JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מציג צינור מקיף לניתוח דגימות המתקבלות מלבבות אנושיים המשתרעים בקנה מידה מיקרוסקופי ומקרוסקופי.

Abstract

מחקר מפורט של לבבות אנושיים שאינם נכשלים ונדחו להשתלה מספק הזדמנות ייחודית לבצע ניתוחים מבניים בקנה מידה מיקרוסקופי ומקרוסקופי. טכניקות אלה כוללות ניקוי רקמות (הדמיה תלת-ממדית תלת-ממדית (3D) של איברים שסולקו ממס וצביעה אימונוהיסטוכימית. הליכי בדיקה מזוסקופית כוללים דיסקציה סטריאוסקופית וסריקה טומוגרפית מיקרו-ממוחשבת (CT). הליכי בדיקה מקרוסקופיים כוללים דיסקציה גסה, צילום (כולל אנאגליפים ופוטוגרמטריה), CT והדפסה תלת ממדית של הלב המנותח פיזית או כמעט מלאה. לפני בדיקה מקרוסקופית, ניתן לבצע קיבוע זילוח לחץ כדי לשמור על הארכיטקטורה התלת-ממדית ועל המורפולוגיה הרלוונטית מבחינה פיזיולוגית של הלב. היישום של טכניקות אלה בשילוב לחקר הלב האנושי הוא ייחודי וחיוני להבנת הקשר בין תכונות אנטומיות מובהקות כגון כלי דם כליליים ועצבוב שריר הלב בהקשר של ארכיטקטורה תלת ממדית של הלב. פרוטוקול זה מתאר בפירוט את המתודולוגיות וכולל תוצאות מייצגות כדי להמחיש את ההתקדמות במחקר האנטומיה של הלב האנושי.

Introduction

מכיוון שתפקוד עוקב אחר צורה, הבנת הארכיטקטורה של הלב היא בסיסית להערכת הפיזיולוגיה שלו. למרות שמחקרים רבים גילו אנטומיה לבבית ממיקרו למאקרו 1,2,3, שאלות רבות נותרו בלתי פתורות, במיוחד אלה הקשורות לאנטומיה של הלב האנושי. הסיבה לכך היא שמחקרים בסיסיים שהתמקדו באנטומיה פונקציונלית השתמשו בדרך כלל בלבבות בעלי חיים 4,5,6, אשר לעתים קרובות נבדלים מלבבות אנושיים 1,7,8. יתר על כן, כל מחקר בנפרד, אפילו אלה המשתמשים בדגימות לב אנושיות, נוטים להתמקד במבנים ספציפיים מאוד, מה שמקשה על יישום הממצאים בהקשר של הלב כולו. הדבר נכון שבעתיים אם המבנים הממוקדים נמצאים במיקרו או במזוסקאלה, כגון perinexus9 ומקלעת גנגליון10.

בהקשר זה, מחקר מבני מערכתי של הלב האנושי שנדחה להשתלה מספק הזדמנות ייחודית ונדירה לקבל אטלס מקיף של מבני לב הממוקדים בסקאלות מיקרוסקופיות ומקרוסקופיות11. פרוטוקולי בדיקה מיקרוסקופיים כוללים ניקוי רקמות (הדמיה תלת-ממדית תלת-ממדית (3D) של איברים שסולקו ממס, iDISCO+)12,13 וצביעה אימונוהיסטוכימית. פרוטוקולי בדיקה מזוסקופית כוללים דיסקציה סטריאוסקופית, צילום מאקרו וסריקה טומוגרפית מיקרו-ממוחשבת (CT). פרוטוקולי בדיקה מקרוסקופיים כוללים דיסקציה גסה14, צילום (כולל אנאגליפים ופוטוגרמטריה) 15,16,17, CT, דיסקציה וירטואלית 18, והדפסה תלת ממדית של הלב המנותח פיזית או כמעט שלמה17. כהכנה לבדיקה מקרוסקופית, מתבצע קיבוע זילוח לחץ כדי לשמור על הארכיטקטורה התלת-ממדית והמורפולוגיה הרלוונטית פיזיולוגית של הלב 14,19,20,21. היישום המשולב של טכניקות אלה הוא ייחודי וחיוני כדי להתאים תכונות אנטומיות שונות בהקשר של ארכיטקטורת 3D של הלב האנושי.

מכיוון שההזדמנות לקבל דגימת לב אנושי לא פתולוגית מוגבלת ביותר, גישה רב-ממדית המתוארת כאן ממקסמת את השימוש בדגימה. על ידי יישום הליכים שונים המתוארים להלן, תוצאות מייצגות ימחישו לקורא כיצד ניתן להשתמש בממצאים למטרות רבות, כולל גילוי במחקר מדעי11 (ניתוחים מקיפים של עצבוב לבבי, התפלגות מקלעי גנגליון), שיפור פרוצדורות קליניות (סימולציה לגישות כירורגיות והתערבותיות) וחינוך אנטומי (הדגמה תלת ממדית אמיתית של אנטומיה לבבית).

Protocol

מחקר זה השתמש בדגימות רקמה לא מזוהות שנאספו מלבבות אנושיים של תורמים שאינם נכשלים ואושר על ידי מועצת הסקירה המוסדית של אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס (UCLA). דגימות נלקחו מלבבות לא כושלים שנדחו להשתלה. הלבבות היו מחוררים בלחץ, קובעו ב-4% פרפורמלדהיד (PFA), וצולמו לפני עיבוד רקמות בשיטות הבאות. איור 1 מסכם את תרשים הזרימה של סדר המחקר. פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. בדיקה בקנה מידה מיקרו

  1. ניקוי רקמות באמצעות הדמיה תלת-ממדית התומכת בהתוויה חיסונית שונה של איברים מנוקים בממס (iDISCO+).
    1. יש לנתח רקמה מקובעת 4% PFA עם אזמל כדי להתאים לתא 3 מ"מ × 16 מ"מ × 25 מ"מ למיקרוסקופ קונפוקלי. כדי לצלם רקמות עבות יותר, ניתן לערום תאים ו/או ספייסרים נוספים על השקופית.
    2. יש לייבש דגימות באמצעות סדרת מתנול מדורגת (MeOH) (20%, 40%, 60%, 80% ו-100% MeOH ב-H2O שעבר דה-יוניזציה [vol/vol]) למשך שעה אחת כל אחת בטמפרטורת החדר (RT) עם תסיסה.
    3. יש לשטוף עם 100% MeOH למשך שעה אחת ב-RT ולטבול ב-66% דיכלורומתאן/33% MeOH ב-RT עם תסיסה למשך הלילה.
    4. למחרת, יש לשטוף פעמיים ב-MeOH (100%) למשך שעה אחת ב-RT, לצנן ב-4°C ולטפל עם 5% H2O2 ב-MeOH (vol/vol) למשך הלילה ב-4°C.
    5. יש להחזיר לחות עם סדרת MeOH מדורגת (80%, 60%, 40% ו-20% MeOH) ולשטוף ב-PBS של 0.01mol/L למשך שעה אחת כל אחד ב-RT עם תסיסה.
    6. שטפו את הרקמות פעמיים ב-PBS של 0.01mol/L עם 0.2% Triton X-100 למשך שעה אחת ב-RT.
    7. יש להתכונן לתיוג חיסוני על-ידי חדירה ב-PBS של 0.01mol/L, 20% dimethyl sulfoxide (DMSO), 0.2% Triton X-100 ו-0.3mol/L גליצין למשך יומיים ב-37°C עם תסיסה.
    8. חסום פנימה PBS 0.01mol/L עם 10% DMSO, 0.2% Triton X-100 וסרום חמור רגיל 5% למשך יומיים נוספים ב-37°C עם תסיסה.
    9. תווית עם נוגדן ראשוני התואם ל-MeOH מצומד לפלואורופורים מדוללים ב-PBS של 0.01mol/L עם 10 מ"ג/מ"ל הפרין (PTwH), 0.2% Tween-20, 5% DMSO ו-3% סרום חמור רגיל למשך 3-4 ימים ב-37°C עם תסיסה.
    10. לחדש את פתרון נוגדנים לדגור עוד 3-4 ימים ב 37 ° C עם תסיסה.
    11. לאחר דגירה של שבוע בתמיסת נוגדנים ראשונית, יש לשטוף 4 עד 5 פעמים ב-PTwH למשך הלילה ב-RT.
    12. לדגור עם נוגדן משני מצומד פלואורופורים מדולל PTwH, 3% סרום חמור רגיל במשך 3 ימים ב 37 ° C עם תסיסה.
    13. לחדש את פתרון נוגדנים משני לדגור עוד 3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה.
    14. לאחר דגירה של 6 ימים בתמיסת נוגדנים משנית, יש לשטוף ב-PTwH 4-5 פעמים למשך הלילה ב-RT.
    15. התייבש עם סדרת MeOH מדורגת (20%, 40%, 60%, 80%, 100% ו-100% MeOH). ניתן לאחסן את הדגימה למשך הלילה ב- RT.
    16. דגרו ב-66% דיכלורומתאן / 33% MeOH במשך 3 שעות ב-RT עם תסיסה.
    17. יש לשטוף פעמיים ב-100% דיכלורומתאן במשך 15 דקות ב-RT בעצבנות.
    18. לדגור ולאחסן דגימות באתר בנזיל. מלאו את הצינורית כדי למזער את האוויר מחמצון הדגימה.
  2. הדמיה של דגימה מנוקה רקמות
    1. הדביקו תא המכיל דבק למגלשה ומרחו לק מסביב להיקף החדר. עבור רקמות עבות יותר, תאים נוספים ו / או ספייסרים עשויים להיות מוערמים על המגלשה.
    2. מניחים רקמות מנוקות בתא, ממלאים באתר בנזיל ומורחים כיסוי.
    3. יש למרוח לק סביב הכיסוי ליצירת אטימה.
    4. קבל תמונות בסריקת אריחים ובערימת Z באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ישר לסריקת לייזר עם עדשת 5x או 10x לתמונה בעומק עד למרחק העבודה של העדשה.
    5. תמונה ברזולוציה של 1024 x 1024 באמצעות קווי לייזר המתאימים לספקטרום הפליטה של פלואורופורים בשימוש. אוטופלואורסצנטיות שרירים נראית באמצעות קו לייזר 488 ננומטר.
    6. ודא שגודל המדרגה של ציר z תואם לדגימת Nyquist בהתבסס על הצמצם המספרי של המטרה שצוינה11.
    7. תפר תמונות והשתמש בתוכנה להדמיה תלת-ממדית.
    8. צור איורים באמצעות תמונות הקרנה בעוצמה מרבית (MIP) של ערימות Z עבור ערוצים בודדים וערוצים ממוזגים (איור 2).
  3. אימונוהיסטוכימיה
    הערה: לאחר שהרקמה משובצת פרפין22, ההליך הבא משמש ליצירת שקופיות למחקר אימונוהיסטוכימי.
    1. הכנת פתרון התאמת אינדקס שבירה (RIMS).
      1. הכינו חיץ פוספט 0.1mol/L על ידי הוספת 10.9 גרם של Na2HPO4 (נטול מים) ו-3.1 גרם של NaH2PO4 (מונוהידראט) ל-H2O שעבר דה-יוניזציה לנפח כולל של 1 ליטר (pH 7.4). סנן וחטא את הפתרון ואחסן אותו ב- RT.
      2. לדלל את מאגר הפוספט ל 0.02 mol/L.
      3. יש להמיס את ההיסטודנץ ב-30 מ"ל של חיץ פוספט 0.02mol/L על ידי ערבוב התמיסה למשך 10 דקות עם מוט ערבוב מגנטי בבקבוק האחסון הסופי שניתן לאטום כדי למזער אידוי וזיהום.
      4. הוסף נתרן אזיד לריכוז כולל של 0.01% (w/v) וכוונן את ה- pH ל- 7.5 עם NaOH.
      5. כוונן את RI על ידי שינוי הריכוז הסופי של Histodenz.
      6. אחסן את ה- RIMS ב- RT למשך חודשים. יש להשליך אם צוין זיהום מיקרוביאלי.
        הערה: אין לבצע אוטוקלאבים של תמיסות המכילות נתרן אזיד.
    2. הכנת שקופיות למחקר אימונוהיסטוכימי
      1. צור מקטעים בעובי 5 מיקרומטר עם מיקרוטום. החל מקטע רקמות על שקופיות טעונות.
      2. מוציאים פרפין על ידי דגירה על המגלשות ב->75% קסילן למשך 10 דקות. העבר שקופיות למכל שני עם קסילן למשך 10 דקות נוספות.
      3. הסר קסילן על ידי טבילת המגלשות ב-100% EtOH למשך 10 דקות, ולאחר מכן ב-95% EtOH למשך 5 דקות ו-70% EtOH למשך 5 דקות.
      4. שטפו את המגלשות עם H2O נטול יונים, במשך 5 דקות.
      5. יש לטבול את השקופיות במאגר אחזור האנטיגן למשך 25 דקות בטמפרטורה של 90-95 מעלות צלזיוס.
      6. אפשר למיכל להתקרר ל- RT למשך שעה אחת עם תסיסה.
      7. יש לטבול את המגלשות במאגר השריה (0.01 mol/L PBS + 0.4% Triton X-100) למשך 30 דקות ב-4°C.
      8. הקיפו את הרקמה בעט PAP. הוסף PBS לכל שקופית והנח אותה בתא לח כדי למנוע התייבשות.
      9. שטפו שקופיות עם PBS ב- RT עם תסיסה במשך 5 דקות.
      10. חסום עם חיץ חוסם (0.01 mol/L PBS + 10% סרום חמור + 0.1% TX-100) למשך שעה אחת עם תסיסה.
      11. יש לדגור עם נוגדן ראשוני המדולל בחיץ חוסם למשך הלילה ב-4°C.
      12. למחרת, אפשר לשקופיות להתחמם ל- RT למשך 15 דקות.
      13. שטפו את המגלשות 3 פעמים עם PBS 0.01mol/L + 0.2% TritonX-100 למשך 5 דקות.
      14. לדגור עם נוגדן משני מדולל בחיץ חוסם במשך 1 שעה ב RT עם תסיסה.
      15. שטפו את המגלשות 3 פעמים עם PBS 0.01mol/L + 0.2% TritonX-100 למשך 5 דקות.
      16. שטפו את המגלשות 3 פעמים עם PBS 0.01mol/L למשך 5 דקות.
      17. יש להניח טיפה אחת של RIMS עם טפטפת ולמרוח כיסוי.
      18. יש למרוח לק מסביב למכסה כדי ליצור את האטם.
      19. כבקרה שלילית, הפעל דגימה ללא הנוגדן העיקרי כדי להדגים היעדר כתמים ספציפיים.
    3. הדמיה של שקופיות מוכתמות חיסון
      1. צלם את השקופיות במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר עם עדשות אובייקטיביות 10x, 20x ו- 40x.
      2. תמונה ברזולוציה של 1024 x 1024 באמצעות קווי לייזר המתאימים לספקטרום הפליטה של הנוגדנים המשניים המשמשים.
      3. צור איורים באמצעות תמונות הקרנה בעוצמה מרבית (MIP) של ערימות Z עבור ערוצים בודדים וערוצים ממוזגים (איור 3).

2. בדיקת מזו-סולם

  1. דיסקציה סטריאוסקופית
    1. בצע דיסקציות עדינות המתמקדות במבנים זעירים או דקים, כגון צומת אטריובנטריקולרי, עורק קשריות אטריובנטריקולרי ומקלעת עצב הלב (תת-מילימטר עד מילימטר בקנה מידה) באמצעות מנורת שולחן מגדלת עם מהדק, טלסקופים כירורגיים או סטריאומיקרוסקופ.
  2. סריקת Micro-CT
    הערה: הדמיית CT מבוצעת לאחר זילוח וקיבוע לחץ ובכל שלבי הדיסקציה באמצעות טומוגרפיית פליטת מיקרו-פוזיטרונים (PET)/סורק CT (איור 4).
    1. חממו את מקור הרנטגן של CT למשך 25 דקות לפני הדמיית הדגימה.
    2. הניחו את דגימת הלב על מיטת הסורק.
    3. הזז את מיטת הסורק למצב אופקי של 544 מ"מ ולמיקום אנכי של 14 מ"מ כדי למרכז את הלב בשדה הראייה של CT (FOV).
    4. קבל תמונת CT ב- 80 kVp, 150 μA, עם 720 הקרנות בזמן סריקה של דקה אחת ברזולוציה מרחבית של 200 מיקרומטר.
    5. שחזר את נתוני ה- CT עם שדה ראייה של 12 ס"מ x 12 ס"מ x 10 ס"מ ומטריצה של 600 x 600 x 500 ווקסלים, ושמור כקובץ DICOM.

3. בחינה בקנה מידה מאקרו

  1. זילוח לחץ וקיבוע
    הערה: המחברים משנים טכניקות זילוח וקיבוע לחץ שתוארו קודם לכן ומיישמים אותן על לבבות אנושיים שאינם נכשלים שנדחו להשתלה 14,19,20,21.
    1. השתמש משאבות זרימה גבוהה עבור קיבוע זילוח. השתמש 100% אתנול14, 4% PFA, או 10% פורמלין עבור קיבוע.
      הערה: הלב מתאושש עם אבי העורקים העולה, תא המטען הריאתי, וגם הוורידים הוורידים הריאתיים שנכרתו בצורה דיסטלית ככל האפשר ונמסרו בתמיסה23 של אוניברסיטת ויסקונסין.
    2. השתמש בשתי צינוריות כירורגיות 20-24 Fr לזילוח לב ימין ושמאל. לזילוח הלב הימני, יש לערבב את הווריד הנבוב העליון, ולהניח פתח אוורור בתא המטען הריאתי או בעורק הריאה עם מזרקי פלסטיק בגודל 12-30 מ"ל חתוכים למחצה עם קצוות Luer-Lock המחוברים לסטופקוקים תלת-כיווניים.
    3. הסתירו את הווריד הנבוב התחתון ואת עורק הריאה השני עם חוט לאחר הנחת מזרק פלסטיק נעול חצי חתוך בגודל המתאים או צינור צנטריפוגה 1.5-5.0 מ"ל.
      1. לזילוח מקדים של הלב השמאלי, יש להצמיד את אחד הוורידים הריאתיים ולהניח פתח אוורור בקצה החתוך הדיסטלי של אבי העורקים עם מזרקי פלסטיק בגודל 12-30 מ"ל חתוכים למחצה עם קצוות Luer-Lock המחוברים לסטופקוקים תלת-כיווניים.
      2. לזילוח מדרדר של הלב השמאלי, יש לקנח את אחד מענפי קשת אבי העורקים ולהניח פתח אוורור בענף אחר של קשת אבי העורקים. מניחים את קצות הצינוריות בשני החדרים.
    4. הסתר פתחי כלי אחרים עם חוט לאחר החדרת מזרק פלסטיק נעול חצי חתוך בגודל המתאים או צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5-5.0 מ"ל. השתמש בגזה דקה כדי לכסות את החלק המחדיר של המזרקים/ צינורות/ צינוריות כדי למנוע דליפה והחלקה. תקן דליפות גדולות באמצעות תפר, פסים או גושים. דליפות קטנות מותרות.
    5. להשעות את הלב במיכל פלסטיק.
    6. חברו צינורות פלסטיק רכים 22-24 Fr לכל צינורית והכניסו את הקצה השני של הצינור למיכל המלא בקיבוע.
    7. יש להזרים קיבוע דרך מעגלי הלב הימני והשמאלי באמצעות משאבה בעלת זרימה גבוהה המוגדרת בכ-100-300 מ"ל/דקה עבור לב ימין ו-200-400 מ"ל/דקה עבור לב שמאל כדי להשיג כ-20 מ"מ כספית בחדר הימני ו-80 מ"מ כספית בחדר השמאלי, בהתאמה.
    8. יש לשמור על זילוח בטמפרטורה של 4°C למשך 24 שעות.
    9. שטפו את הלב עם PBS 0.01 mol/L במשך 30 דקות עם תסיסה ארבע פעמים.
    10. יש לאחסן את הלב ב-0.01 mol/L PBS/0.02% נתרן אזיד ב-4°C.
      הערה: קיבוע זילוח לחץ יעיל רק ללב רענן, לא ללב שהחלים מגופה חנוטה.
  2. דיסקציה גסה
    1. בצע דיסקציה פרוגרסיבית עם הקלטות מצולמות בכל שלב של הדיסקציה.
    2. כדי לשמור על רלוונטיות קלינית, הקדישו תשומת לב מיוחדת כדי למנוע עיוות/עיוות של מבנים כלשהם כדי לשמור על המורפולוגיה הפיזיולוגית של הלב.
    3. מבני יעד תמונה באמצעות אוריינטציה רלוונטית קלינית, כגון כיוון אלכסוני קדמי ימני.
  3. צילום
    1. הניחו את הלב המחורר בלחץ וקבוע על חצובה עם פלטפורמה המורכבת על שיניים מרובות ויכולת סיבוב של 360o.
    2. צלם את הלב באמצעות מצלמת רפלקס דיגיטלית בעלת עדשה יחידה (איור 5)24 תוך שימוש במספר לוחות אור של דיודות פולטות אור המוצבים על מעמדי C ובד רקע שחור רחב של שמיכת פוך.
    3. צלם באמצעות עדשה עם אורך מוקד ארוך (200 מ"מ) למרחק עבודה של 4-6 רגל כדי למזער עיוות של נושא הצילום14.
  4. אנאגליפים
    1. להצגת תמונות אנאגליפיות, בנו מחדש זוג תצלומים או תמונות שעובדו בנפח מערכות נתונים של CT עם הפרש של 10° בזווית הסיבוב במישור האופקי.
    2. המר קבוצה של תמונות דו-ממדיות (דו-ממדיות) אלה, המכונות סטריאוגרמה, לאנגליפים באמצעות תוכנה חופשית16.
    3. כדי להציג אנאגליף, השתמש במשקפיים אדומים/ציאן.
  5. פוטוגרמטריה
    הערה: פוטוגרמטריה היא המדע היישומי של יצירת שחזור תלת-ממדי של פני השטח מתצלומים דו-ממדיים מרובים שצולמו בזוויות משתנות17.
    1. השהה את הדגימה במעמד C או הנח אותה על שולחן הסיבוב כדי לקבל מאות תמונות רב-כיווניות באמצעות טלפון חכם.
    2. צור את מודל התלת-ממד בפורמט FBX באמצעות תוכנה זמינה מסחרית.
  6. סריקת CT
    הערה: ניתן לבצע סריקת CT לאחר זילוח וקיבוע לחץ ובכל שלב של דיסקציה.
    1. השהה את דגימת הלב ממוט הממוקם על פני החלק העליון של המיכל. כדי למנוע מהלב להתנדנד במהלך הסריקה, תמכו בבסיס הלב עם שיניים מפלסטיק קבועות בתחתית המיכל. לפיכך, האוויר ישמש ניגוד שלילי.
    2. בצע את סריקת ה- CT באמצעות סורק CT מרובה גלאים זמין מסחרית עם הפרמטרים הבאים: מתח צינור של 120 קילו וולט, זרם צינור של 800-900 mA וסיבוב גנטרי של 280 מילישניות. אורך המינון הוא בדרך כלל 500-1200 mGy.cm.
    3. בנייה מחדש של נתוני תמונה צירית באמצעות הפרמטרים הבאים: עובי חתך, 0.6 מ"מ; מרווח מצטבר, 0.3 מ"מ; שדה ראייה, קטן ככל האפשר (בדרך כלל 100-200 מ"מ); ומטריצה, 512 × 512.
  7. דיסקציה וירטואלית
    1. נתח את תמונות סריקת ה- CT באמצעות תוכנה זמינה מסחרית ליצירת תמונות דיסקציה וירטואליות.
      הערה: דיסקציה וירטואלית היא שינוי של תהליך עיבוד נפח שבו המוקד מועבר לדפנות חדרי הלב וכלי הדם18. בתהליך זה, הסף הידני מסיר למעשה את התא המשופר מערכות הנתונים המקוריות.
    2. דמיינו את הקירות, הספטה והשסתומים שאינם משופרים באמצעות דיסקציה וירטואלית כדי להפיק תמונות הדומות לדיסקציה גסה. שלא כמו דיסקציה גסה של דגימות הלב, המישורים החתוכים במהלך דיסקציה וירטואלית הם כמעט בלתי מוגבלים. כמעט כל תצוגה ניתן לשחזר כדי לדמיין את המבנים של עניין לפי הצורך.
  8. הדפסה תלת מימדית
    1. פתח את הקובץ התואם של דגימת הלב בתוכנת מדפסת תלת-ממד.
    2. השתמש בפרופיל של 0.10 מ"מ פירוט מהיר עבור הגדרות ההדפסה במדפסת התלת-ממד והפחת את מהירות ההדפסה ל- 20 מ"מ לשנייה. אפשר צור חומר תמיכה.
    3. השתמש בפרופיל של נימה TPU עבור "הגדרות נימה" במדפסת 3D.
    4. השתמש בפרופיל של זרבובית Prusa MK4 Input Shaper 0.4 המקורית עבור "הגדרות מדפסת" במדפסת.
    5. לאחר השלמת החיתוך, שמור את קובץ BGCODE בכונן הבזק מסוג USB להדפסה תלת-ממדית.
    6. השתמש בחוט הלהט TPU בקוטר 1.75 מ"מ להדפסה תלת-ממדית של דגימת הלב האנושי. לפני הדפסה תלת-ממדית, יבש את חוט הלהט TPU למשך 6 שעות באמצעות מייבש נימה.
    7. כדי להפחית את מתח הנימה במהלך הדפסה תלת-ממדית, הנח את סליל הנימה על מחזיק סליל עם מיסב מובנה כדי להקל על סיבוב סליל החוט. בצע הדפסה בתלת-ממד באמצעות מדפסת תלת-ממד מסחרית עם יריעת פלדה בציפוי אבקה.
    8. הסר בזהירות חומרי תמיכה עם השלמת ההדפסה בתלת-ממד.

תוצאות

בדיקות מיקרוסקליות
יישום ניקוי רקמות מאפשר הדמיה של נפחים גדולים יותר של רקמה בתלת מימד באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. בלב, ניתן לדמיין גרעינים המכילים תאי עצב לבביים ואת התבנית העצבית של עצבוב שריר הלב (איור 2). איור 3 מראה תמונה קונפוקלית של שריר ה?...

Discussion

המחקר הנוכחי מדגים את הצינור המקיף לניתוח דגימות המתקבלות מלבבות אנושיים שלמים. תוצאות מייצגות מראות בדיקות אנטומיות בקנה מידה זעיר עד מאקרו המבוצעות באופן שגרתי עבור לב יחיד. מכיוון שדגימת לב אנושית היא יקרה ביותר, גישה רב-ממדית היא אידיאלית ויעילה כדי לא לבזבז חלקים מהדגימה על ידי יישו?...

Disclosures

ללא.

Acknowledgements

אנו מודים לאנשים שתרמו מגופם לקידום החינוך והמחקר. אנו אסירי תודה לקרן OneLegacy, שהיוותה את הבסיס להשגת לבבות תורמים למחקר. אנו אסירי תודה גם לאנתוני א. סמיתסון וארווין רוק-ורדפלור ממרכז הדימות התרגומי של UCLA (המחלקה לרדיולוגיה) על תמיכתם ברכישת נתוני CT. פרויקט זה נתמך על ידי פרויקט אמארה יד באוניברסיטת UCLA. אנו מודים לד"ר Kalyanam Shivkumar ו- Olujimi A. Ajijola על הקמה ותחזוקה של צינור לב אנושי למחקר. אנו מעריכים את מנהלת תפעול המחקר שלנו, עמיקשה ס. גנדי על מסירותה לתמיכה בפרויקטים שלנו. עבודה זו התאפשרה הודות לתמיכה של מענקי NIH OT2OD023848 & P01 HL164311 ומענק Leducq 23CVD04 לקליאנם שיבקומר, פרס פיתוח הקריירה של איגוד הלב האמריקאי 23CDA1039446 ל-PH, ופרויקט אמארה-יד של UCLA (https://www.uclahealth.org/medical-services/heart/arrhythmia/about-us/amara-yad-project). סורק המיקרו-PET/CT GNEXT ששימש במחקר זה מומן על ידי מענק מכשור משותף של NIH למחקר בבעלי חיים (1 S10 OD026917-01A1).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1x Phosphate buffered salineSigma-AldrichP3813
3D ViewerMicrosoft
647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch Laboratories711-605-152
647 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgGJackson ImmunoResearch Laboratories713-605-147
AF Micro-NIKKOR 200 mm f/4D IF-ED lensNikon
Anti-Actin, α-Smooth Muscle - Cy3 antibodySigma-AldrichC6198
Antigen Retrieval Buffer (100x EDTA Buffer, pH 8.0)Abcamab93680
Anti-PGP9.5 (protein gene product 9.5)Abcamab108986
Anti-TH (tyrosine hydrox ylase)Abcamab1542
Anti-VAChT (vesicular acetylcholine transporter)Synaptic Systems139 103
Benzyl etherSigma-Aldrich108014
Bovine serum albuminSigma-AldrichA4503-10G
Cheetah 3D printer filament (95A), 1.75 mmNinjaTek
Coverslip, 22 mm x 30mm, No. 1.5VWR48393 151
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch Laboratories711-165-152
DichloromethaneSigma-Aldrich270997-100ML
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD8418-500ML
Ethanol, 100%Decon laboratories2701
GlycineSigma-AldrichG7126-500G
GNEXT PET/CTSOFIE Biosciences
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosaSigma-AldrichH3149-50KU
HistodenzSigma-AldrichD2158-100G
Hydrogen peroxide solutionSigma-AldrichH1009-500ML
Imaging softwareZeissZEN (black edition)
Imaging softwareOxford InstrumentsImaris 10
iSpacerSunjin LabsiSpacer 3mm
KIRI EngineKIRI Innovation
Laser scanning confocal microscopeZeissLSM 880
LEAD-2 - Vertical & Multi-channels Peristaltic PumpLONGER
Lightview XL Brightech
Methanol (Certified ACS)Fischer ScientificA412-4
Nikon D850Nikon
NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4NinjaTek
Normal donkey serumJackson ImmunoResearch Laboratories017-000-121
Original Prusa MK4 3D printerPrusa Research
PAP penAbcamab2601
Paraformaldehyde, 32%Electron Microscopy Sciences15714-S
PolycamPolycam
Primary antibody
PrusaSlicer 2.7.1Prusa Research
SARA-Enginepita4 mobile LLC
ScaniverseNiantic
Secondary antibody
SlowFade Gold Antiface MountantInvitrogenS36936
Sodium azide, 5% (w/v)Ricca Chemical Company7144.8-32
SOMATOM Definition ASSiemens Healthcare
Standard Field Surgi-Spec Telescopes, Designs for Vision
Stereomicroscope System SZ61OLYMPUS
StereoPhoto MakerFree ware developed by Masuji Suto
Superfrost Plus Microscope Slides, PrecleanedFisher Scientific12-550-15
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100ML
XyleneSigma-Aldrich534056-4L
Ziostation2Ziosoft, AMIN

References

  1. Tawara, S. Das reizleitungssystem des säugetierherzens. Eine anatomisch-histologische studie über das atrioventrikularbündel und die purkinjeschen fäden. Jena: Gustav fischer. , (1906).
  2. Stephenson, R. S., et al. High-resolution 3-dimensional imaging of the human cardiac conduction system from microanatomy to mathematical modeling. Sci Rep. 7 (1), 7188 (2017).
  3. Kawashima, T., Sato, F. First in situ 3D visualization of the human cardiac conduction system and its transformation associated with heart contour and inclination. Sci Rep. 11 (1), 8636 (2021).
  4. Bojsen-Moller, F., Tranum-Jensen, J. Whole-mount demonstration of cholinesterase-containing nerves in the right atrial wall, nodal tissue, and atrioventricular bundle of the pig heart. J Anat. 108, 375-386 (1971).
  5. Zhao, Y., et al. Ganglionated plexi and ligament of marshall ablation reduces atrial vulnerability and causes stellate ganglion remodeling in ambulatory dogs. Heart Rhythm. 13 (10), 2083-2090 (2016).
  6. Chung, W. H., et al. Ischemia-induced ventricular proarrhythmia and cardiovascular autonomic dysreflexia after cardioneuroablation. Heart Rhythm. 20 (11), 1534-1545 (2023).
  7. Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: Comparisons with normal human cardiac structure. J Anat. 193, 105-119 (1998).
  8. Saburkina, I., Pauziene, N., Solomon, O. I., Rysevaite-Kyguoliene, K., Pauza, D. H. Comparative gross anatomy of epicardiac ganglionated nerve plexi on the human and sheep cardiac ventricles. Anat Rec (Hoboken). 306 (9), 2302-2312 (2023).
  9. Hoagland, D. T., Santos, W., Poelzing, S., Gourdie, R. G. The role of the gap junction perinexus in cardiac conduction: Potential as a novel anti-arrhythmic drug target. Prog Biophys Mol Biol. 144, 41-50 (2019).
  10. Aksu, T., Gopinathannair, R., Gupta, D., Pauza, D. H. Intrinsic cardiac autonomic nervous system: What do clinical electrophysiologists need to know about the "heart brain". J Cardiovasc Electrophysiol. 32 (6), 1737-1747 (2021).
  11. Hanna, P., et al. Innervation and neuronal control of the mammalian sinoatrial node a comprehensive atlas. Circ Res. 128 (9), 1279-1296 (2021).
  12. Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nature Communications. 10, 1944 (2019).
  13. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  14. Mcalpine, W. Heart and coronary arteries: An anatomical atlas for clinical diagnosis, radiological investigation, and surgical treatment. Springer-verlag. , (1975).
  15. Mori, S., Shivkumar, K. Stereoscopic three-dimensional anatomy of the heart: Another legacy of dr. Wallace a. Mcalpine. Anat Sci Int. 96 (3), 485-488 (2021).
  16. Izawa, Y., Nishii, T., Mori, S. Stereogram of the living heart, lung, and adjacent structures. Tomography. 8 (2), 824-841 (2022).
  17. Sato, T., Hanna, P., Ajijola, O. A., Shivkumar, K., Mori, S. Photogrammetry of perfusion-fixed heart: Innovative approach to study 3-dimensional cardiac anatomy. JACC Case Rep. 21, 101937 (2023).
  18. Tretter, J. T., Gupta, S. K., Izawa, Y., Nishii, T., Mori, S. Virtual dissection: Emerging as the gold standard of analyzing living heart anatomy. J Cardiovasc Dev Dis. 7 (3), 30 (2020).
  19. Thomas, A. C., Davies, M. J. The demonstration of cardiac pathology using perfusion-fixation. Histopathology. 9 (1), 5-19 (1985).
  20. Glagov, S., Eckner, F. A., Lev, M. Controlled pressure fixation apparatus for hearts. Arch Pathol. 76, 640-646 (1963).
  21. Iaizzo, P. A. The visible heart(r) project and free-access website 'atlas of human cardiac anatomy. Europace. 18, 163-172 (2016).
  22. Yang, Y., Huang, H., Li, L., Yang, Y. Multiplex immunohistochemistry staining for paraffin-embedded lung cancer tissue. J Vis Exp. (201), e65850 (2023).
  23. Tripathy, S., Das, S. K. Strategies for organ preservation: Current prospective and challenges. Cell Biol Int. 47 (3), 520-538 (2023).
  24. Mori, S., Shivkumar, K. Atlas of cardiac anatomy (anatomical basis of cardiac interventions. Vol. 1). Cardiotext. , (2022).
  25. Crosado, B., et al. Phenoxyethanol-based embalming for anatomy teaching: An 18 years' experience with crosado embalming at the university of otago in new zealand. Anat Sci Educ. 13 (6), 778-793 (2020).
  26. Titmus, M., et al. A workflow for the creation of photorealistic 3d cadaveric models using photogrammetry. J Anat. 243 (2), 319-333 (2023).
  27. Silva, J. N. A., Southworth, M., Raptis, C., Silva, J. Emerging applications of virtual reality in cardiovascular medicine. JACC Basic Transl Sci. 3 (3), 420-430 (2018).
  28. Maresky, H. S., et al. Virtual reality and cardiac anatomy: Exploring immersive three-dimensional cardiac imaging, a pilot study in undergraduate medical anatomy education. Clin Anat. 32 (2), 238-243 (2019).
  29. Mori, S., Shivkumar, K. Real three-dimensional cardiac imaging using leading-edge holographic display. Clin Anat. 34 (6), 966-968 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved