JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מבוסס על LPS ומוות כתוצאה מ-ATP של מקרופאגים THP-1 ממוינים ב-PMA. אנו משתמשים בציטומטריית זרימה כדי לנתח צביעה כפולה של Annexin V ו-7-AAD כדי לזהות מוות תאי, תוך שימוש בתא כולו ושימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי לצפות במורפולוגיה של קרום התא.

Abstract

מוות תאי הוא תהליך בסיסי בכל האורגניזמים החיים. הפרוטוקול מבסס מודל ליפופוליסכריד (LPS) ואדנוזין טריפוספט (ATP) המושרה על ידי פורבול-12-מיריסטט-13-אצטט (PMA)-תצהיר שומנים ממוין במונוציטים אנושיים (THP-1) מקרופאגים כדי לצפות במוות תאי. LPS בשילוב עם ATP היא שיטת השראת דלקת קלאסית, המשמשת לעתים קרובות לחקר פירופטוזיס, אך אפופטוזיס ונקרופטוזיס מגיבים גם לגירוי על ידי LPS/ATP. בנסיבות רגילות, פוספטידיל-סרין ממוקם רק בעלון הפנימי של קרום הפלזמה. עם זאת, בשלבים המוקדמים של פירופטוזיס, אפופטוזיס ונקרופטוזיס, קרום התא נשאר שלם וחשוף לפוספטידיל-סרין, ובשלבים מאוחרים יותר, קרום התא מאבד את שלמותו. כאן, ציטומטריית זרימה שימשה לניתוח צביעה כפולה של Annexin V ו- 7-Aminoactinomycin D (AAD) כדי לזהות את מוות התאים מכל התאים. התוצאות מראות כי תאים משמעותיים מתו לאחר גירוי עם LPS/ATP. באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, אנו צופים בצורות האפשריות של מוות תאי בתאים בודדים. התוצאות מצביעות על כך שתאים עשויים לעבור פירופטוזיס, אפופטוזיס או נקרופטוזיס לאחר גירוי עם LPS/ATP. פרוטוקול זה מתמקד בצפייה במוות של מקרופאגים לאחר גירוי באמצעות LPS/ATP. התוצאות הראו כי מוות תאי לאחר גירוי LPS ו-ATP אינו מוגבל לפירופטוזיס, וכי אפופטוזיס ואפופטוזיס נמק יכולים להתרחש גם כן, מה שעוזר לחוקרים להבין טוב יותר את מוות התאים לאחר גירוי LPS ו-ATP ולבחור שיטה ניסיונית טובה יותר.

Introduction

מוות תאי הוא תהליך פיזיולוגי בסיסי בכל האורגניזמים החיים. בשנים האחרונות, מחקרים משמעותיים הראו כי מוות תאי מעורב בחסינות ובאיזון בתוך האורגניזם. חקר מוות תאי עוזר לנו להבין טוב יותר את הופעתן והתפתחותן של מחלות. תוארו מספר צורות של מוות תאי מתוכנת, וכמה מטרות מפתח בתהליכים אלה זוהו. פירופטוזיס, אפופטוזיס ונקרופטוזיס הם שלושת מסלולי המוות התאיים המתוכנתים המוגדרים גנטית המעורבים באיזון פנימי ובמחלות1.

Pyroptosis מאופיין על ידי היווצרות של נקבוביות הממברנה ואת שחרורו של תוכן התא. קספזות או גראנזימים פעילים מנתקים גזדרמינים כדי להפריד את תחומי N-terminal שלהם, אשר לאחר מכן אוליגומריים, נקשרים לקרום ויוצרים נקבוביות 2,3,4. נקבובית הגסדרמין מספקת תעלת הפרשה לא טיפוסית על פני קרומי התאים, וכתוצאה מכך תגובות תאים במורד הזרם, כולל שחרור תוכן וזרימת יונים 2,3,4. בסופו של דבר, התאים חווים בסופו של דבר קרע בקרום הפלזמה וליזה פירופטוטית בסיוע נינג'ורין-15. באפופטוזיס, Bax ו-Bak מופעלים יוצרים אוליגומרים על הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה ומשחררים ציטוכרום C, המווסת על ידי איזון בין חלבונים פרואפופטוטיים ואנטי-אפופטוטיים ממשפחת BCL-2, קספזות יוזמות (קספאז-8, -9 ו-10-) וקספזות אפקטור (קספאז-3, -6 ו-7)1,6,7. השינויים המורפולוגיים של אפופטוזיס כוללים דימום ממברנה, התכווצות תאים, פיצול גרעיני, עיבוי כרומטין והיווצרות גוף אפופטוטי 6,8. הקולטן סרין/תראונין-פרוטאין קינאז 1 (RIPK3) וקינאז דמוי שושלת מעורבת (MLKL) הם שני מרכיבי ליבה במורד הזרם של מנגנון נקרופטוטי1. RIPK3 מגייס ופוספורילטים MLKL, p-MLKL אוליגומריזציה, מתקשר לקרום התא, יוזם נקבים בממברנה, גורם לזרם יונים, מגביר אוסמולריות תוך תאית, ובסופו של דבר קרע תאים 6,9. Gasdermins ו- MLKL נקשרים לקרום הפלזמה ומתווכים פירופטוזיס ונקרופטוזיס, בהתאמה, בעוד BAX/BAK מתווך אפופטוזיס על ידי קשירה לקרום החיצוני של מיטוכונדריה6.

למרות שלכל מסלול יש מנגנונים ותוצאות ספציפיים, הם מובילים לשינויים דומים על קרום התא. בנסיבות רגילות, פוספטידיל-סרין (PS) ממוקם רק בעלון הפנימי של קרום הפלזמה. עם זאת, בשלבים המוקדמים של פירופטוזיס, אפופטוזיס ונקרופטוזיס, PS ייחשף, מחוץ לקרום הפלזמה. Caspase-3/caspase-7 מפעיל משפחות TMEM16 ו-XKR, מה שמוביל לקרום תא אסימטרי ומחצין PS במהלך אפופטוזיס10. זרם Ca2+ בתיווך D של Gasdermin ו- MLKL מוביל לאובדן הסימטריה של דו-שכבת הפוספוליפידים על קרום התא ולחשיפה של PS. החשיפה מתרחשת לפני אובדן שלמות קרום התא11,12. בהתבסס על השינויים הדומים בממברנה של שלושת הסוגים האלה של מוות תאי מתוכנת, אנו משתמשים בציטומטריית זרימה כדי לנתח צביעה כפולה של Annexin V/7-Aminoactinomycin D (7-AAD) כדי לזהות מוות תאי. Annexin V, חלבון קושר פוספוליפידים תלוי סידן, יש זיקה גבוהה PS, אשר יכול לשמש בדיקה רגישה כדי לזהות PS חשוף על פני השטח של קרום פלזמה13. 7-AAD הוא כתם חומצת גרעין שאינו יכול לעבור דרך כל קרום התא. הוא דומה לפרופידיום יודיד (PI), צבע נפוץ של חומצות גרעין. יש להם מאפיינים פלואורסצנטיים דומים, אך ל-7-AAD יש ספקטרום פליטה צר יותר ופחות הפרעות לערוצי גילוי אחרים. בשל קווי דמיון אלה, אין זה מספיק להבחין בין פירופטוזיס, אפופטוזיס ונקרופטוזיס. השתמשנו בציטומטריית זרימה כדי לזהות מוות תאי מתאים שלמים. שיטה שנייה משמשת ללכידת קרום התא באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) כדי לבחון את הצורות האפשריות של מוות תאי בתאים בודדים.

הקמנו מודל ליפופוליסכריד (LPS) ואדנוזין טריפוספט (ATP) המושרה על ידי פורבול-12-מיריסטט-13-אצטט (PMA) - שיקוע שומנים ממוין במונוציטים אנושיים (THP-1) מקרופאגים כדי לצפות במוות תאי. פרוטוקול זה מתמקד בהתבוננות במוות תאי ולא בחקירת מנגנונים.

Protocol

1. קו תאים ותרבית תאים

  1. לגדל את קו התאים המונוציטיים האנושיים THP-1 בתווך תרבית שלם RPMI-1640 עם 10% נסיוב בקר עוברי, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-0.05 מילימטר β-מרקפטואתנול. תרבית את התאים ב 37 ° C ב 5% CO2 אוויר לח. תאי תרבית כל 2-3 ימים.
    הערה: THP-1 הוא תא תרחיף, בחר לשנות מחצית מהמדיום עבור תת-תרבית. כאשר מתבוננים בשברי תאים רבים תחת מיקרוסקופ האור, צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. יש להשהות מחדש את התאים במדיום תרבית התאים המלא הטרי שחומם מראש.
  2. השתמש בתאים (במעברים 4-10) בשלב הגידול הלוגריתמי עבור כל הניסויים. כאשר התאים במצב טוב ובשלב הצמיחה הלוגריתמי, הם עגולים, בהירים, צפופים וללא גושים ושברי תאים תחת מיקרוסקופ האור ברזולוציה של 100x.

2. התמיינות של תאי THP-1

  1. הכן תמיסת מלאי של PMA בריכוז של 1 mM (להמיס 1 מ"ג של PMA ב 1.62 מ"ל של dimethyl sulfoxide). לדלל את תמיסת מלאי PMA עם מדיום תרבית תאים מלאה לריכוז עבודה סופי של 100 ננומטר.
  2. אספו את התאים בצלחת התרבית לתוך צינור צנטריפוגה סטרילית של 10 מ"ל. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר, להשהות תאים עם 3 מ"ל של מדיום תרבית מלאה המכיל PMA.
  3. פתח את מונה התאים ואת תוכנת הספירה. פיפטה 20 μL של תרחיף התא ללוח מונה התא ולהכניס אותו לתוך לוח מונה התא. לחץ על תצוגה מקדימה B1, סובב את הידית בפינה השמאלית התחתונה של המכשיר וכוונן את מרחק המוקד כדי ליצור את התאים עם מרכז בהיר עם קווי מתאר ברורים בתוכנה. לחץ על ספירה כדי להתחיל לספור.
  4. בהתבסס על תוצאות הספירה, השתמש במדיום תרבית שלם המכיל PMA כדי להתאים את צפיפות התא ל- 1 x 106 תאים/מ"ל. תאי זרעים בצלחת 6 באר, לדגור על הצלחת במשך 24 שעות ב 37 ° C ו 5% CO2 לפני תחילת טיפול נוסף.

3. טיפול בתאי THP-1

  1. הכינו תמיסת מלאי של LPS בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל (יש להמיס 1 מ"ג LPS ב-1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS)). יש לדלל את תמיסת מלאי LPS בתווך נטול סרום עד לריכוז עבודה סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל. הכן תמיסת מלאי של Na2ATP בריכוז של 500 mM (להמיס 0.3026 גרם ATP ב 1 מ"ל של PBS).
  2. שאפו את המדיום המכיל PMA מבארות ושטפו עם PBS 1x. הוסף מדיום ללא סרום לקבוצת הביקורת ומדיום ללא סרום המכיל LPS לקבוצת הדגמים. לדגור על הצלחת במשך 6 שעות ב 37 ° C + 5% CO2 לפני שתמשיך עם טיפול נוסף.
  3. לאחר 6 שעות, הוסף את פתרון מלאי ATP לקבוצת המודל לריכוז עבודה סופי של 500 ננומטר. לדגור על הצלחת במשך 45 דקות ב 37 ° C + 5% CO2 לפני שתמשיך.

4. ניתוח ציטומטריית זרימה (שיטה 1)

  1. הכנת דגימות ניסוי
    1. זרעו ודגרו על תאים בצלחות 6 בארות לפי שלב 2. הקימו ארבע קבוצות ביקורת ללא טיפול: בקרה אחת ללא צביעה, שתי בקרות צביעה בודדות (אחת לכל כתם) ובקרת צביעה כפולה אחת. להקים קבוצת טיפול אחת ולטפל לפי שלב 3.
    2. לאחר הטיפול, לשאוף את כל supernatant מן הבארות ולשטוף עם PBS 2x. מוסיפים 500 μL של 0.05% טריפסין (לא EDTA) לכל באר, ודגרים באינקובטור במשך 30 שניות.
    3. הוסף 1 מ"ל של מדיום תרבית שלם RPMI-1640 לכל באר כדי לעצור את ניתוק התאים ולאסוף את התאים לתוך צינור 5 מ"ל. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. הוסף 1 מ"ל של PBS כדי להשעות תאים. מניחים צינורות עם תאים באמבט מים ב 37 ° C למשך 3 דקות. צנטריפוגה כל הדגימות ב 300 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. לדלל 200 μL של 5x חיץ מחייב עם 800 μL של מים מזוקקים ל 1x חיץ קשירה. הוסף 100 μL של 1x binding buffer כדי להשהות מחדש תאים ולהעביר את התאים לתוך צינור 5 מ"ל.
    6. הוסף 5 μL של תמיסת V-PE Annexin לצינור אחד של תאי קבוצת ביקורת למשך 10 דקות ו- 5 μL של תמיסת 7-AAD לצינור אחר של תאי קבוצת ביקורת למשך 5 דקות (כפקדי צביעה בודדים בנפרד). מערבלים בעדינות כל צינור כדי לערבב צבע ולדגור על הדגימות בטמפרטורת החדר המוגנות מפני אור. הוסף 400 μL של PBS לכל צינור ומערבול בעדינות כדי לסיים את הדגירה.
    7. הוסף 5 μL של תמיסת Annexin V-PE לצינורות הנותרים ודגר במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מערבלים בעדינות כל צינור כדי לערבב צבע ולדגור על הדגימות בטמפרטורת החדר המוגנות מפני אור. לאחר 5 דקות, הוסיפו 5 מיקרוליטר של תמיסת 7-AAD למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף 400 μL של PBS לכל צינור ומערבולת בעדינות כדי לסיים את הדגירה.
    8. סנן את מתלה התא באמצעות רשת ניילון 35 מיקרומטר שהם חלק מצינורות פוליסטירן עגולים 5 מ"ל. מניחים את הצינור על קרח ומחכים לבדיקה. ערבבו בעדינות לפני הבדיקה ולאחר מכן הכניסו אותו למכשיר.
  2. ציטומטריית זרימה
    1. השתמש בציטומטר זרימת מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות לבדיקה. פתח את תוכנת ניתוח נתוני ציטומטר הזרימה ואשר את ביצועי הגלאי והלייזר. לחץ על Cytometer ובחר אתחול Fluidics, המתן עד שהמערכת תהיה מוכנה. אל תכלול בועות תא זרימה על ידי לחיצה על Cytometer > Clean Modes > De-gas Flow cell.
    2. לחץ על ניסוי, בחר ברצף תיקיה חדשה, ניסוי, דגימה, צינור וערוך שם. חץ בצורת מחומש לפני הצינור, הופך לירוק כאשר הוא נדלק.
    3. לחץ על הסמל של Cytometer FACSCelesta (סמל מקש קיצור), בחר פרמטר, ולאחר מכן בחר FSC, SSC ואות PE . לחץ על הסמל של Global Worksheet (סמל מקש קיצור) כדי ליצור היסטוגרמה PE. עבור ציטומטר הזרימה המשמש במחקר זה, השתמש PE עבור נספח V ב 586 ננומטר ותרשים על ציר X; PerCP-Cy5.5 עבור 7-AAD ב-700 ננומטר והתוויית ציר Y.
    4. הכנס תחילה דגימת בקרה לא מוכתמת למכשיר. לחץ על הסמל של Acquisition Dashboard (סמל מפתח קיצור), רכוש מינימום של 10,000 אירועים מהאוכלוסייה הרצויה. אל תכלול פסולת באמצעות שער (P1) בתרשים נקודות FSC-A ו- SSC-A. התאם את קצב הזרימה למהירות בינונית והקלט נתונים. כוונן את המתח כדי למקם את אוכלוסיית התא באלכסון של היסטוגרמה FSC/SSC ולחץ על הפעל מחדש. התאם את קצב הזרימה למהירות בינונית והקלט נתונים.
    5. לחץ על הצינור הבא, הפעל פקדי צביעה בודדים של Annexin V ו- 7-AAD כדי להתאים את הפיצוי. הפעל את הצינורות הנותרים ואסוף נתונים.

5. דימות SEM (שיטה 2)

  1. הכנת דגימות ניסוי
    1. לזרוע ולדגור תאים בצלחות 6 בארות לפי שלב 2 ולטפל לפי שלב 3.
    2. לאחר הטיפול, לשאוף את כל supernatant מן הבארות ולשטוף 2x עם PBS. מוסיפים 500 μL של 0.05% טריפסין (לא EDTA) לכל באר, ודגרים באינקובטור במשך 30 שניות.
    3. הוסף 1 מ"ל של מדיום תרבית שלם RPMI-1640 לכל באר כדי לעצור את ניתוק התאים ולאסוף את התאים לתוך צינור 5 מ"ל. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. תקן תאים עם 500 μL של מיקרוסקופ אלקטרונים קיבוע (2.5% דיאלדהיד גלוטרי, 100 mM מלחי זרחן) במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לילה ב 4 ° C.
    5. הכינו תמיסת אלום כרום: הוסיפו 1.0 גרם ג'לטין ל-100 מ"ל מים טהורים במיוחד, חימום מים-אמבטיה בטמפרטורה של 70°C וערבבו באופן שווה. מוסיפים 0.05 גרם אלום כרום, מערבבים באופן שווה ומסננים עם נייר מסנן. טובלים את זכוכית הכיסוי הנקייה בתמיסת אלום כרום למשך שעתיים ב-37°C ומייבשים אותה בתנור ב-37°C לשימוש מאוחר יותר.
      הערה: המטרה היא למנוע ניתוק תאים במהלך הניסוי.
    6. אסוף תאים מתמיסה קבועה. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף 100 μL של PBS ולנשוף בעדינות את התאים. זרוק את מתלה התא על זכוכית הכיסוי, לאפשר לעמוד במשך 5 דקות. שאפו את כל הסופרנאטנט ושטפו 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות בכל פעם.
      הערה: יש לבצע את הפעולה בעדינות כדי למנוע ניתוק תאים. אין לנער במרץ, לנוע לאט, ולהוסיף נוזלים לאט לאורך הקיר.
    7. הוסף 500 μL של קיבוע חומצה אוסמית 1% למשך שעה אחת. שאפו את כל הסופרנאטנט ושטפו 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות בכל פעם.
    8. יש לייבש את הדגימות ברצף בסדרה של ריכוזי אתנול (EtOH) (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) למשך 15 דקות לכל תמיסת EtOH.
      הערה: ניתן לשמור את משקפי הכיסוי ב-100% EtOH למשך מספר ימים בטמפרטורה של 4°C, אך עליהם להתייבש בהקדם האפשרי כדי למנוע התייבשות מוגזמת.
    9. הפעילו את מייבש הנקודות הקריטיות, פתחו את מיכל ה-CO2 , קררו את התא ל-10°C. עטוף במהירות את המדגם בנייר סינון כאשר לחץ התא הוא 0 psi והכנס אותו לתא.
    10. פתח את שסתום הכניסה, התבונן דרך חלון תצפית CO2 , העלה את רמת CO2 הנוזלי בין שני הקווים האדומים (אין לחרוג מהגבול העליון), סגור את שסתום הכניסה. משרים את הדגימה למשך 10 דקות. פתח את שסתומי הכניסה והפליטה בו-זמנית כדי להשוות את ה-CO2 למשך דקה אחת (CO2 נוזלי מחליף את EtOH). סגור את שסתום הפליטה כדי להעלות את רמת CO2 הנוזלי למיקום שצוין, סגור את שסתום הכניסה.
    11. הגדר את הטמפרטורה ל 35 ° C ולחץ על 1250 psi. ברגע שהטמפרטורה והלחץ מתייצבים, יש להוריד את הלחץ על 100 psi/min. הוציאו את הדגימה כאשר לחץ התא הוא אפס וכבו את המכשיר.
    12. הרכבה של דגימות על מחזיקי דגימות אלומיניום SEM באמצעות סרט מוליך. השתמשו במעיל מרזב כדי לכסות את הדגימות בשכבה (2-5 ננומטר) של זהב.
  2. דימות
    1. השתמש ב- SEM של פליטת שדה קר ברזולוציה גבוהה להדמיה. הגדר את מתח ההאצה של SEM ל- 3 kV. הגדר את מרחק העבודה ל -10 מ"מ. הגדר את ההגדלה ל- 1,000x כדי לצפות בפנורמה. הגדר את ההגדלה ל- 5,000x ו- 20,000x כדי לאתר את קרום הפלזמה ולצלם את הדגימה.
      הערה: תהליך ההדמיה של מקרופאגים THP-1 ממוינים ב-PMA באמצעות SEM דומה לסוגים אחרים של תאים ורקמות ותלוי במכשירים שבהם נעשה שימוש. הפניה14 מספקת פרוטוקול SEM מפורט עם סרטונים נלווים.

תוצאות

דגימות התאים טופלו כמתואר בפרוטוקול ונעשה זיהוי ציטומטריית זרימה. לא ניתן להכתים תאים רגילים בנספח V וב-7-AAD (נספח V-/7-AAD-). בשלבים המוקדמים של פירופטוזיס, אפופטוזיס ונקרופטוזיס, PS נחשף ונקשר לנספחין V, אך קרום התא עדיין היה שלם ולא כלל 7-AAD מהחלל החוץ-תאי (Annexin V+/7-AAD-). בשלבים מאוחרים יותר, קרום התא ...

Discussion

בכתב יד זה, שתי שיטות שימשו לזיהוי LPS ומוות כתוצאה מ-ATP של מקרופאגים THP-1 ממוינים ב-PMA. נעשה שימוש בצביעה כפולה של Annexin V/7-AAD, והתוצאות נותחו על ידי ציטומטריית זרימה מהצביעה הכוללת. כמו באנליזה ציטומטרית זרימה אחרת, קבוצה של תאים לא מוכתמים ושתי קבוצות של תאים מוכתמים בודדים הוקמו כדי לא לכלול תו...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

אנו מביעים את הערכתנו הרבה לג'יה-יי סון וללו יאנג במכון החדשני לרפואה סינית ורוקחות, אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית, על הסיוע בציטומטריית זרימה, קויפינג צ'ן במעבדת המפתח הממלכתית של משאבי הרפואה הסינית הדרום-מערבית, על העזרה במיקרוסקופ אלקטרונים סורק. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין [82104491], הקרן למדעי הטבע של סצ'ואן [2023NSFSC0674], והקרן למדע פוסט-דוקטורט של סין [2021M693789].

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA)BOSTER Biological Technology co.ltdPYG0068
5 mL Polystyrene Round-Bottom TubeCORNING352235
5 mL centrifuge tubeLabgic Technology Co., Ltd. BS-50-M
6-well plate Sorfa Life Science Research Co.,Ltd220100
Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kitAbsin (Shanghai) Biological Technology co.ltdabs50007Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution
celculture CO2 incubatorEsco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.N/A
cell culture dish, 100 mmSorfa Life Science Research Co.,Ltd230301
Cellometer K2 Fluorescent Cell CounterNexcelom Bioscience LLCCellometer K2
Cellometer SD100 Counting ChambersNexcelom Bioscience LLCCHT4-SD100-002
centrifuge machineHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., LtdL530
chromium alum Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.PA04354
cover glasses, 9 mmLabgic Technology Co., Ltd. BS-09-RC
critical point dryerQuorum TechnologiesK850
dimethyl sulfoxideBOSTER Biological Technology co.ltdPYG0040
electron microscope fixativeServicebio Technology co.ltd G11022.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts
electronic balanceSHIMADZUATX124
ethanol absoluteChengdu Kelong Chemical Co., Ltd2021033102
flow cytometerBecton,Dickinson and CompanyFACSCanto figure-materials-2106
flow cytometry analysis softwareBecton,Dickinson and CompanyBD FACSDivaTM Software
gelatinGuangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.PA00256 
High resolution cold field emission scanning electron microscopeTITACHIRegulus 8100
human monocytic cell line THP-1Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.CL0233
inverted microscope Leica Microsystems Co., LtdDMi1
IR Vortex MixerVELP Scientifica SrlZX4
lipopolysaccharide Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. L8880LPS is derived from Escherichia coli 055:B5
Na2ATPBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. A8270
phorbol-12-myristate-13-acetate Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. P6741
phosphate-buffered salineServicebio Technology co.ltd G4202
PipetteEppendorf AGN/A
pipette tips, 10 μLServicebio Technology co.ltd T-10PL
pipette tips, 1 mL Servicebio Technology co.ltd T-1250L
pipette tips, 200 μLServicebio Technology co.ltd T-200L
RPMI-1640 complete culture mediaProcell Life Science&Technology Co.,Ltd.CM0233RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S
RPMI-1640 culture media Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD.K211104
sheath fluidBECKMAN COULTER8546733
sputter coaterCressington Scientific Instruments Ltd108
thermostatic water bathGUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd HH-1

References

  1. Bertheloot, D., Latz, E., Franklin, B. S. Necroptosis, pyroptosis and apoptosis: an intricate game of cell death. Cell Mol Immunol. 18 (5), 1106-1121 (2021).
  2. Rao, Z., et al. Pyroptosis in inflammatory diseases and cancer. Theranostics. 12 (9), 4310-4329 (2022).
  3. Huston, H. C., Anderson, M. J., Fink, S. L. Pyroptosis and the cellular consequences of gasdermin pores. Semin Immunol. 69, 101803 (2023).
  4. Kovacs, S. B., Miao, E. A. Gasdermins: Effectors of pyroptosis. Trend Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).
  5. Kayagaki, N., et al. NINJ1 mediates plasma membrane rupture during lytic cell death. Nature. 591 (7848), 131-136 (2021).
  6. Ketelut-Carneiro, N., Fitzgerald, K. A. Apoptosis, pyroptosis, and necroptosis-Oh my! The many ways a cell can die. J Mol Biol. 434 (4), 167378 (2022).
  7. Kakarla, R., Hur, J., Kim, Y. J., Kim, J., Chwae, Y. J. Apoptotic cell-derived exosomes: messages from dying cells. Exp Mol Med. 52 (1), 1-6 (2020).
  8. Imre, G. Cell death signalling in virus infection. Cell Signal. 76, 109772 (2020).
  9. Zhan, C., Huang, M., Yang, X., Hou, J. MLKL: Functions beyond serving as the Executioner of Necroptosis. Theranostics. 11 (10), 4759-4769 (2021).
  10. Lemke, G. How macrophages deal with death. Nat Rev Immunol. 19 (9), 539-549 (2019).
  11. Yang, X., et al. Bacterial endotoxin activates the coagulation cascade through gasdermin D-dependent phosphatidylserine exposure. Immunity. 51 (6), 983-996 (2019).
  12. Gong, Y. N., et al. ESCRT-III acts downstream of MLKL to regulate necroptotic cell death and its consequences. Cell. 169 (2), 286-300 (2017).
  13. Dong, H. P., et al. Evaluation of cell surface expression of phosphatidylserine in ovarian carcinoma effusions using the annexin-V/7-AAD assay: clinical relevance and comparison with other apoptosis parameters. Am J Clin Pathol. 132 (5), 756-762 (2009).
  14. JoVE, Scanning Electron Microscopy (SEM), JoVE Science Education Database, Analytical Chemistry. JoVE. , (2024).
  15. Chen, X., et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-D pore and its morphology is different from MLKL channel-mediated necroptosis. Cell Res. 26 (9), 1007-1020 (2016).
  16. Herr, D. R., et al. Ultrastructural characteristics of DHA-induced pyroptosis. Neuromol Med. 22 (2), 293-303 (2020).
  17. Xie, Q., et al. Lipopolysaccharide/adenosine triphosphate induces IL-1β and IL-18 secretion through the NLRP3 inflammasome in RAW264.7 murine macrophage cells. Int Mol Med. 34 (1), 341-349 (2014).
  18. Gurung, P., et al. FADD and caspase-8 mediate priming and activation of the canonical and noncanonical Nlrp3 inflammasomes. J Immunol. 192 (4), 1835-1846 (2014).
  19. Liu, W., et al. Ablation of caspase-1 protects against TBI-induced pyroptosis in vitro and in vivo. J Neuroinflam. 15 (1), 48 (2018).
  20. Wang, S. H., et al. GSK-3β-mediated activation of NLRP3 inflammasome leads to pyroptosis and apoptosis of rat cardiomyocytes and fibroblasts. Euro J Pharmacol. 920, 174830 (2022).
  21. Chen, J., et al. RIP3 dependent NLRP3 inflammasome activation is implicated in acute lung injury in mice. J Transl Med. 16 (1), 233 (2018).
  22. Rogers, C., et al. Gasdermin pores permeabilize mitochondria to augment caspase-3 activation during apoptosis and inflammasome activation. Nat Comm. 10 (1), 1689 (2019).
  23. Wang, Y., et al. Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin. Nature. 547 (7661), 99-103 (2017).
  24. Kang, S., et al. Caspase-8 scaffolding function and MLKL regulate NLRP3 inflammasome activation downstream of TLR3. Nat Comm. 6, 7515 (2015).
  25. Wang, Y., Kanneganti, T. D. From pyroptosis, apoptosis and necroptosis to PANoptosis: A mechanistic compendium of programmed cell death pathways. Comput Str Biotechnol J. 19, 4641-4657 (2021).
  26. Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529 (2024).
  27. Shuwen, H., et al. Cholesterol induction in CD8+ T cell exhaustion in colorectal cancer via the regulation of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites. Cancer Immunol Immunother. 72 (12), 4441-4456 (2023).
  28. Luo, X., et al. Cyclophosphamide induced intestinal injury is alleviated by blocking the TLR9/caspase3/GSDME mediated intestinal epithelium pyroptosis. Int Immunopharmacol. 119, 110244 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

THP 1LPSATPV7 D AAD

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved