אסטרטגיות להערכת התנהגויות דמויות אוטיסטיות בעכברים

Summary

מודלים של מכרסמים הם כלים רבי ערך לחקר התנהגויות ליבה הקשורות להפרעת הספקטרום האוטיסטי (ASD). במאמר זה, אנו מסבירים על שני מבחנים התנהגותיים למידול מאפייני הליבה של ASD בעכברים: טיפוח עצמי, המעריך התנהגות חוזרת, ומבחן אינטראקציה חברתית בן שלושה חדרים, המתעד ליקויים חברתיים.

Abstract

הפרעת הספקטרום האוטיסטי (ASD) היא מצב מורכב מבחינה נוירוביולוגית עם אטיולוגיה גנטית הטרוגנית. מבחינה קלינית, ASD מאובחן על ידי ליקויים בתקשורת חברתית והתנהגויות מגבילות או חוזרות על עצמן, כגון נפנוף ידיים או סידור חפצים. ניתן לצפות בדפוסי התנהגות אלה באופן מהימן במודלים של עכברים עם מוטציות גנטיות הקשורות לאוטיזם, מה שהופך אותם לכלים שימושיים ביותר לחקר המנגנונים התאיים והמולקולריים הבסיסיים ב-ASD. הבנת האופן שבו שינויים גנטיים משפיעים על הנוירוביולוגיה וההתנהגויות שנצפו ב-ASD תקל על פיתוח תרכובות טיפוליות ממוקדות חדשות לשיפור ליקויי התנהגות הליבה. המעבדה שלנו השתמשה במספר פרוטוקולים המקיפים נהלי הכשרה ובדיקה מתוארים היטב המשקפים מגוון רחב של ליקויים התנהגותיים הקשורים לאוטיזם. כאן, אנו מפרטים שתי בדיקות לחקר מאפייני הליבה של ASD במודלים של עכברים: טיפוח עצמי (מדד להתנהגות חוזרת) ומבחן אינטראקציה חברתית תלת-תאית (מדד של גישת אינטראקציה חברתית והעדפה לחידוש חברתי).

Introduction

הפרעת הספקטרום האוטיסטי (ASD) היא הפרעת מוח התפתחותית המתבטאת בליקויים בתקשורת חברתית או באינטראקציה ודפוסים מוגבלים וחוזרים על עצמם של התנהגויות או תחומי עניין ^1,2. בשנת 2022, כ-1 מכל 100 ילדים אובחן עם ASD ברחבי העולם³. על פי המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן (CDC, ארה"ב), שכיחות ASD עלתה ב-30% מאז 2008 ועלתה ביותר מפי 2 מאז שנת 2000 ^4,5. אנשים עם ASD עשויים להפגין גם תחלואה נלווית, כגון מוגבלות שכלית (ID) (35.2%, מנת משכל ≤ 70), הפרעת קשב וריכוז (ADHD) (50%-70%), ותסמונות גנטיות אחרות ^2,4,6.

השימוש במודלים של בעלי חיים במחקר ASD, במיוחד מכרסמים, סיפק תובנות משמעותיות לגבי ההשפעה של גורמים סביבתיים שונים, כולל תזונה, תרופות, פעילות גופנית והעשרה 7,8,9,10, כמו גם מוטציות גנטיות כגון Shank, Fmr1, Mecp2, Pten ומוטציה Tsc 11,12,13על תסמיני ASD., מודלים של עכברים משמשים בדרך כלל לחקירת ASD בשל אופיים החברתי והמאפיינים הגנטיים, הביוכימיים והאלקטרופיזיולוגיים המשותפים עם בני אדם. לדוגמה, על ידי מחיקת גן ספציפי (כגון Shank3, Fmr1, Cntnap2 ו-Pten), ניתן לסכם התנהגויות חברתיות וחזרתיות חריגות, מה שמספק תוקף חזק של המחקר 14,15,16. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים לחקר הקבלות בין מודלים גנטיים של בעלי חיים לבין תסמיני ASD אנושיים¹⁷. אנו מתארים את מבחן הטיפוח העצמי והאינטראקציה החברתית התלת-קאמרית, המשקפים שני תסמיני ליבה בחולי ASD, כלומר דפוסי התנהגות מוגבלים וחוזרים על עצמם וליקויי אינטראקציה חברתית (תקשורת), בהתאמה.

בהתבסס על ה-DSM-V (מדריך אבחוני וסטטיסטי להפרעות נפשיות של האגודה הפסיכיאטרית האמריקאית מהדורה 5) ו-ICD-11 (סיווג בינלאומי של מחלות מהדורה 11), חולי ASD עוסקים בדפוסי התנהגות מוגבלים, חוזרים על עצמם וסטריאוטיפיים, בפרט, התנהגויות חוזרות ונשנות לא ממוקדות גוף (BFRBs), כגון נדנדה, גירוי, כסיסת ציפורניים, תלישת שיער, קטיף עור או הליכה על אצבעות ^{הרגליים 18, 19}. אצל בעלי חיים, התנהגות חוזרת באה לידי ביטוי בטיפוח עצמי ממושך וחוזר על עצמו. טיפוח הוא אחת הפעילויות המולדות הנפוצות ביותר בקרב מכרסמים, כאשר כ-40% מזמן הערות שלהם מוקדש לטיפוח ^20,21. זה אינסטינקטיבי לעכברים ללקק את העור או הפרווה שלהם כדי להסיר לכלוך זר מפני השטח של הגוף, המשמש לשמירה על ניקיון הגוף, מניעת פציעות, הסרת טפילים וויסות הטמפרטורה. טיפוח מסווג לשני סוגים: טיפוח חברתי (allo-grooming), הכולל טיפוח על ידי עכבר אחר, וטיפוח עצמי. טיפוח עצמי מציג דפוס רצף סטריאוטיפי ושמור המורכב מארבעה שלבים (לרוב בדידים ולא רציפים)^22,23. בשלב I (שבץ אליפטי), עכברים מתחילים את הטיפוח על ידי ליקוק שתי הכפות ולאחר מכן טיפוח סביב האף עם כפותיהם. בשלב II (שבץ חד צדדי), עכברים משתמשים בכפות כדי לנגב את פניהם בצורה אסימטרית. בשלב III (שבץ דו-צדדי), עכברים מנגבים באופן סימטרי את ראשם ואוזניהם. בשלב IV (ליקוק גוף), עכברים עוברים לליקוק הגוף על ידי הזזת ראשם לאחור ועשויים להאריך את הטיפוח לזנב ולאיברי המין. כאשר עכברים ממוקמים בנפרד בכלוב שקוף, ניתן לזהות ולצפות בקלות בהתנהגות טיפוח עצמי. עכברים מגבירים את התנהגות הטיפוח העצמי כאשר הם מתמודדים עם לחץ, כאב או הפרעה חברתית, מה שהופך את מבחן הטיפוח העצמי לקריטי בעת חקר הפרעות נוירולוגיות²². מודלים שונים של עכברים של ASD, כולל אלה עם מוטציות גנטיות (כגון Fmr1^−/y, Shank3B^−/-, NL1^−/−), התערבויות פרמקולוגיות (כגון DO34, PolyI:C), וזנים מולד ספציפיים (כמו BTBR ו-C58/J), הפגינו התנהגות מוגזמת של טיפוח עצמי חוזר ונשנה 24,25,26,27.

שינויים בהתנהגות חברתית משמשים כאחד הקריטריונים להערכת ASD. על פי ה-DSM-V וה-ICD-11, חולי ASD מציגים ליקויים מתמשכים בתקשורת חברתית ובאינטראקציה חברתית^{1 8,19}. אלה עשויים להתבטא בליקויים בתקשורת מילולית ולא מילולית (כלומר, קשר עין חריג, מחוות והבעות פנים), חוסר שיתוף עניין ורגשות עם אחרים, חוסר מודעות לרמזים הקשריים חברתיים או קשיים בפיתוח מערכות יחסים. בהתאם לתסמיני הליקוי החברתי, משימות התנהגותיות שונות תוכננו ועברו אופטימיזציה להערכת אינטראקציות חברתיות בעכברים, כגון מבחן האינטראקציה החברתית הישירה, הגישה החברתית התלת-קאמרית והעדפת מבחן חידוש חברתי, וניתוח קולות קוליים (USVs)^16,28. מבחן האינטראקציה החברתית בן שלושת החדרים הוא ניסוי בשימוש נרחב להערכת התנהגויות הקשורות לאוטיזם 17,29,30,31. המנגנון מורכב משלושה תאים מחוברים; התא השמאלי והימני מכילים כלוב תיל שעשוי להיות ריק או תפוס על ידי עכבר, מה שמאפשר לעכבר הבדיקה לקיים אינטראקציה חופשית עם שני הכלובים. שתי מדידות מסייעות להעריך היבטים שונים של התנהגות חברתית בעכבר הניסוי במהלך הניסוי בן שלושת החדרים. ראשית, עכבר הבדיקה מקבל ניקוד עבור הזמן המושקע באינטראקציה עם הכלוב הריק (אובייקט חדש) לעומת כלוב המכיל עכבר חדש. חלק זה של המשימה מספק תובנה לגבי החברותיות של העכבר. לאחר מכן, עכבר לא מוכר מכניס לכלוב התיל שהיה ריק בעבר. הפרש הזמן באינטראקציה של עכבר הניסוי בין העכבר הלא מוכר למוכר מודד את ההעדפה לחידוש חברתי. בחלק זה של המשימה, עכבר בקרה מעדיף לקיים אינטראקציה עם עכבר לא מוכר ולא עם עכבר שנתקל בו בעבר, שכבר היה קיים בחלק החברתיות של המבחן. ליקויים באינטראקציה חברתית וירידה במוטיבציה לאינטראקציה עם עכברים חדשים נמצאים בדרך כלל במודל עכברי של ASD. מבחן שלושת התאים הוכיח את עצמו כחזק מאז המצאתו. הוא שימש לחקר פנוטיפים חברתיים במודלים שונים של עכברים של ASD, כולל Fmr1^−/−, Shank3B^−/-, Cntnap2^−/−, וזן המולד BTBR 32,33,34,35,36.

שני המבחנים משתמשים בהתנהגות ספונטנית טבעית של עכברים ככלים ראויים לחקר התנהגות דמוית ASD. מכיוון שהם נחשבים למבחני מתח נמוך, ניתן לבצע את שתי הבדיקות באותה קבוצת עכברים כדי למדוד התנהגות דמוית ASD, כאשר מבחן הטיפוח העצמי מבוצע תחילה ומבחן האינטראקציה החברתית בן שלושת החדרים בימים שלאחר מכן. הפרוטוקולים שאנו מספקים מהווים כלי חיוני להערכת התנהגות דמוית ASD ולפיתוח טיפולים חדשים 29,30,31. בסופו של דבר, הם יתרמו לשיפור התוצאות עבור אנשים שנפגעו מ-ASD.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הנהלים והניסויים הכוללים נבדקים בבעלי חיים אושרו על ידי תקנות הוועדה לטיפול בבעלי חיים (FACC), העוקבות אחר ההנחיות שנקבעו על ידי המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים, הוועדה לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת מקגיל והמשרד לרווחת חיות מעבדה של ה-NIH (OLAW). מספר הבטחת שירות בריאות הציבור (PHS) עבור אוניברסיטת מקגיל הוא F-16-00005 (A5006-01).

1. הכנת בעלי חיים

1. עכברי מבחן: בחר עכברים זכרים ו/או נקבות בני 2-3 חודשים (8 עד 13 שבועות). כל העכברים ששימשו בניסויים כאן הם מרקע C57BL/6J. עבור התנהגות טיפוח עצמי ומבחני האינטראקציה החברתית התלת-תאיים, הטווח המקובל בדרך כלל של עכברים לקבוצה המוצע הוא n = 10-15, עם מינימום של n = 8.
   1. עבור עכברים מהונדסים גנטית, הוסיפו תמיד חברי המלטה מסוג בר כביקורת. התאימו את קבוצת הביקורת לקבוצת הניסוי מבחינת רקע גנטי, גיל, מין ותנאי דיור. העכברים הטרנסגניים ההומוזיגוטיים ששימשו במחקר זה הם נורמליים בגודלם ואינם מציגים חריגות פיזיות גסות.
      הערה: במקרים מורכבים יותר, חוקרים עשויים להיות מעוניינים להעריך יותר משני גנוטיפים (כלומר, סוג פראי, הטרוזיגוט, הומוזיגוט), לחקור את ההשפעות של תרופות (כלומר, טיפול, טיפול ברכב, אי-טיפול), או להשוות בין זכרים ונקבות. כאשר עובדים עם עכברים נקבות, חיוני לקחת בחשבון את מחזורי הייחום שלהן. בעוד שמחזורי ייחום נשיים אינם משפיעים באופן משמעותי על התנהגויות טיפוח עצמי, מחקרים הצביעו על כך שמחזורים אלה יכולים להשפיע על גישה חברתית והעדפה לחידוש חברתי^37,38.
2. עכברים זרים: השתמש לפחות ב-8 עכברים מסוג בר לבדיקת שלושת החדרים. השתמש ב-2 כלובים, 4 עכברים בכלוב, התאמת גיל, מין ואותו רקע גנטי (C57BL/6J) של עכברי הבדיקה. ודא שלעכברים הזרים לא הייתה אינטראקציה קודמת עם עכברי הניסוי.
3. דיור: בית קבוצתי 3-5 עכברים לכל כלוב ביתי (71/2 אינץ' רוחב x 111/2 אינץ' אורך x 5 אינץ' H כלובי פלסטיק לעכבר) ולשמור על מחזור אור/חושך של 12 שעות. ספק לעכברים גישה למזון ומים בכלוב אד ליביטום.
   הערה: בחדרי המגורים בחדר עבודה זה, האורות נדלקים בשעה 7:00 בבוקר.
4. העבר עכברים למתקן לבדיקות התנהגותיות של בעלי חיים למשך שבוע לפחות לפני ניסויים^39,40.
5. טיפול ובדיקות התנהגותיות: ערכו את המבחן בשעה קבועה ביום. התאם את זמן ההתחלה בהתאם למחזור האור בחדרי הדיור של העכבר. ראשית, העבירו את העכברים לחדר הבדיקה ואפשרו להם להתרגל לחדר הבדיקה למשך 30 דקות לפחות בתאורה מעומעמת לפני תחילת המבחנים ההתנהגותיים.
   הערה: במחקר זה, ניסויים בעכברים בוצעו באופן שגרתי בין השעות 7:00-15:00 (יחסית ל-7:00 בבוקר אור דולק ו-7:00 בערב). לפיכך, ההתחלה בפועל של מבחן ההתנהגות מתרחשת בסביבות השעה 8 בבוקר.

2. הכנת חדר וציוד

1. הכינו חדר קטן עם שטחי רצפה כוללים בין 16-36 רגל (5-12 מ"^ר; 6 מ^"ר חדר בחדר עבודה זה). שמור על טמפרטורה עקבית, תאורה (תאורה מעומעמת מתכווננת) ורמות רעש (באופן אידיאלי אטום לרעש) עבור כל הניסויים.
   1. אם משתמשים במנורות עומדות (נורות 23 וואט, 120 וולט), מקם אותן במקומות סימטריים ומכל צד, במרחק של לפחות 1 מ 'מהמנגנון התלת-קאמרית, כדי להאיר את שני התאים הצדדיים באופן שווה.
2. הנח את המכשיר על שולחן לבן נייד. לניסוי הטיפוח העצמי, השתמש בכלובים נקיים ושקופים (71/2 אינץ' רוחב x 111/2 אינץ' אורך x 5 אינץ' H כלובי פלסטיק לעכבר); השתמש בכלוב אחד לכל עכבר בדיקה. מלאו כלובים בכ-1 ס"מ של מצעים טריים ללא חומר קינון. השתמש באותו סוג מצעים כמו בכלוב הביתי (כאן, מצעי קלחי תירס טריים ([1/4 אינץ 'מצעי קלחי תירס]).
   הערה: הכלובים צריכים להיות בגודל זהה לכלובים הביתיים, עם מכסה פילטר מונח מעל, אך ללא רשת מתכת (המשמשת בדרך כלל להחזקת בקבוקים ומשלוח מזון).
3. עבור הניסוי החברתי, השתמש במנגנון בן שלושה חדרים סט⁴¹. כל תא הוא בגודל 20 ס"מ על 40 ס"מ על 22 ס"מ ומוקף בקירות פרספקס. כל תא צדדי נגיש מהמרכז באמצעות דלתות הזזה שקופות הניתנות להסרה (5X8 ס"מ). השתמש בשני כלובי תיל (קוטר: 7 ס"מ, גובה: 15 ס"מ; עם מכסי כיסוי (ריקים או מחזיקים עכברים זרים). הכלוב מוגבה ומוקף במוטות תיל חלקים מנירוסטה (קוטר מוט: 3 מ"מ, מרווח מוטות: 7 מ"מ). אל תכלול ישיבה על גבי הכלובים כזמן אינטראקציה.
   1. אם עכברים זכרים ונקבות נכללים שניהם בניסוי, סמן כל כלוב תיל על תפקידו הייעודי למזער זיהום צולב.
4. הגדר מצלמות עיליות או קדמיות על חצובות להקלטות וידאו. ודא שהמצלמות טעונות במלואן ויש להן מספיק אחסון.
5. בין כל ניסוי בעכבר הבדיקה, נקו היטב את מערך שלושת החדרים ואת כלובי התיל עם חומר ניקוי נטול ריח (כאן, Versa-Clean). יש לדלל את חומר הניקוי במי ברז ביחס של 1:40, למרוח אותו על המשטח המלוכלך ולייבש את המשטחים במגבת נייר לפני הבדיקה הבאה כדי למזער את שאריות הריח מהעכבר הקודם.
   הערה: אין להשתמש באלכוהול אתילי (70%) או בחומרי חיטוי אחרים עם ריחות לניקוי המכשיר במהלך בדיקות אינטראקציה חברתית, מכיוון שהם עלולים להשפיע על התנהגות חברתית של מכרסמים.
6. השתמש בתריסי פרטיות, כגון לוחות פלסטיק לבנים, שניתן למקם סביב המכשיר כדי למנוע רמזים חיצוניים לחדר.
7. הכן לוח לבן קטן וטוש. רשום מידע חיוני על הלוח, כולל מספר העכבר, כותרת הניסוי, התאריך והשעה של הניסוי.
   הערה: הלוח מוצג למצלמה בסוף ההקלטה כדי למנוע מהאדם שנותן ניקוד לדעת את מספר העכבר לפני הערכת התנהגות העכבר. המחקר הבטיח שהתנהגות הניקוד האישית תישאר עיוורת לקבוצות הניסוי כדי למזער הטיה פוטנציאלית.

3. טיפול

1. בצע נהלי טיפול במשך שלושה ימים רצופים לפני תחילת הניסויים ההתנהגותיים.
2. ערכו מפגשי טיפול באותו חדר בדיקות בשעה קבועה, באופן אידיאלי בבוקר כאשר העכברים פעילים יותר.
3. בכל אחד משלושת הימים, הביאו את העכברים לחדר הבדיקה והשאירו אותם ללא הפרעה למשך 30 דקות באור עמום כדי להתאקלם.
4. לאחר תקופת התאקלמות של 30 דקות, פתחו את הכלוב והכניסו יד עטויה כפפה לכלוב. אפשר לעכברים לחקור את היד למשך דקה אחת.
5. גורפים בעדינות את העכברים על היד (או השתמשו בצינור קרטון קטן כדי להרים אותם), והחזיקו אותם בצורה רופפת. אפשר לעכברים לחקור את היד ופרק כף היד למשך 1-2 דקות. במקרים שבהם עכבר קופצני או אגרסיבי, הנח אותו על הרשת ואפשר לו להרכיב את עצמו.
6. המשך לטפל עד שהעכבר ירגיש בנוח להישאר על היד. החלף תמיד את הכפפות לפני הכנסת הידיים לכלוב הבא.
7. לאחר הטיפול בכל כלוב של עכברים, הכניסו אותם בעדינות לכלוב הביתי שלהם, ולאחר מכן חזרו על ההליך.
8. לבשו כפפות חדשות וטפלו בעכברים זרים כאשר כל עכברי הניסוי והביקורת טופלו כדי להימנע מהשפעה על עכברי הניסוי עם מסרים ריחניים.
9. טפל בעכברים הזרים באותו אופן.
10. אופציונלי: הרגילו את העכברים הזרים לכלוב התיל ולמנגנון התלת-קאמרי למשך 10-15 דקות.
    הערה: מפגש הרגלה זה מסייע בהפחתת תסיסה והתנהגויות חריגות בעכברים זרים במהלך המבחן התלת-קאמרית. עם זאת, עבור מבחן שלושת החדרים, מחקר זה מתייחס רק להתנהגות גישה חברתית (רחרוח) של הכלוב שיזם עכבר הבדיקה, בין אם עכבר זר נוכח או לא. רחרוח הדדי על ידי העכבר הזר אינו ניתן לצפייה מהימנה בבדיקה זו ולכן אינו נספר. בשל מגבלה זו של הבדיקה התלת-קאמרית וכדי למזער זיהום צולב של אותות כימיים (כגון ריחות), במקרה זה, לעכברים הזרים לא היה ניסיון קודם עם כלוב התיל והמכשיר לפני תחילת הניסוי.

4. שיטה 1: טיפוח עצמי להתנהגות חוזרת (איור 1A)

1. בצע את כל הניסויים ההתנהגותיים בין השעות 7:00-15:00.
2. הפעל אורות מעומעמים, כמתואר לעיל. נקו את השולחן והקימו את החדר.
3. הכן כל כלוב בדיקה בשכבה דקה של מצעים טריים (כמתואר בשלב 2.2).
4. הניחו 1-2 כלובים על השולחן, מופרדים זה מזה ומסביבת החדר על ידי תריסי פלסטיק לבנים.
5. הנח מצלמה מול כל כלוב כדי ללכוד את עכבר הבדיקה.
6. העבירו את כל העכברים לחדר וכסו את הכלובים ביריעת בד במהלך תהליך ההעברה כדי למנוע לחץ.
7. הסר את הסדין לאחר הנחת העכברים בחדר הבדיקה, והשאיר אותם בחדר לפחות 30 דקות עם אורות מעומעמים לפני תחילת הניסוי.
8. בתחילת הבדיקה, רשום את מספר זיהוי העכבר ופרטי הבדיקה על לוח ציור (כמתואר בשלב 2.7).
9. התחל להקליט והנח את עכבר הבדיקה בכלוב הבדיקה.
10. צא מהחדר במהלך סשן ההקלטה של 20 דקות.
11. עבור כל בדיקה, קחו בחשבון את 10 הדקות הראשונות כהרגלה. השתמש ב-10 הדקות הבאות כדי להתבונן בהתנהגות הטיפוח ולתת לה ציון (ראה סעיף 6).
12. לאחר 20 דקות, חזור לחדר. הצג את לוח הציור למצלמה והפסק את ההקלטה.
13. הנח בעדינות את עכבר הבדיקה בחזרה לכלוב הביתי וחזור על הניסוי.
    הערה: איזון סדר הבדיקות בין קבוצות הניסוי והביקורת כדי להפחית השפעות חיצוניות שונות.
14. לאחר סיום הניסויים, החזירו את העכברים לחדר המגורים שלהם.

5. שיטה 2: מבחן אינטראקציה חברתית תלת-קאמרית (איור 2A)

1. בצע את כל הניסויים בין השעות 7:00-15:00.
2. נקו את השולחן והדליקו את האורות (אורות מעומעמים).
3. הניחו את מכשיר הפרספקס בעל שלושה תאים על השולחן מוקף בתריסי פרטיות.
4. הנח מצלמה אחת מעל, וודא שכל שלושת התאים נמצאים במסגרת ההקלטה של המצלמה.
5. העבירו את המבחן ועכברים זרים לחדר. מכסים את הכלובים ביריעת בד בתהליך ההעברה ומסירים את הסדין פעם אחת בחדר.
6. השאירו את העכברים בחדר לפחות 30 דקות עם תאורה מעומעמת לפני תחילת הניסוי.
7. התרגלות
   1. שמור את שלושת התאים ריקים בשלב ההתרגלות.
   2. כדי להתחיל, בחר עכבר בדיקה וכתוב את מספר הזיהוי על לוח הציור.
   3. לאחר מכן, הנח בעדינות את עכבר הבדיקה בתא המרכזי כשדלתות ההזזה עדיין סגורות.
   4. התחל להקליט ופתח את הדלתות כדי לאפשר לעכבר הבדיקה לחקור את שלושת החדרים הריקים.
   5. צא מהחדר ותן לעכבר הבדיקה להתרגל למנגנון למשך 10 דקות.
   6. לאחר השלמת ההתרגלות של 10 דקות, חזור לחדר. הנח את עכבר הבדיקה בעדינות לתא המרכזי וסגור את דלתות ההזזה.
   7. הצג את לוח הציור ועצור את המצלמה.
8. גישה חברתית (חפץ כלוב תיל חדש לעומת עכבר זר רומן 1)
   1. מקם שני כלובי תיל בתא השמאלי והימני. מקם את הכלובים הללו באלכסון זה מול זה בפינות כל תא, תוך הקפדה על מרווח של 5 ס"מ מהקיר, מה שמאפשר לעכבר הבדיקה להתרוצץ סביב הכלובים. בנוסף, ודא שהכלובים אינם פונים ישירות לדלתות החדר.
   2. בחר עכבר זר אחד והכניס אותו לאחד מכלובי התיל, בעוד שאין עכבר בכלוב התיל השני.
   3. כדי להתחיל את הבדיקה, לחץ על הקלטה והסר את שתי דלתות ההזזה. צאו מהחדר.
   4. אפשרו לעכבר הבדיקה לחקור כלוב תיל ריק בתא אחד ובכלוב המכיל עכבר זר (עכבר זר חדש 1 או S1) בתא השני למשך 10 דקות.
   5. לאחר 10 דקות, חזור לחדר. הצג את לוח הציור למצלמה וסיים את ההקלטה.
   6. הכנס מחדש את העכבר לתא המרכזי וסגור את הדלתות המחוברות.
      הערה: אל תסיר את כלובי התיל מההתקנה לאחר סיום מבחן הגישה החברתית כך שהם יישארו באותה תנוחה במהלך כל המשימה.
9. העדפה לחידוש חברתי (עכבר זר רומן 2 לעומת עכבר רומן 1)
   1. הנח עכבר חדש שמעולם לא נתקל בו לכלוב התיל הריק בעבר (עכבר זר חדש 2 או S2).
      הערה: S2 חייב להיות מכלוב ביתי שונה מ-S1.
   2. התחל להקליט ופתח את הדלתות המחוברות זו לזו כדי לאפשר לעכבר הבדיקה לחקור את המכשיר למשך 10 דקות.
   3. צאו מהחדר. עכבר הבדיקה יחקור שני כלובי תיל: האחד עם עכבר S1 שנתקל בו בעבר משלב הגישה החברתית והשני עם עכבר S2 שהוצג לאחרונה.
   4. לאחר 10 דקות, חזור לחדר. הצג את הלוח למצלמה וסיים את ההקלטה.
   5. החזירו את כל העכברים (עכברי מבחן וחדשים זרים) לכלובי הבית שלהם.
   6. יש לנקות היטב את התאים וכלובי התיל בעזרת חומר חיטוי נטול ריח. ודא שהמנגנון מיובש לפני השימוש בו לניסוי הבא.
   7. חזור על הניסוי עבור כל עכברי הבדיקה הנותרים.
      הערה: החלף את מיקום הכלובים עם עכברי S1 ו-S2 בין החדר השמאלי והימני עבור עכברי הבדיקה השונים. האיזון מונע העדפה מוטה כלפי תא מסוים של המנגנון.
   8. לאחר הבדיקה, החזירו את העכברים למתקן הדיור.
   9. בין כל חלק של הבדיקה, עצור והפעל מחדש את המצלמה, וכתוצאה מכך סרטונים של 3 פעמים 10 דקות לכל עכבר בדיקה.

6. ניקוד וניתוח סטטיסטי

1. ציוד הכרחי
   1. השתמש בשני שעוני עצר ובמחשב או במחשב נייד עם התוכנות הבאות: Microsoft Excel, GraphPad Prism ותוכנות סטטיסטיות אחרות כגון SPSS לצורך ניקוד, התוויית הגרפים וניתוח סטטיסטי.
2. ניקוד טיפוח עצמי
   הערה: כאשר עכבר ממוקם בסביבה נוחה, ניתן להבחין בהתנהגות טיפוח עצמי ספונטנית במתח נמוך. בדרך כלל, עכברים מתחילים טיפוח על ידי ליקוק כפותיהם סביב האף והשפם (שלב I). לאחר מכן עשויים להגיע שלבים II ו-III, שבהם העכבר ממשיך לנגב את כל פניו וראשו בכפותיו. בשלב IV העכבר ממשיך לטפח את גופו וללקק את זנבו¹⁴. בהתחשב בתדירות הנמוכה של טיפוח האוזניים (שלב III) והזנב (שלב IV) בתוך תקופת בדיקה של 10 דקות, ובמטרה לשפר את הבהירות של ניתוח ידני, התנהגות טיפוח עצמי סווגה לשני סוגים עיקריים: טיפוח רוזטל וטיפוח זנב. טיפוח רוסטרל כולל פעילויות כמו ליקוק כפות, טיפוח האף ושטיפה יסודית של הפנים, האוזניים והראש. טיפוח הזנב כולל ליקוק חלק הגוף המכסה אזורים כמו הבטן, הגב, הגפיים האחוריות ואזור איברי המין, כמו גם הזנב.
   1. התבונן בזהירות בהתנהגות הטיפוח ורשום את ההתקפים. מפגש טיפוח פרטני מתרחש כאשר העכבר עוסק במופע יחיד של טיפוח עצמי. שקול מפגש טיפוח מהרגע שהוא מתחיל ועד שהוא מפסיק, ללא קשר להתנהגויות הטיפוח הספציפיות המעורבות.
   2. אם עכבר הבדיקה משהה את הטיפוח שלו למספר שניות מבלי לשנות מיקום, ספור אותו כחלק מאותו התקף. אולם אם העכבר מפסיק לטפח ומתחיל לחקור, קחו בחשבון שהתקף הטיפוח הסתיים.
   3. בנוסף, הקלט סשן טיפוח מלא רק כאשר העכבר מטפח ברציפות מקדימה לאחור (משלב I עד שלב IV).
   4. תעד את זמן הטיפוח הכולל, מספר התקפי הטיפוח ומספר התקפי הטיפוח המלאים שנצפו במהלך תקופת הבדיקה של 10 דקות, וסמן תצפיות במרווחים של 2 דקות, 5 דקות ו-10 דקות.
3. מבחן אינטראקציה חברתית תלת-קאמרית
   הניתוח קובע את הזמן והתדירות של אינטראקציית הרחרוח עם כל עכבר (S1 חדש וכלוב ריק לגישה חברתית, ו-S1 ו-S2 חדשים להעדפה לחידוש חברתי).
   1. השתמש בשני טיימרים כדי לתעד את זמן האינטראקציה עם העכבר בכל כלוב ואת הזמן הכולל שהושקע בכל תא. עבור כל חלק של המבחן (גישה חברתית והעדפה לחידוש חברתי), רשום את מספר הפעמים שעכבר הבדיקה נכנס לכל חדר (סך כל הכניסות).
   2. קבע את הזמן בתאים/ים על ידי נוכחות גוף עכבר הבדיקה בתוך אחד התאים (ארבע כפות חייבות להיכנס).
   3. רשום זמני אינטראקציה כאשר עכבר הבדיקה מרחרח את העכבר הזר החדש (מגע פנים ישיר או רחרח את זנבו של העכבר הזר) או מרחרח את הכלוב הריק. אל תתייחסו לישיבה על החלק העליון של הכלוב כאינטראקציה.
   4. הקלט ב-2 דקות, 5 דקות ו-10 דקות. בצע ניתוח תלוי זמן.
   5. השווה את מדד האפליה החברתית (DI) בתוך הקבוצות.
      הערה: DI מחושב כך: DI = (זמן אינטראקציה עם עכבר S1 - זמן אינטראקציה עם הכלוב הריק)/זמן אינטראקציה כולל x 100. במהלך החלק של החידוש החברתי, עכברי הביקורת יתקשרו יותר עם S2 (עכבר לא מוכר) מאשר עם S1 (עכבר מוכר). החידוש החברתי (זיכרון חברתי) DI מחושב: DI = (זמן אינטראקציה עם עכבר S2 - זמן אינטראקציה עם העכבר המוכר (S1))/ זמן אינטראקציה כולל x 100.
4. ניתוח סטטיסטי
   1. השתמש במבחן T של תלמיד דו-זנבי לא מזווג כדי לחשב את ערכי ה-p עם רמה משמעותית שנקבעה ב-p <-0.05 עבור זמן הטיפוח העצמי, התקפים והתקפים מלאים, שבהם יש רק שתי קבוצות.
   2. עבור המבחן בן שלושת החדרים, השתמש במבחן T של תלמיד כדי לחשב את המובהקות הסטטיסטית של סך הערכים בין שתי קבוצות. כאשר ההנחה של השונות השווה של הנתונים בין הקבוצות אינה מתקיימת (מבחן לוין p < 0.05), בצע מבחן T של וולש כדי להתאים את הסטייה ולהשוות את הממוצעים של קבוצות בלתי תלויות.
      הערה: מדידת סך הערכים מעריכה את הפעילות הכוללת של העכברים. חששות פוטנציאליים עשויים להתעורר (הקשורים לליקוי מוטורי ורמות חרדה גבוהות של עכברים) אם קבוצת הניסוי תחקור את המנגנון התלת-תאי באופן משמעותי פחות מקבוצת הביקורת. כדי לטפל בכך, שקול להעריך תפקוד מוטורי והתנהגות דמוית חרדה באמצעות מבחני התנהגות דמויי דיכאון, שכן ניתן לייחס חקירה מופחתת למצבים אלה⁴².
   3. השתמש ב-ANOVA מעורב כדי להשוות את הזמן בכל תא ואת זמן האינטראקציה עבור כל בדיקה. בהתאם למספר הקבוצות והגורמים, השתמש ב-ANOVA דו-כיווני מעורב (2 גורמים: גנוטיפ וצד החדר, או אינטראקציה עם כלוב ריק ו-S1, או S1 ו-S2), או ANOVA תלת-כיווני מעורב (3 גורמים: גנוטיפ, טיפול וצד החדר, או אינטראקציה עם ריק ו-S1, או S1 ו-S2). ניתוח זה שימושי במיוחד לחשיפת האינטראקציה החברתית המובהקת סטטיסטית של עכברים בין גורמים שונים.
      הערה: גורמים אלה כוללים את ההשפעה העיקרית של גנוטיפ (השפעה של רקע גנטי שונה על התנהגויות חברתיות), ההשפעה העיקרית של אינטראקציה עם הכלוב (רחרוח והעדפה לעכבר זר חדש לעומת כלוב ריק או עכבר שנתקל בו בעבר), ההשפעה העיקרית של הטיפול (השפעת טיפולים תרופתיים שונים על התנהגויות חברתיות של עכברים), והאינטראקציה של הטיפול בגנוטיפ x (לחשוף כיצד הטיפול המיושם משפיע על הגנוטיפ).
   4. לאחר מכן, השתמש במבחן הפוסט-הוק של בונפרוני (רמת α שנקבעה ב-0.05) כדי להעריך עוד יותר את ההשוואה בין קבוצות שונות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

היעד של רפמיצין (mTOR) ביונקים ממלא תפקידים מכריעים במערכת העצבים המרכזית (CNS) על ידי ויסות סינתזת חלבון דה נובו ודיכוי אוטופגיה⁴³. חוסר ויסות של מסלול ה-mTOR וסינתזת החלבון הסינפטי היה מעורב ב-ASD²⁸. מחקרים כלל-גנומיים על חולי ASD זיהו מוטציות גנטיות...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

רוב הגורמים האטיולוגיים, השינויים הפתולוגיים והסמנים הביולוגיים של ASD אינם ידועים או זמינים. אבחון ASD מבוסס בעיקר על שתי קבוצות מבוססות של תסמינים קליניים: ליקויים מתמשכים בתקשורת חברתית והתנהגויות חוזרות ונשנות מוגזמות 18,19,55.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4'' Teklad Corncob Bedding	Harlan, TEKLAD	7092-7097	The raw stock for corncob bedding products  is 100% corncob. No other components or additives are used.
HD Video Recording Cameratraditional Video Camera	Sony	HDRCX405	50 Mbps XAVC S1 1920 x 1080 at 60P, AVCHD and MP4 codecs. 30x Optical / 60x Clear Image Zoom to get closer to the action. 26.8 mm wide angle ZEISS Lens.
Nitrile Powder Free Examination Gloves	Aurelia, Transform	ASTM D6319-00	Tested for use with Chemotherapy drugs per ASTM D6978
Rodent Plastic Cage Bottoms	Ancare	AN75PLF	AN75 Mouse 7½” W x 11½” L x 5” H
TÅGARP floor lamp and bulbs	IEKA	604.640.49	Bulbs are 23 W 120 V.
Ugo Basile Sociability Apparatus	Stoelting	60450	The Sociability Apparatus (3-chambered social test) is a valuable tool to study social behaviour in mice.
Versa-Clean	Fisherbrand	PVCLN04	Cleaning agent
Whiteboard and  Low Odor Dry Erase Marker	EXPO	NA	Dry erase markers in bold black