלילה.
    4. העבירו את הקריובלים הקפואים למיכל חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
  2. הפשרה:
    1. הסר את cryovial מן החנקן הנוזלי.
    2. הניחו את הקריוביאל באמבט חרוזים שחומם מראש (או אמבט מים) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות או עד שרק ליבה קפואה קטנה נראית בתוך הקריוביאל.
    3. יש לדחוס את תרחיף תאי ה-hOSE לתוך צינור של 15 מ"ל עם 10 מ"ל של אמצעי איסוף (טבלה 1).
    4. צנטריפוגה ב 240 x גרם במשך 5 דקות.
    5. השתמש בכדורית תא hOSE לתרבית דו-ממדית (סעיף 3) או אורגנואידים תלת-ממדיים (סעיף 4).

3. תרבות hOSE דו-ממדית בחד-שכבתית

  1. השהה מחדש את גלולת ה-hOSE ב-1 מ"ל של OSE_2D בינוני (טבלה 1) והעבר אותה לבאר אחת מצלחת בת 12 בארות.
  2. הוסף 1 מ"ל של תווך OSE_2D לבאר ולתרבית ב 37 ° C באינקובטור לח (5% CO2) במשך 72 שעות כדי להבטיח את תאי hOSE להתחבר לפני שינוי המדיה הראשון.
  3. רענן מדיה כל 2-3 ימים עד שתאי hOSE מגיעים למפגש של 70%-90% (P0) (איור 2A).
    הערה: אם RBCs עדיין נוכחים בתרבית, הם יוסרו במהלך שינוי המדיה הראשון, ורק תאי hOSE יישארו מחוברים לבאר.
  4. עבור תאי hOSE עוברים, בצע את השלבים המתוארים להלן.
    1. הוציאו את אמצעי התרבות מהבאר.
    2. לשטוף עם 1 מ"ל של PBS סטרילי.
    3. הסר PBS והוסף מספיק 0.05% טריפסין/EDTA כדי לכסות את התאים.
    4. מניחים את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח (5% CO2) במשך 4-7 דקות עד שמבחינים בתאים מתעגלים ומתנתקים מהבאר.
    5. עצור את התגובה האנזימטית על ידי הוספת 1 מ"ל של מדיום איסוף.
    6. אספו את תאי ה-hOSE והצנטריפוגה במהירות של 240 x גרם למשך 5 דקות.
    7. זרעו תאים בבאר חדשה בצפיפות הרצויה, רעננו מדיה כל 2-3 ימים עד שתאי hOSE מגיעים למפגש של 70%-90%, וחזרו על שלב 3.4.
      הערה: תאי hOSE ראשוניים יכולים להיות בתרבית עד שלושה מעברים. לאחר מכן רוב התאים יזדקנו (איור 2A).
  5. השתמשו בתאי hOSE המורחבים לאפיון נוסף באמצעות אימונופלואורסנציה (איור 2B) כדי לבחון את ההשפעות של מדיה תרבית (איור 2C) או אורגנואידים תלת-ממדיים (סעיף 4).

4. 3D תרבית אורגנואידים hOSE

  1. מגלשה מרובת תאים חמה מראש ב 37 °C (77 °F).
  2. ספירה (מבודד טרי או בהקפאה-מופשר) תאי hOSE עם מונה תאים אוטומטי או ידנית עם המוציטומטר.
  3. השהה מחדש את המספר הרצוי של תאי hOSE ל-1 מ"ל של תווך אורגנואיד OSE קר כקרח (טבלה 1) בצינור של 1.5 מ"ל.
  4. צנטריפוגה ב 240 x גרם במשך 5 דקות.
  5. יש להשהות מחדש את כדורית ה-hOSE בכמות הרצויה של תמיסת תמצית קרום מרתף (BME) קרה כקרח כדי לקבל ריכוז תאים של 1 x 104 תאים / 10 μL של BME.
  6. פתרון פיפטה hOSE-BME למעלה ולמטה כדי להבטיח פיזור הומוגני.
  7. הכינו 10 μL של טיפות של תמיסת hOSE-BME לכל באר במגלשה מרובת התאים המחוממת מראש.
    הערה: ודא שכל טיפה נמצאת במרכז הבאר כדי לקבל צורת טיפה.
  8. הניחו את הצלחת עם הטיפות הפוכות בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח (5% CO2) למשך 15 דקות כדי לאפשר התמצקות ג'ל.
  9. הוסף 100 μL של מדיום OSE_3D (טבלה 1) ותרבית ב 37 ° C באינקובטור לח (5% CO2).
  10. רענן את המדיום כל 3-4 ימים.
    הערה: אורגנואידים מסוג hOSE ממשיכים לגדול לפחות עד 28 יום בתרבית (איור 3A, B), אולם מומלץ לעבור כל 14-28 יום (קצב הגידול תלוי בתורם, טרי לעומת קריו) כדי לעודד התרבות תאים והישרדות אורגנואידים. שלושה קווי אורגנואיד עצמאיים של hOSE עברו לפחות 4 פעמים ללא סימני הזדקנות. אורגנואידים של hOSE מראים מורפולוגיות שונות (איור 3C).
  11. עבור אורגנואידים hOSE עוברים:
    1. הסר את המדיום והוסף 100 μL של DMEM/F12 מתקדם קר כקרח לכל באר.
    2. מגרדים את תחתית הבארות עם קצה פיפטה P1000 כדי לנתק את טיפות הג'ל.
    3. מעבירים כל טיפת ג'ל צפה לצינור בנפח 1.5 מ"ל.
    4. צנטריפוגה את הצינורות עם טיפות הג'ל ב 240 x גרם במשך 5 דקות.
    5. הסר את supernatant, resuspend את הגלולה ב 300 μL של חיץ דיסוציאציה התא, ומניחים את הצינורות באמבט חרוזים שחומם מראש (או אמבט מים) ב 37 ° C במשך 5-10 דקות.
      הערה: אם חלק מהאורגנואידים נשארים שלמים, פיפטה מעלה ומטה כמה פעמים עם קצה פיפט קר כקרח מצופה בסרום בקר עוברי כדי לשבש אותם מכנית. ציפוי קצות פיפט בסרום בקר עוברי מונע מהאורגנואידים להידבק לקצה.
    6. הוסף 300 μL של תווך אורגנואיד בסיסי hOSE וצנטריפוגה ב 240 x גרם למשך 5 דקות.
    7. משעים מחדש את הגלולה בכמות הרצויה של תמיסת BME לא מדוללת, זורעים אותם מחדש ביחס מתאים (מחלקים את התוכן של טיפה אחת ל 1-4 טיפות), ותרבית כאמור.
      הערה: האורגנואידים אינם מנותקים לתאים בודדים, ולכן לא ניתן לספור במדויק את התאים למעבר נוסף.

5. אימונופלואורסנציה מלאה של אורגנואידים תלת-ממדיים של hOSE

הערה: ניתן לבצע אימונופלואורסנציה של הר שלם באותה באר תרבית (בדה טיפה) אם משתמשים בשקופיות מרובות תאים המתאימות לטכניקות מיקרוסקופיה.

  1. תקנו את אורגנואידי hOSE בטיפות ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 20 דקות ב-RT.
  2. שטפו פעמיים עם PBS במשך 5 דקות ב-RT על פלטפורמה מסתובבת/רועדת.
  3. חדרו את אורגנואידי hOSE בטיפות באמצעות 100 μL של חיץ חדירה (טבלה 1) למשך 15 דקות ב-RT.
  4. יש לשטוף שלוש פעמים עם 100 μL של חיץ חוסם (טבלה 1) למשך 15 דקות ב-RT ולחסום למשך הלילה (o/n) ב-4°C על פלטפורמה מסתובבת/רועדת.
  5. דגירה עם 100 μL של תערובת נוגדנים ראשונית מדוללת בחיץ חוסם ב 4 ° C o/n על פלטפורמה מסתובבת / מטלטלת.
    הערה: ראה טבלת חומרים לקבלת רשימה של נוגדנים ראשוניים בשימוש, סוג התא המסומן ומודל בעלי החיים המשמש לאימות ביטוי 12,19,20,21,22,23,24,25.
  6. הביאו את הצלחת ל-RT ושטפו אותה שלוש פעמים עם 100 μL של חיץ חוסם למשך 15 דקות ב-RT על פלטפורמה מסתובבת/רועדת.
  7. יש לדגור עם 100 μL של תערובת נוגדנים משנית המדוללת בחיץ חוסם למשך שעתיים ב-RT על פלטפורמה מסתובבת/רועדת, אך מוגנת מפני אור.
    הערה: ראה טבלת חומרים לקבלת רשימה של נוגדנים משניים בשימוש. כדי להגן מפני אור, הניחו את הצלחת בתוך קופסה כהה או כסו אותה ברדיד אלומיניום.
  8. שטפו שלוש פעמים ב-100 מיקרוליטר של PBS במשך 15 דקות ב-RT על פלטפורמה מסתובבת/מטלטלת.
  9. אחסנו את הצלחת בטמפרטורה של 4°C מכוסה ברדיד אלומיניום עד להדמיה (איור 4).

6. כימות גודל אורגנואיד hOSE

  1. צלם תמונות שדה בהיר פי 10 (תמונת TIFF) במיקרוסקופ.
  2. הורד והתקן את פיג'י (https://imagej.net/software/fiji/)26.
  3. מדוד את אזור התמונה של אורגנואידים hOSE באמצעות תוכנת ImageJ פיג'י:
    1. טען קובצי תמונה TIFF בפיג'י.
    2. צור סף עבור התוכנה כדי לזהות את אורגנואידי hOSE (אזור כהה יותר) בתמונת brightfield שהועלתה על ידי לחיצה על תמונה > התאם סף >. התאם את הערכים מתחת ומעלה עד שרוב הרקע יוסר ואורגנואידים בודדים יישמרו.
    3. פתח את כלי החזר ההשקעה על ידי לחיצה על ניתוח כלי > > החזר השקעה.
    4. בחרו בכלי שרביט ולחצו על האזור עם אורגנואיד hOSE עד שרואים קו צהוב המקיף את כל היקף האורגנואידים. בחלונית החזר השקעה, לחץ על Add and Measure כדי לקבל את ערך השטח של אורגנואיד OSE זה.
    5. חזור על שלב 6.3.4. עבור כל אורגנואיד hOSE שיש למדוד.

תוצאות

תרבות hOSE דו-ממדית
תאי hOSE טריים שבודדו צופו על צלחת של 12 בארות וגודלו בתרבית במשך 3 שבועות. במהלך התקופה הזו, תאים עברו שלוש פעמים (איור 2A). תאי hOSE ראשוניים בתרבית הציגו מורפולוגיה דמוית אבן מרוצפת עד מעבר 3 (P3) אך לאחר מכן החלו להראות סימני הזדקנות, בהתאם לתוצאות קודמות שדיווחו על תקופה מוגבלת בה ניתן לעבורhOSE 27. יתר על כן, הוכח כי OSE מורין עובר מעבר אפיתל למזנכימלי (EMT) במבחנה, ומציג תכונות דמויות פיברובלסטים כגון סידור מחדש של שלד האקטין ושקיעת קולגן I19. בהסכמה, ACTA2+CD44+ hOSE הראה אפרגולציה בולטת של COL1A1 בין P2 ל-P3 (איור 2B), מה שמרמז על כך שתאי hOSE עוברים EMT במהלך התרבית.

איתות TGF-β הוא הרגולטור העיקרי של EMT28 המסוגל לגרום EMT בסוגי תאי אפיתל שונים29. למרות ש- TGF-β לא נוסף למדיה OSE_2D, ה- FBS שנוסף יכול להכיל רמות ניתנות לזיהוי של ציטוקיןזה 30,31. מסיבה זו, בדקנו אם תוספת של קולטן מעכב TGF-β מסוג I SB-431542 יכולה למנוע EMT, ולאפשר תרבית דו-ממדית ממושכת. באופן מפתיע, תוספת של מדיה OSE_2D עם 10 מיקרומטר של SB-43154232עיכבה את התפשטות התאים (איור 2C). הגענו למסקנה שאיתות TGF-β חיוני להתפשטות OSE, וניסויים נוספים בתרבית דו-ממדית בוצעו ללא המעכב.

תרבית אורגנואידים תלת-ממדית hOSE
בהתבסס על תנאי תרבית שפורסמו לגידול אורגנואידים אנושיים של OSE12, הפקנו אורגנואידי hOSE המשובצים בטיפות BME וגדלים בתווך OSE_3D (המכיל ריכוז סטנדרטי של 100 ננומטר של אסטרדיול) למשך עד 28 ימים. בתוך 7 ימים, אורגנואידים רבים של hOSE שמקורם בתאי OSE שבודדו לאחרונה היו ציסטיים בקוטר ממוצע של 130 מ"מ (איור 3A,B). תוצאות אלה היו דומות לאלה שדווחו על ידי קופר ועמיתיו על גזירת אורגנואידים hOSE מרקמת שחלה אנושית טחונה ומעוכלת אנזימטית12. באופן מעניין, אורגנואידים של hOSE שמקורם בתאי OSE שזה עתה בודדו גדלו (קוטר ממוצע של 160 מ"מ) מאשר אורגנואידים של hOSE מתאי OSE מורחבים דו-ממדיים (קוטר ממוצע של 100 מ"מ) לאחר 14 יום בתרבית (איור 3B), כנראה בגלל הנטייה של תאי OSE מורחבים דו-ממדיים להפחית את ההתפשטות. יתר על כן, בעוד שאורגנואידים רבים של hOSE בתלת-ממד כללו שכבה אחת של תאי אפיתל שטוחים (איור 3C , פאנל שמאלי עליון), חלקם הציגו חד-שכבה קובואידית של תאים (איור 3C , פאנל ימני עליון), אחרים היו רב-שכבתיים (איור 3C , פאנל ימני תחתון) או יצרו אשכול תאים לא לומניזציה (איור 3C , פאנל שמאלי תחתון).

כדי לבדוק אם ניתן להפיק אורגנואידים של hOSE גם באמצעות OSE_2D בינוני, תאי hOSE שבודדו לאחרונה הוטמעו בטיפות BME וגודלו במדיה OSE_2D במשך 12 יום. לאחר 6 ימים, תאים דמויי ציר נראו, מה שמרמז על כך שתאי hOSE עברו EMT בטיפות. חשוב לציין שלא נוצרו אורגנואידים של hOSE באמצעות תווך OSE_2D (איור 3D).

מאפיינים תאיים של אורגנואידים hOSE
בשחלה הבוגרת האנושית, קרטין 8 (KRT8) מסמן באופן ספציפי את אוכלוסיית ה-OSE (איור 4A), ובהתאם לכך, אורגנואידי hOSE שמרו על ביטוי KRT8, ואימתו את זהות התא שלהם (איור 4B). בתאי OSE בעכבר, הלוקליזציה הגרעינית של חלבון הקשור ל-Yes1 (YAP1) הייתה קשורה באופן ספציפי לתאי גזע/אב של OSE המסוגלים להרחיב ולרפא את האזור הפגוע לאחר ביוץ24,33. YAP הראה לוקליזציה גרעינית ברוב התאים באורגנואידים של hOSE ללא תלות בגודלם (איור 4B). כמו כן נחקרו סמנים אחרים שדווח כי הם באים לידי ביטוי בתאי OSE של עכברים, כגון CD4420 ו-LGR522. באופן מעניין, גם CD44 וגם LGR5 באו לידי ביטוי באורגנואידים קטנים של hOSE (בקוטר <100 מיקרומטר), בעוד שבאורגנואידים גדולים יותר, CD44 ו-LGR5 נראו מווסתים כלפי מטה (איור 4B).

לאחר מכן, חקרנו אם אורגנואידים של hOSE הציגו את הקוטביות האפיקלית-בסיסית שנצפתה בדרך כלל באורגנואידים משובצי BME (אפיקל-אין)34. חלבון בזולטרלי אינטגרין בטא 1 (ITGB1) וחלבון אפיקלי פודוקליקסין (PODXL) שימשו כדי להראות את קוטביות התא באורגנואידים של hOSE, מה שמאשר קוטביות אפיקלית ברורה שאינה תלויה בגודל אורגנואיד hOSE (איור 4B).

ידוע שה-OSE האנושי מבטא את הסמן המזנכימלי N-cadherin (CDH2), בעוד שהביטוי של סמן אפיתל E-cadherin (CDH1) מוגבל לתאי OSE עמודתיים (איור 4A)2. באופן מעניין, אורגנואידים של hOSE שנגזרו בעבודה זו ביטאו סמנים מזנכימליים CDH2 ווימנטין (VIM), ואורגנואידים גדולים של hOSE ציסטי עם אפיתליה קובואידית/עמודתית היו גם CDH1+ וגם CDH2+VIM+ (איור 4C). עדיין לא ברור אם אורגנואידים מסוג CDH1+ hOSE נגזרו מתאי OSE ראשוניים מסוג CDH1+ או מתאי CDH1-OSE שעברו התמיינות אפיתל או טרנספורמציה (ניאופלסטית) במבחנה 25,35.

הצגת השימוש באורגנואידים של hOSE: השפעת רמזי ביוץ על אורגנואידים של hOSE
ניתן להשתמש בהורמונים הורמון מגרה זקיק וגונדוטרופין כוריוני אנושי כדי לגרום לצמיחה פוליקולרית וביוץ, בעוד שלאחר הביוץ יש עלייה ניכרת בריכוז ההורמונים המיוצרים בשחלות, כגון פרוגסטרון ואסטרדיול36. כדי להציג את השימושיות של אורגנואידים hOSE כפלטפורמת סינון, בחנו את ההשפעה של הורמונים אלה על אורגנואידים hOSE, תוך שימוש במספר ובגודל של אורגנואידים כפלט כימות (באמצעות פיג'י). לשם כך הפקנו אורגנואידים של hOSE במדיה OSE_3D שחסרה אסטרדיול (ללא הורמון) ובמדיה OSE_3D שמכילה FSH, hCG, אסטרדיול או פרוגסטרון בריכוזים שונים (איור 5A).

מספר אורגנואידי hOSE שמקורם בתאי hOSE שהופשרו בהקפאה (לא מורחבים) מ-3 תורמים שונים (n=3) כומת לכל טיפה לאחר 7 ימי תרבית (איור 5A,B). מדיית התרבות הוחלפה כל 3 ימים. לא נצפו הבדלים משמעותיים במספר הכולל של אורגנואידי hOSE לטיפה שנוצרו בהורמונים המכילים הורמונים בינוניים בהשוואה למדיום ללא הורמונים (איור 5A,B). כדי לכמת את השפעת ההורמונים על גודל האורגנואידים, לאחר 14 יום בתרבית, כל טיפה (מכל מצב) צולמה, והשטח של 4 אורגנואידי hOSE הגדולים ביותר נמדד באמצעות פיג'י. באופן מעניין, יצירת אורגנואידים של hOSE משני תורמים שונים (n = 2) בנוכחות פרוגסטרון (1000 ננומטר) או אסטרדיול (200 ננומטר) הביאה לפחות אורגנואיד אחד גדול מאוד (קוטר של כ-700 מיקרומטר) לכל טיפה (איור 5C,D).

figure-results-6785
איור 1: ייצוג סכמטי של בידוד תאי hOSE משחלות שלמות. השחלות הודגרו בתמיסת עיכול במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. תאי hOSE נותקו מפני השטח של השחלות על ידי גירוד עדין ולאחר מכן נשמרו בהקפאה, מצופים ישירות על תרבית OSE דו-ממדית בחד-שכבתיים, או מוטמעים בתמצית קרום מרתף (BME) לתרבית אורגנואידים תלת-ממדית של hOSE. תאי hOSE שהופשרו בהצפה יכולים לשמש לתרבית דו-ממדית או ליצירת אורגנואידים תלת-ממדיים, ותאי hOSE מורחבים דו-ממדיים יכולים לשמש ליצירת אורגנואידים תלת-ממדיים של hOSE. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7616
איור 2: תרבית דו-ממדית ראשונית של תאי hOSE. (A) תמונות שדה בהיר של תאי hOSE במעברים 0 (P0), 2 (P2) ו-3 (P3) המתארות מורפולוגיה טיפוסית של אבני ריצוף אפיתל. פסי קנה מידה הם 750 מיקרומטר בפאנלים עליונים ו-125 מיקרומטר בפאנלים התחתונים. (B) אימונופלואורסנציה עבור ACTA2, CD44, COL1A1 על תאי hOSE דו-ממדיים ב-P2 ו-P3. פסי קנה מידה הם 50 מיקרומטר. (C) תמונות שדה בהיר של תאי hOSE בתרבית עם 10 מיקרומטר של SB-431542 ב-P0, P2 ו-P3. התאים הראו סימני הזדקנות מ-P2 ולא הגיעו למפגש גבוה במהלך התרבית. פסי קנה מידה הם 750 מיקרומטר בפאנלים עליונים ו-125 מיקרומטר בפאנלים התחתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8582
איור 3: אפיון מורפולוגי של אורגנואידים של hOSE. (A) תמונות ברייטפילד של שלוש נגזרות אורגנואידים בלתי תלויות של hOSE משלושה תורמים שונים (tOVA86, tOVA87, tOVA88). התמונות צולמו לאחר הטבעה של תאים (D0), יום 7 (D7), יום 14 (D14) ויום 28 (D28) של תרבית. פסי קנה מידה הם 750 מיקרומטר ב-D0 ו-50 מיקרומטר לכל השאר. (B) קוטר אורגנואידים של hOSE שמקורם בתאי hOSE שזה עתה בודדו (קו מקווקו) ותאי hOSE מורחבים דו-ממדיים (קו מוצק). המתואר הוא גודל ממוצע ± סטיית תקן שנמדדה ב- D0, D7 ו- D14. תוצאות משני תורמים שונים (tOVA88 ו- tOVA89) מוצגות. (C) תמונות Brightfield של אורגנואידים hOSE המציגות מורפולוגיות שונות: שכבה שטוחה אחת (למעלה משמאל), שכבה עמודה בודדת (למעלה מימין), רב-שכבתית (למטה מימין) וצבירת תאים ללא לומן (למטה משמאל). פסי קנה מידה הם 100 מיקרומטר. (D) תמונות Brightfield של תאי hOSE המוטבעים ב-BME ומורבתים במשך 12 יום עם מדיה OSE_2D. התמונות צולמו לאחר הטבעה בתאים (D0), יום 6 (D6), יום 9 (D9) ויום 12 (D12). תאים דמויי פיברובלסטים השתלטו על התרבית, ולא נוצרו מבנים דמויי אורגנואידים. פסי קנה מידה הם 750 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-10011
איור 4: אפיון תאי של אורגנואידי hOSE. (A) אימונופלואורסנציה עבור KRT8 ו- CDH1 בחתך השחלות האנושי. סרגל קנה המידה בלוח השמאלי הוא 500 מיקרומטר, והפאנלים האמצעיים והימניים הם 50 מיקרומטר. (B) אימונופלואורסנציה עבור KRT8 ו-YAP, LGR5 ו-CD44, ו-ITGB1 ו-PODXL באורגנואידים hOSE בגדלים שונים (<50 מיקרומטר, 50-75 מיקרומטר, 75-100 מיקרומטר, >100 מיקרומטר). פסי קנה מידה הם 50 מיקרומטר. (C) אימונופלואורסנציה עבור VIM, CDH1, CDH2 באורגנואידים hOSE. פסי קנה מידה הם 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-10874
איור 5: ההשפעה של רמזי ביוץ על היווצרות אורגנואידים של hOSE. (A) המספר הכולל של אורגנואידים hOSE לכל טיפה שנוצרה ביום 7 באמצעי תרבית שונים. אורגנואידי hOSE נגזרו משלושה תורמים שונים (tOVA77, tOVA79, tOVA83). ב מודגש הוא המדיום OSE_3D המשמש לגזירת אורגנואידים. (B) היווצרות אורגנואידים יחסית בהשוואה למדיום ללא הורמונים. הערכים המאוגמים מאורגנואידים של hOSE נגזרו משלושה תורמים שונים (tOVA77, tOVA79, tOVA83). (C) גרף המתאר את אזור התמונה של 4 אורגנואידי hOSE הגדולים ביותר ביום ה-14 בכל אחד מתנאי הניסוי שנבדקו משני תורמים שונים (tOVA77, tOVA83). (D) תמונות ברייטפילד המראות אורגנואידים של hOSE ביום ה-14 בתרבית עם מדיום ללא הורמונים, 200 ננומטר E2 ו-1000 ננומטר P4 משני תורמים שונים (tOVA77, tOVA83). פסי קנה מידה הם 750 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: הרכב פתרונות העבודה ששימשו במחקר. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Discussion

טכנולוגיית אורגנואיד תלת-ממדית מסתמנת ככלי חיוני למחקר רפואי. מצד אחד, פלטפורמה זו במבחנה מציעה את האפשרות לחקור שאלות מכניסטיות בסיסיות על התחדשות רקמות, ריפוי פצעים והתפתחות18. מצד שני, אורגנואידים תלת-ממדיים שמקורם בדגימות חולים מאפשרים מחקרי רפואה מותאמת אישית, כולל אבחון, בדיקות סמים ותרפיה תאית 12,13,14,37,38. בתחום חקר השחלות, hOSE זכה להתעניינות רבה מאז השלכתו כמקור של קרצינומה שחלתית אפיתל39. למרות שמקובל לחשוב שרוב קרצינומת השחלות הסרוסיות בדרגה גבוהה (HGSOC), אחד מסוגי סרטן השחלות האפיתל הנפוצים ביותר, נובעת מחצוצרות40, המחקר הנוכחי על אורגנואידים תלת-ממדיים בשחלות בעכברים הציע מקור כפול פוטנציאלי של HGSOC מ-OSE וחצוצרות 15,16.

כאן, תיארנו פרוטוקול לגזירה של אורגנואידים תלת-ממדיים hOSE ותיארנו את היישום שלו כדי להביא ידע מכניסטי חדשני בהתחדשות רקמות השחלות. פרוטוקול זה כולל שיטה שלב אחר שלב לבידוד תאי hOSE ראשוניים משחלות אנושיות ויצירת אורגנואידים תלת-ממדיים של hOSE. כדי להבטיח גזירה יעילה של אורגנואיד hOSE, חיוני למזער את המניפולציה השחלתית. בשל מיקומו על פני השחלות והארגון החד-שכבתי, hOSE נוטה לנזק ואובדן במהלך כריתת שחלות ומניפולציה של איברים. מסיבה זו, העדפנו שיטה אנזימטית וגירוד המיושמת על השחלה כולה כדי לבודד hOSE 2,8. בפרוטוקול הנוכחי הוחל טיפול אנזימטי קל כדי לשבש את הקשרים הבין-תאיים של hOSE, ואחריו גירוד עדין של פני השחלות.

בהשוואה בין תרבית דו-ממדית לתרבית hOSE תלת-ממדית, חשוב לציין כי למרות קצב ההתרבות הגבוה הראשוני של תאי hOSE בתרבית דו-ממדית, המאפיינים התאיים שלהם השתנו עקב EMT, דבר המצביע על כך שתנאי התרבית הדו-ממדית המיושמים אינם מתאימים לשמירה על מורפולוגיה אפיתלית. לעומת זאת, אורגנואידים תלת-ממדיים של hOSE יכולים לעבור לפחות 4 פעמים ללא סימני הזדקנות. אמצעי התרבית האורגנואידים OSE_3D שבו השתמשו היה מבוסס על זה ששימש את קופר ועמיתיו לגזירה של אורגנואידים OC ו-hOSE בריאים12 ועל ידי קסלר ועמיתיו לגזירה של אורגנואידים אנושיים מסוג FT17. ההבדל העיקרי היה החלפת המדיה המותנית Wnt3a ו-R-Spondin-1 האנושית בחלבונים רקומביננטיים זמינים מסחרית כדי להקל על יכולת הרבייה.

טכניקות אימונופלואורסצנטיות כוללות בדרך כלל הסרת דגימת הרקמה מצלחת התרבית ועיבודה לצורך חתך פרפין או קריו. כאשר עובדים עם מבנים קטנים מאוד, הסיכון לאבד אותם במהלך עיבוד הדגימה הוא גבוה. בפרוטוקול זה, הנגזרת של אורגנואידי hOSE מתבצעת בלוחות תרבית תאים המאפשרים הדמיה ישירה במיקרוסקופ ללא צורך להסיר את אורגנואידי hOSE ממטריצת BME. יתר על כן, שיטת האימונופלואורסנציה המלאה המשמשת כאן, שתוארה על ידי רזנג'אד ועמיתיו עבור אורגנואידים צינוריים של הלבלב41, אפשרה תצפית באתרו של לוקליזציה של חלבונים בתוך אורגנואידים שלמים מורפולוגית. הדגמנו כי בעת ביצוע פרוטוקול אימונופלואורסנציה זה על אורגנואידים hOSE שמקורם בשקופיות מרובות תאים היטב, יש חדירת נוגדנים יעילה ביותר עם אות רקע נמוך מאוד.

למרות שרוב אורגנואידי hOSE שהופקו בשיטה זו חסרו ביטוי CDH1, נוצרו כמה אורגנואידים CDH1+ hOSE שהגיעו לגדלים גדולים יותר בהשוואה לאורגנואידים CDH1-hOSE. הביטוי של CDH1 נקשר לפנוטיפים ניאופלסטיים של hOSE 2,35. השחלות המשמשות לבידוד hOSE נתרמו על ידי תורמים טרנסגבריים בריאים בגיל הפריון (27.1 ± 5 שנים). תורמים אלה היו תחת טיפול טסטוסטרון לתקופה של 38 ± 15 חודשים לפני כריתת השחלות. איננו יכולים לשלול את האפשרות שניתן לייחס את תאי CDH1+ hOSE על פני השחלות לטיפול בטסטוסטרון. למרות שטיפול אנדרוגן נקשר לשינויים בשחלות, כגון ביוץ42, היפרפלזיה של אזור קליפת המוח43, ונוקשות קליפת המוח מוגברת44, הפתולוגיה השחלתית הכללית נשארת שפירה תוך שימוש בטסטוסטרון45.

לסיכום, פרוטוקול זה מדגיש את הפוטנציאל של יצירת אורגנואידים תלת-ממדיים hOSE לפענוח שאלות מכניסטיות על התחדשות רקמת השחלות. חשוב לציין כי שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם לאיתור תאים ממאירים הנמצאים בביופסיות שחלות מחולות בסיכון להתפתחות סרטן. באופן קולקטיבי, שיטה זו תומכת ביישומים פוטנציאליים של פלטפורמה חדשנית זו במבחנה הן עבור מחקרים בסיסיים של תפקודי שחלות והן עבור יישומים קליניים עבור טיפולים רפואיים מותאמים אישית.

Disclosures

ללא.

Acknowledgements

ברצוננו להודות לכל המטופלים שתרמו רקמות למחקר הזה, לחברי קבוצת Chuva de Sousa Lopes על דיונים מועילים, ול-I. De Poorter על עיצוב הקריקטורות ששימשו באיור 1. מחקר זה מומן על ידי מועצת המחקר האירופית, מספר מענק ERC-CoG-2016- 725722 (OVOGROWTH) עבור J.S.D.V. ו- S.M.C.d.S.L.; וקרן נובו נורדיסק (reNEW), מענק מספר NNF21CC0073729 עבור J.S.D.V ו-S.M.C.D.S.L.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin/EDTAInvitrogen25200-056
12-well Culture PlateCorning3336Sterile
15 mL tubesGreiner188271Sterile
28cm Cell ScraperGreiner Bio-One541070
50 mL tubesGreiner227261Sterile
60 mm Petri dishGreiner Bio-One628160
A83-01Stem Cell Technologies72024
Advanced DMEM/F12Gibco12634-010
B27 supplement (50x)ThermoFisher Scientific17504-044
Bead bathM714
Bovine serum albumin (BSA)Sigma Aldrich10735086001
Cell Dissociation BufferThermoFisher Scientific13151014
Cryo-container "Mr. Frosty"BD Falcom479-3200
DMEM MediumThermoFisher Scientific41966-029
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 647Invitrogen A-21447
Donkey anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 Invitrogen A-21202
Donkey anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647InvitrogenA-31571
Donkey anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 InvitrogenA-21206
Donkey anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 594 Invitrogen A-21207
Donkey anti-Sheep IgG Alexa Flour 647 Invitrogen A-21448
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFisher ScientificA4736401
Follicle Stimulating Hormone (FSH)Sigma AldrichF4021
Forskolin Peprotech6652995
Glutamax (100x)Gibco35050-038
Goat anti-CDH2 (N/R-cadherin)Santa Cruz SC-1502Mesenchymal Cells; Wong et al 1999 (human)25
Goat anti-PODXL (podocalyxin of GP135)R&D Systems AF1658Apical Polarity; Bryant et al 2014 (canine)21
Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 555InvitrogenA-21434
hEGFR&D Systems263-EG
HEPESGibco15630-056
HydrocortisoneSigma AldrichH0888
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS-X; 100x)ThermoFisher Scientific51500-056
Liberase DH Research GradeSigma AldrichA4736401
Luna-II  cell counterLogos BiosystemsL40001
MatrigelSigma Aldrich354277
McCoy’s 5A Medium ThermoFisher Scientific26600-023
Mouse anti-ITGB1 (integrin beta 1)Santa Cruz SC-53711Basolateral Polarity; Bryant et al 2014 (canine)21
Mouse anti-KRT8 (cytokeratin 8)Santa Cruz SC-101459OSE Cells; Kopper et al 2019 (human)12
Mouse anti-VIM (vimentin)Abcam AB0809Mesenchymal Cells; Abedini et al 2020 (mouse)19
Mycozap Plus-CLLonzaV2A-2011
N-Acetyl-L-cysteineSigma AldrichA9165
NicotinamideSigma AldrichN0636-100G
OVITRELLE-Choriogonadotropin alfa (hCG)MerkG03GA08
Progesterone (P4)Sigma AldrichP8783
Rabbit anti-ACTA2 (alpha smooth muscle actin)Abcam AB5694Mesenchymal Cells; Abedini et al 2020 (mouse)19
Rabbit anti-CDH1 (E-cadherin)Cell Signaling CST 3195SEpithelial Cells; Wong et al 1999 (human)25
Rabbit anti-LGR5Abcam AB75850OSE Progenitor Cells; Flesken-Nikitin et al 2013 (mouse)22
Rabbit anti-YAPCell Signaling 14074SProliferative OSE; Wang et al 2022 (mouse)24
Rat anti-CD44 PE-conjugatedeBioscience12-0441-81OSE Progenitor Cells; Bowen et al 2009 (human)20
Recombinant Human Heregulinβ-1Peprotech100-03
Recombinant Human NogginPeprotech120-10C
Recombinant Human Wnt3aR&D Systems5036-WN-010
Recombinant Rspondin-1  Peprotech120-38
Red blood cells lysis buffereBiosciences00-4333-57
Revitacell Supplement (100x)ThermoFisher ScientificA26445-01
RNAse free DNAseQiagen79254
SB-431542Tocris Bioscience1624/10
Sheep anti-COL1A1 (pro-collagen 1 alpha 1)R&D Systems AF6220Mesenchymal Cells; Hosper et al 2013 (human)23
Y-27632 StemCell Technologies72304
β-Estradiol (E2)Sigma-AldrichE8875
μ-Slide 18-well culture plateIbidi8181Sterile

References

  1. Ng, A., Barker, N. Ovary and fimbrial stem cells: biology, niche and cancer origins. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (10), 625-638 (2015).
  2. Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocr Rev. 22 (2), 255-288 (2001).
  3. Tan, O. L., Fleming, J. S. Proliferating cell nuclear antigen immunoreactivity in the ovarian surface epithelium of mice of varying ages and total lifetime ovulation number following ovulation. Biol Reprod. 71 (5), 1501-1507 (2004).
  4. Carter, L. E., et al. Transcriptional heterogeneity of stemness phenotypes in the ovarian epithelium. Commun Biol. 4 (1), 527 (2021).
  5. Chumduri, C., Turco, M. Y. Organoids of the female reproductive tract. J Mol Med (Berl). 99 (4), 531-553 (2021).
  6. Edmondson, R. J., Monaghan, J. M., Davies, B. R. The human ovarian surface epithelium is an androgen responsive tissue. Br J Cancer. 86 (6), 879-885 (2002).
  7. Karlan, B. Y., Jones, J., Greenwald, M., Lagasse, L. D. Steroid hormone effects on the proliferation of human ovarian surface epithelium in vitro. Am J Obstet Gynecol. 173 (1), 97-104 (1995).
  8. Nakamura, M., Katabuchi, H., Ohba, T., Fukumatsu, Y., Okamura, H. Isolation, growth and characteristics of human ovarian surface epithelium. Virchows Arch. 424 (1), 59-67 (1994).
  9. Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nat Rev Drug Discov. 15 (11), 751-769 (2016).
  10. Del Valle, J. S., Chuva de Sousa Lopes, S. M. Bioengineered 3D ovarian models as paramount technology for female health management and reproduction. Bioengineering (Basel). 10 (7), 832 (2023).
  11. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  12. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
  13. Maenhoudt, N., et al. Developing organoids from ovarian cancer as experimental and preclinical models. Stem Cell Reports. 14 (4), 717-729 (2020).
  14. Senkowski, W., et al. A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids. Dev Cell. 58 (12), 1106-1121.e7 (2023).
  15. Lohmussaar, K., et al. Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids. Nat Commun. 11 (1), 2660 (2020).
  16. Zhang, S., et al. Both fallopian tube and ovarian surface epithelium are cells-of-origin for high-grade serous ovarian carcinoma. Nat Commun. 10 (1), 5367 (2019).
  17. Kessler, M., et al. The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids. Nat Commun. 6, 8989 (2015).
  18. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  19. Abedini, A., Sayed, C., Carter, L. E., Boerboom, D., Vanderhyden, B. C. Non-canonical WNT5a regulates Epithelial-to-Mesenchymal Transition in the mouse ovarian surface epithelium. Sci Rep. 10 (1), 9695 (2020).
  20. Bowen, N. J., et al. Gene expression profiling supports the hypothesis that human ovarian surface epithelia are multipotent and capable of serving as ovarian cancer-initiating cells. BMC Med Genomics. 2, 71 (2009).
  21. Bryant, D. M., et al. A molecular switch for the orientation of epithelial cell polarization. Dev Cell. 31 (2), 171-187 (2014).
  22. Flesken-Nikitin, A., et al. Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche. Nature. 495 (7440), 241-245 (2013).
  23. Hosper, N. A., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition in fibrosis: collagen type I expression is highly upregulated after EMT, but does not contribute to collagen deposition. Exp Cell Res. 319 (19), 3000-3009 (2013).
  24. Wang, J., et al. Selective YAP activation in Procr cells is essential for ovarian stem/progenitor expansion and epithelium repair. Elife. 11, e75449 (2022).
  25. Wong, A. S., et al. Constitutive and conditional cadherin expression in cultured human ovarian surface epithelium: influence of family history of ovarian cancer. Int J Cancer. 81 (2), 180-188 (1999).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J., Nachtigal, M. W. Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients. Nat Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).
  28. Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Res. 19 (2), 156-172 (2009).
  29. Miettinen, P. J., Ebner, R., Lopez, A. R., Derynck, R. TGF-beta induced transdifferentiation of mammary epithelial cells to mesenchymal cells: involvement of type I receptors. J Cell Biol. 127 (6 Pt 2), 2021-2036 (1994).
  30. Danielpour, D., et al. Sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (SELISAs) quantitate and distinguish two forms of transforming growth factor-beta (TGF-beta 1 and TGF-beta 2) in complex biological fluids. Growth Factors. 2 (1), 61-71 (1989).
  31. Oida, T., Weiner, H. L. Depletion of TGF-beta from fetal bovine serum. J Immunol Methods. 362 (1-2), 195-198 (2010).
  32. Halder, S. K., Beauchamp, R. D., Datta, P. K. A specific inhibitor of TGF-beta receptor kinase, SB-431542, as a potent antitumor agent for human cancers. Neoplasia. 7 (5), 509-521 (2005).
  33. Wang, J., Wang, D., Chu, K., Li, W., Zeng, Y. A. Procr-expressing progenitor cells are responsible for murine ovulatory rupture repair of ovarian surface epithelium. Nat Commun. 10 (1), 4966 (2019).
  34. Kawata, M., et al. Polarity switching of ovarian cancer cell clusters via SRC family kinase is involved in the peritoneal dissemination. Cancer Sci. 113 (10), 3437-3448 (2022).
  35. Davies, B. R., Worsley, S. D., Ponder, B. A. Expression of E-cadherin, alpha-catenin and beta-catenin in normal ovarian surface epithelium and epithelial ovarian cancers. Histopathology. 32 (1), 69-80 (1998).
  36. Skory, R. M., Xu, Y., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Engineering the ovarian cycle using in vitro follicle culture. Hum Reprod. 30 (6), 1386-1395 (2015).
  37. Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nat Cell Biol. 21 (8), 1041-1051 (2019).
  38. Phan, N., et al. A simple high-throughput approach identifies actionable drug sensitivities in patient-derived tumor organoids. Commun Biol. 2, 78 (2019).
  39. Ducie, J., et al. Molecular analysis of high-grade serous ovarian carcinoma with and without associated serous tubal intra-epithelial carcinoma. Nat Commun. 8 (1), 990 (2017).
  40. Lee, Y., et al. A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube. J Pathol. 211 (1), 26-35 (2007).
  41. Rezanejad, H., Lock, J. H., Sullivan, B. A., Bonner-Weir, S. Generation of pancreatic ductal organoids and whole-mount immunostaining of intact organoids. Curr Protoc Cell Biol. 83 (1), e82 (2019).
  42. Asseler, J. D., et al. One-third of amenorrheic transmasculine people on testosterone ovulate. Cell Rep Med. 5 (3), 101440 (2024).
  43. Ikeda, K., et al. Excessive androgen exposure in female-to-male transsexual persons of reproductive age induces hyperplasia of the ovarian cortex and stroma but not polycystic ovary morphology. Hum Reprod. 28 (2), 453-461 (2013).
  44. De Roo, C., et al. Texture profile analysis reveals a stiffer ovarian cortex after testosterone therapy: a pilot study. J Assist Reprod Genet. 36 (9), 1837-1843 (2019).
  45. Grimstad, F. W., et al. Ovarian histopathology in transmasculine persons on testosterone: A multicenter case series. J Sex Med. 17 (9), 1807-1818 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE210

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved