ריצוף RNA חד-תאי של עוברי עכברים שלמים מוטנטיים: מהאפיבלסט ועד סוף הגסטרולציה

Summary

מאמר זה קובע צינור להשעיה איכותית של תאים בודדים וגרעינים של עוברי עכברים גסטרולטיביים לצורך ריצוף של תאים בודדים וגרעינים.

Abstract

במהלך העשור האחרון, גישות חד-תאיות הפכו לתקן הזהב לחקר דינמיקה של ביטוי גנים, הטרוגניות של תאים ומצבי תאים בתוך דגימות. לפני התקדמות התא הבודד, ההיתכנות של לכידת הנוף התאי הדינמי ומעברי תאים מהירים במהלך ההתפתחות המוקדמת הייתה מוגבלת. במאמר זה, צינור חזק תוכנן לבצע אנליזה של תאים בודדים וגרעינים על עוברי עכברים מהיום העוברי E6.5 עד E8, המתאים לתחילת והשלמת הגסטרולציה. גסטרולציה היא תהליך בסיסי במהלך הפיתוח הקובע את שלוש שכבות הנבט: מזודרם, אקטודרם ואנדודרם, החיוניים לאורגנוגנזה. קיימת ספרות נרחבת על אומיקה חד-תאית המיושמת על עוברי פריגסטרולציה מסוג פראי. עם זאת, ניתוח חד-תאי של עוברים מוטנטיים עדיין נדיר ולעתים קרובות מוגבל לאוכלוסיות ממוינות FACS. זאת, בין היתר, בשל האילוצים הטכניים הקשורים לצורך בגנוטיפ, הריונות מתוזמנים, ספירת עוברים עם גנוטיפים רצויים להריון ומספר התאים לעובר בשלבים אלה. כאן מוצגת מתודולוגיה שנועדה להתגבר על מגבלות אלה. שיטה זו קובעת הנחיות רבייה והריון מתוזמן כדי להשיג סיכוי גבוה יותר להריונות מסונכרנים עם גנוטיפים רצויים. שלבי אופטימיזציה בתהליך בידוד העובר יחד עם פרוטוקול גנוטיפ באותו יום (3 שעות) מאפשרים לבצע תא בודד מבוסס מיקרו-טיפות באותו יום, מה שמבטיח את הכדאיות הגבוהה של התאים ותוצאות חזקות. שיטה זו כוללת גם הנחיות לבידודים אופטימליים של גרעינים מעוברים. לפיכך, גישות אלה מגדילות את ההיתכנות של גישות חד-תאיות של עוברים מוטנטיים בשלב הגסטרולציה. אנו צופים כי שיטה זו תקל על ניתוח האופן שבו מוטציות מעצבות את הנוף התאי של הגסטרולה.

Introduction

גסטרולציה היא תהליך בסיסי הנדרש להתפתחות תקינה. תהליך מהיר ודינמי זה מתרחש כאשר תאים פלוריפוטנטיים עוברים למבשרים ספציפיים לשושלת המגדירים כיצד נוצרים איברים. במשך שנים, גסטרולציה הוגדרה זמן רב כהיווצרות של שלוש אוכלוסיות הומוגניות ברובן: מזודרם, אקטודרם ואנדודרם. עם זאת, טכנולוגיות ברזולוציה גבוהה ומספר מתפתח של מודלים של תאי גזע עובריים ^1,2 חושפים הטרוגניות חסרת תקדים בין שכבות הנבט המוקדמות ^3,4. זה מצביע על כך שנותר עוד הרבה מה לגלות על המנגנונים המווסתים את אוכלוסיות התאים השונות של הגסטרולה. התפתחות עוברית של עכבר הייתה אחד המודלים הטובים ביותר לחקר החלטות מוקדמות לגבי גורל התא במהלך גסטרולציה ^3,5. הגסטרולציה בעכברים היא מהירה, שכן כל תהליך הגסטרולציה מתרחש תוך 48 שעות, מהיום העוברי E6.5 עד E8⁵.

ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות של תא בודד אפשרה מיפוי מפורט של התפתחות עוברי עכבר מסוג פרא, וסיפקה סקירה מקיפה של הנוף התאי והמולקולרי של עוברים במהלך גסטרולציה 3,4,6,7,8. עם זאת, ניתוח עוברים מוטנטיים בשלבים אלה הוא פחות נפוץ ולעתים קרובות מוגבל לאוכלוסיות ממוינות FAC ^9,10. הספרות המועטה משקפת את האתגרים הטכניים הקשורים למניפולציה והכנה חד-תאית של עוברים גסטרולטיביים הדורשים גנוטיפ. לכידת התהליך הדינמי של גסטרולציה יכולה להציב אתגרים בשל טבעו המהיר, במיוחד להבנת עוברים מוטנטיים. העיתוי והסנכרון של הריונות הם חיוניים, שכן אפילו הבדלים קלים בין הריונות מתוזמנים יכולים להתפרש בטעות כפנוטיפ התפתחותי הנובע מהגן המוטנטי. זה הופך להיות חשוב במיוחד כאשר הגן המוטנטי משפיע על תהליך הגסטרולציה^13,14. במחקר זה, נקבעו קווים מנחים להשגת הריונות מסונכרנים באמצעות הדמיה של פקקים בנרתיק (כלומר, מסת נוזל הזרע הקרוש שנוצר בנרתיק הנקבה לאחר ההזדווגות). בנוסף, אסטרטגיה נועדה להשיג נתונים חד-תאיים חזקים מעוברים מוטנטיים מ-E6.5 עד E8. אסטרטגיה זו פותחה כדי להתגבר על אילוצים הקשורים למספר הנמוך של עוברים עם הגנוטיפ הרצוי להריון ולירידה בכדאיות הנגרמת על ידי הקפאה-הפשרה של עוברים או תאים.

מאמר זה מתאר מתודולוגיה אופטימלית החל מקביעת הריונות מתוזמנים דרך פקקים וגינליים ועד לריצוף הסופי של תאים/גרעינים בודדים. שיטה זו מסבירה כיצד להגדיל את מספר ההריונות המסונכרנים כדי להשיג מספר גבוה יותר של עוברים עם גנוטיפ רצוי, בידודי תאים/גרעינים כדי לשפר את יכולת הקיום של התאים, ופרוטוקול גנוטיפ באותו יום. כתב יד זה מתאר גם את תהליך בידוד העוברים בנקודות זמן שונות של גסטרולציה. המתודולוגיה מסייעת להגדיל את מספר תאי העובר/גרעינים הסופיים ברי קיימא לריצוף, ומבטיחה נתוני ריצוף באיכות גבוהה. לכן, שיטה זו תפתח את הדלתות למחקרים חד-תאיים של עוברים גסטרולטיביים הדורשים גנוטיפ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

פרוטוקול זה וכל הניסויים המתוארים בבעלי חיים אושרו באופן רשמי ובהתאם להנחיות מוסדיות שנקבעו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת טמפל, העוקבת אחר ההנחיות הבינלאומיות של האגודה להערכה והסמכה לטיפול בחיות מעבדה. כל העכברים שתוארו היו על זן הרקע C57/BL6N. במחקרים אלה לא נצפו בעיות בריאותיות של בעלי חיים.

1. מושבת רבייה והריונות מתוזמנים

1. הזמן את ההריונות על ידי הדמיה של פקק בנרתיק. צהריים ביום התקע נחשב E0.5.
2. עכברי בית בכלובים עם חומר מצע המכיל מצעי עץ סדוקים וחומר קינון נייר.
   1. כל כלוב מכיל צ'או עכבר, מים מתוקים ופריט העשרה (למשל, מנהרה וחומר קינון). עקוב אחר מידע המושבה ואסוף אותו מדי יום במהלך הרבייה המתוזמנת.
   2. רשמו את כל המידע כגון גיל העכבר, מספר ההריונות שהיו לעכברה נקבה, מספר התקעים שהונחו על-ידי עכבר זכר ושלב הייחום (איור 2) עבור נקבות עכברים.
      הערה: נקבות שכבר המליטו 1-2 פעמים יספקו המלטה גדולה יותר בהריונות עתידיים.
3. לפני תחילת הריונות מתוזמנים, לשכן את העכבר הזכר לבד בכלוב 1 שבוע לפני הרבייה. במהלך השבוע של תחילת הרבייה, להציג לפחות נקבה אחת לכל זכר בכלוב.
   הערה: בהתאם לפרוטוקול בעלי החיים המאושר, הוספת 2-3 נקבות לכלוב רבייה עשויה להיות מותרת ומועדפת להגדיל את ייצור התקע.
4. הגדר לפחות 4 שלישיות רבייה (2 עכברים נקבות עד זכר אחד) כדי להגדיל את הסיכויים להריונות מסונכרנים על פני הכלובים (כלומר, תקעים מרובים באותו יום). זה יגדיל את מספר העוברים שבודדו באותו שלב התפתחותי.
5. ארגנו הזדווגות אידיאלית בשעות אחר הצהריים או הערב לפני השעה 17:00, והנקבות יוכנסו לכלוב של הזכר או להיפך. אם הרבייה אינה מתרחשת תוך 4-5 ימים, שקול להחליף שותפים להזדווגות כל יומיים.
   הערה: אם לא ניתן לבדוק אם יש פקק בנרתיק למחרת בבוקר, יש להפריד בין זוג הרבייה בלילה הקודם (כלומר, סופי שבוע/חגים).
6. בדוק אם יש תקעים בנרתיק כל יום בשעות הבוקר המוקדמות; לפני 9 בבוקר עדיף.
   1. כדי לבדוק אם קיימים פקקים בנרתיק, הרימו בעדינות את נקבות העכברים בבסיס הזנב והתבוננו בפתח הנרתיק. חפשו מסה ג'לטינית בצבע לבן או קרם. לעתים קרובות, פקק הנרתיק יכול להיות ברור, אבל אם לא ברור, לקחת פינצטה ולבדוק בעדינות את פתח הנרתיק. שקול רק את התקעים הנראים יותר לבידוד. עיין באיור 2C.
      הערה: זה קריטי לבדוק תקעים בנרתיק מוקדם ככל האפשר בבוקר כדי למנוע פספוס הריון פוטנציאלי. תקעים יכולים ליפול או להתמוסס לאחר 12 שעות.
      הערה: גם אם נצפה תקע, זה לא מבטיח כי העכבר נקבה תהיה בהריון. אם נצפה פקק חלקי או ללא תקע אך יש אדמומיות ליד פתח הנרתיק של נקבות העכברים, אל תשקלו נקבות אלה לבידוד מכיוון שיש סיכוי קטן יותר שהתקע יידבק. הסבירות להריון לאחר הזדווגות משתנה בין זני עכברים ותלויה בשלב מחזור הייחום במהלך ההזדווגות (איור 2).
7. לאחר שנצפה פקק בנרתיק, רשום את היום. הצהריים של אותו יום שבו נצפה תקע הנרתיק נחשב E0.5. הפרידו את נקבות העכברים מכלוב הרבייה ובודדו את העוברים בהתאם לשלב הגסטרולציה הרצוי.
   הערה: שיטה זו אינה מספקת תזמון מדויק להזדווגות. באופן קונבנציונלי, ההנחה היא שההזדווגות מתרחשת בסביבות חצות בלילה הקודם. כתוצאה מכך, עוברים נחשבים בני חצי יום (E0.5) עד הצהריים ביום שבו נצפה פקק הנרתיק.

2. בידוד עוברי עכברים במהלך גסטרולציה

1. לפני תחילת בידוד העוברים, הכינו את כל הריאגנטים והציוד הנדרשים.
   1. נקו את האזור ביסודיות עם 70% אתנול. יש לוודא שכל כלי הדיסקציה (מלקחיים ומספריים) נשטפים ומעוקרים. יש להשיג 5 מ"ל סטריליים של מדיום הנשר המעובד (DMEM)/10% נסיוב בקר עוברי (FBS) של דולבקו ו-20 מ"ל ^DPBS-/- ולהניח על קרח.
   2. בצע את כל הבידודים באמצעות סטריאומיקרוסקופ עם במת אור משודרת ומצלמה כדי לסייע בפנוטיפ התפתחותי גס.
2. הרדימו את סכר העכבר ההרה והתחילו את הבידוד מיד.
   1. הניחו את הסכר ההרה בתא CO₂ כאשר קצב זרימת_CO2 מותאם לעקירת 20% מנפח הכלוב לדקה. עקוב אחר העכבר מקרוב ואשר את המוות על ידי התבוננות בהיעדר תנועות נשימה.
   2. שמור על זרימת CO₂ למשך 2 דקות נוספות לאחר היעדר תנועות נשימה. לאשר המתת חסד על ידי ביצוע נקע צוואר הרחם.
   3. מקמו את העכברים במצב עמידה רגיל על משטח יציב ושטוח. לאחר מכן, עם האגודל והאצבע הראשונה של יד אחת כנגד העורף בבסיס הגולגולת, דחפו קדימה ולמטה תוך משיכה לאחור כשהיד השנייה אוחזת בבסיס הזנב.
   4. ודא את יעילות הנקע על ידי הרגשת ההפרדה של חוליות צוואר הרחם. כאשר חוט השדרה נקטע, יהיה חלל של 2-4 מ"מ מוחשי בין הקונדילים העורפיים לחוליה הצווארית הראשונה.
      הערה: אין להרדים מספר סכרים בהריון בבת אחת, מכיוון שיכולת הקיום של התאים תושפע. איזופלואורן יכול לשמש כחומר הרדמה חלופי אם אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) או גוף מקביל.
3. מניחים את סכר ההריון על גבו ומעקרים את האזור הסמוך לפתח הנרתיק באתנול.
   1. בעזרת מספריים ופינצטה לדיסקציה, הרימו את קפל העור ליד פתח הנרתיק ובצעו חתך קטן בצורת V, החושף לאט לאט את הרחם של הסכר ההריוני (איור 3 [חץ צהוב]).
   2. נתחו את קרן הרחם של הסכר ההריוני על ידי החזקת קצה אחד שלו בפינצטה וחיתוך לאורכו, תוך הקפדה להסיר את צוואר הרחם. הניחו את קרן הרחם בתוך צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ המכילה DPBS^-/- על קרח (איור 3).
      הערה: בהתאם לשלב בידוד העוברים, הרחם יהיה דומה לאתרי השרשה קטנים או גדולים יותר (כלומר, 'פנינים' על חוט).
4. בעזרת מספריים ופינצטה לדיסקציה, חתכו כל אתר השתלה ("פנינים") המכיל את הנפיחות הנשירים בפנים והכניסו ל-DPBS טרי -^/- בצלוחית פטרי בקוטר 6 ס"מ על קרח (איור 3).
   הערה: בסכר הריון ממוצע יהיו כ-6-8 עוברים מושתלים.
5. קח אתר השתלה אחד והנח אותו על צלחת פטרי חדשה בקוטר 6 ס"מ על גבי שלב הסטריאומיקרוסקופ והוסף עליו 500 מיקרוליטר DPBS^-/- מעליו. התאימו את מוקד המיקרוסקופ ואת מקור האור (איור 3).
   הערה: בהתאם לגודל אתר ההשתלה, כמות DPBS עשויה להשתנות; המטרה היא שיהיה מספיק DPBS כדי שאתר ההשתלה יהיה שקוע.
6. באמצעות פינצטה דיסקציה עדינה, להסיר את שריר הרחם מאתר ההשתלה. החזיקו את אתר ההשתלה עם סט אחד של פינצטה ביד אחת והכניסו באיטיות זוג מלקחיים נוסף ביד השנייה לקצה אתר ההשתלה שנחתך מקרן הרחם, מה שחושף לאט את הנפיחות (איור 3).
   הערה: אין למשוך או למשוך חזק מדי על פני הרחם, כפי שהוא יכול להוביל לקרע של נפיחות נשירים או אפילו lysis של העובר.
7. לאחר שהנפיחות הנשירים מבודדת, המשיכו לחשוף את העובר.
   1. החזיקו את הקצה האנטי-מזומטריאלי של הנפיחות העשרונית עם זוג מלקחיים אחד, ועם הזוג השני, בצעו לאט חתך אופקי בערך 1/4 מגודל הנפיחות הנשירים מהקצה המזומטריאלי (כלומר, לעתים קרובות הקצה המחודד יותר של הנפיחות הנשירית).
   2. כעת, בעזרת שתי המלקחיים, דחפו באיטיות מהקצה האנטי-מזומטריאלי של הנפיחות הנשירית, והעובר ייצא מהקצה המזומטרי שזה עתה נחתך (איור 3).
      הערה: אין לקרוע לתוך נפיחות עשרונית, כמו זה ישבור את העובר. במידת הצורך, בצע חתכים קטנים יותר לאורך הקצה המזומטריאלי של הנפיחות הנשירה.
8. ברגע שהעובר נחשף, הסר את כל הרקמות החוץ-עובריות המצורפות.
   1. השק האנדודרמלי הקודקודי והחרוט האקטושלייתי עשויים לרדת באופן ספונטני מהעובר במהלך תהליך החשיפה, אך אם לא, השתמשו בזוג מלקחיים והוציאו אותם יחד עם כל דם אימהי נלווה. לאחר מכן, באמצעות שתי מלקחיות, החזיקו את העובר עם זוג אחד וקילפו לאט את שק החלמון הקרבי מהעובר באמצעות הקבוצה השנייה.
   2. באמצעות פיפטה P20, הניחו את שק החלמון עם לא יותר מ -10 μL של ^DPBS-/- מהצלחת לתוך צינור תגובת שרשרת פולימראז (PCR) בן 8 רצועות על קרח, מכיוון שזה ישמש לגנוטיפ באותו יום.
      הערה: קריטי שדגימת שק החלמון לא תהיה מזוהמת ברקמה מהסכר ההרה. זיהום עלול להוביל להקצאה גנוטיפית שגויה של העובר.
9. צלמו תמונות שדה בהירות של עוברים שזה עתה בודדו כדי להבטיח שההיערכות של ההמלטות דומה. עם פיפטה P200, פיפטה איטית למעלה את העובר עם 50 μL של DMEM / 10% FBS ומניחים אותו לתוך צינור 1.5 מ"ל על קרח. תנו לעוברים להישאר על קרח עד שהגנוטיפים יאושרו.
   הערה: העוברים נשמרו על קרח במשך 3-4 שעות ללא השפלה ברורה, אך אינם עולים על הפעם, מכיוון שתתרחש ירידה בכדאיות התא. תייגו את העוברים ואת צינורות הגנוטיפ בהתאם. מומלץ לצלם תמונות שדה בהירות כדי לזהות ולהוסיף ביאורים להבדלים פנוטיפיים גסים בין עוברים.
10. חזור על שלבים אלה עבור כל הנפיחויות הנשירים הנותרות. נקו את כל כלי הדיסקציה והשתמשו בפלסטיק חדש לכל בידוד כדי להבטיח שלא יהיה זיהום מבידודים קודמים.
    הערה: יש לוודא כי הליכי הדיסקציה מוגבלים לשעה אחת מרגע איסוף אתר ההשתלה מהסכר ההרה.
11. המשך לבודד עוברים מסכר ההריון הבא (אם זוהו הריונות מסונכרנים מרובים) לפני המעבר לשלב הגנוטיפ באותו יום.

3. גנוטיפ באותו יום (איור 4)

1. יש לעכל כל שק חלמון בטני בצינור PCR בעל 8 פסים. באמצעות פיפטה P20, הוסף 19.3 μL של מאגר DNA lysis תבנית PCR ו- 0.7 μL של 0.2 מיקרוגרם / מ"ל פרוטאינאז K לכל דגימת שק חלמון.
2. מערבלים את הדגימה במשך 10 שניות ומסתובבים כלפי מטה כדי למקם את הדגימות בתחתית הצינור באמצעות מיני צנטריפוגה עם מתאם רצועה ב 1,000 x גרם במשך 10 שניות. הניחו את צינור ה-PCR בעל 8 הפסים בבלוק חום של 85°C למשך 45 דקות ואת המערבולת למשך 5 שניות כל 5 דקות.
   הערה: חשוב לערבל דגימות בזמן העיכול כדי למקסם את הליזה התאית תוך 45 דקות.
3. לאחר 45 דקות, סובבו את רצועת הצינור כלפי מטה באמצעות מיני צנטריפוגה עם מתאם רצועה במהירות של 1,000 x גרם למשך 10 שניות, והמשיכו עם PCR לזיהוי גנטי רצוי. לשם השוואה, פרוטוקול לדוגמה עבור מערכת Cre-lox מסופק. להלן דוגמה לתנאי PCR עבור Cre genotyping. עצבו פריימרים כדי להגביר את אזורי 5' ו-3' של אתר Cre הממוקד.
4. כדי לבצע את תגובת ה-PCR עבור Cre genotyping, הכינו תערובת מאסטר PCR לכל צינור PCR בן 8 רצועות עבור כל שק חלמון המכיל 10 μL של תערובת Taq DNA פולימראז, 0.5 μL של פריימר Cre קדמי של 0.5 מיקרומטר, 0.5 μL של פריימר Cre הפוך של 0.5 מיקרומטר, 5 μL של מים מאושרי PCR, ו-4 μL של DNA גנומי של שק חלמון.
   הערה: אם אתה משתמש בפרוטוקול שעבר אופטימיזציה לגנוטיפ זנב עכבר, הוסף כמות כפולה של DNA המשמשת בדרך כלל לתוצאות נקיות יותר.
5. לאחר ביצוע תערובת האב של PCR, הפעל את תוכנית הגברת המחזור התרמי של PCR. עבור גנוטיפ Cre, המחזור הוא כדלקמן: (1) 95 ° C במשך 3 דקות, (2) 95 ° C עבור 30 שניות, (3) 55 ° C עבור 30 שניות, (4) 72 ° C עבור 30 שניות, שלב חוזר 2-4 עבור 34 מחזורים, (5) 72 ° C במשך 10 דקות, (6) 4 ° C להחזיק. הפעל את מוצרי ה- PCR על ג'ל אגרוז 1% כדי להסיק מסקנות גנוטיפיות.
   הערה: אם יש צורך ביותר מ-PCR אחד לזיהוי גנטי, הפעל את תגובות ה-PCR בו-זמנית כדי למטב את התזמון. כדי לזרז את התהליך, הכינו את ג'ל האגרוז יום מראש ביום הניסוי ואחסנו אותו ב -4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. אין לשקול דגימות ללא גנוטיפים ברורים. קחו בחשבון הן את שלב הגנוטיפ והן את שלב ההתפתחות עבור דגימות, שכן המלטות יכולות להיות בשלבים שונים של גסטרולציה ועלולות להטות את התוצאות. בעת ביצוע הגנוטיפ של אללי LoxP, רצועות ה- PCR הצפויות בג'ל עשויות להשתנות בהתאם למנהל התקן Cre בשימוש. לדוגמה, אם דרייבר Cre מבוטא בשק החלמון הקרבי, רצועת Loxp תופיע מוזזה בעוברים Cre-positive (Cre+), בהשוואה ל-Cre-negative (Cre-). עם זאת, אם ה-Cre אינו מבוטא בשק החלמון הקרבי, גודל רצועת ה-Loxp יהיה זהה בעוברי Cre+ ו-Cre-comryos (כלומר, האללים של Loxp לא יהיו floxed בשושלת שק החלמון). עובר הנושא אלל Cre+ אחד ושני אללי Loxp נחשב לעובר KO מותנה. עם זאת, כדי לאשר את המחיקה של הגן floxed, מומלץ לבצע אישור של הנוקאאוט של הגן על התאים המבטאים את דרייבר Cre, או על ידי חזרה על פרוטוקול הגנוטיפ או על ידי ניתוח qPCR של רמות mRNA של הגן floxed (איור 4D, E).
6. אחסנו את שאריות דגימות שק החלמון המעוכל במקפיא בטמפרטורה של -20°C לאחסון לטווח ארוך.

4. דיסוציאציה תאית של עוברים ויכולת קיום התא

1. לאחר אישור הגנוטיפים, קח פיפטה P200 ופיפטה 50 μL של DMEM/10% FBS. אסוף עוברים עם אותו גנוטיפ לתוך צינור חדש של 1.5 מ"ל והנח את הצינור על קרח.
   הערה: אין להמשיך בניסוי אם אין לפחות 5 עוברים בקבוצה (E7-E7.5) או 3 (E7.75-E8), מכיוון שספירת התאים והכדאיות שלהם יפחתו מאוד.
2. לאחר איגום העוברים על בסיס גנוטיפים, אפשרו להם להתיישב בתחתית הצינור. שטפו את העוברים המאוגמים על ידי הוספת 50 μL של ^DPBS-/-, ואז המתינו עד שהעוברים יתיישבו לפני שתוציאו כמה שיותר DPBS^-/- מבלי להסיר את העוברים מהצינור. חזור על שלב זה פעמיים.
   הערה: החזקת הצינור בנפח 1.5 מ"ל עד למקור אור או לכיוון חלון תקל על ראיית העוברים שוקעים בתחתית הצינור.
3. הוסיפו 100 מיקרוליטר טריפסין לעוברים המצטברים ודגרו בטמפרטורה של 37°C בבלוק חום למשך 5 דקות. העבר בעדינות את צינורות 1.5 מ"ל כל 30 שניות כדי לעזור לתאים להתנתק.
   הערה: אין להשתמש במערבולת או פיפטה במהלך תהליך הטריפסיניזציה, מכיוון שהיא פוגעת בתאים. אם מאגדים יותר מ-5 עוברים (E7-E7.5) או 3 עוברים (E7.75-E8), יש לבצע עיכול טריפסין בצינור אחר עם כמות שווה ערך של טריפסין (~20 מיקרוליטר לעובר אחד). השתמש ~ 20 μL של טריפסין לכל עובר (E6.5-E7.5), 35 μL לכל עובר (E7.75), ו 40 μL עבור עובר (E8).
4. לאחר 5 דקות, נטרל את הטריפסין עם 300 μL של DMEM/10% FBS. צנטריפוגה את העוברים המאוגמים ב 100 x גרם במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר (RT). לאחר הצנטריפוגה, גלולה קטנה תופיע עבור כל הדגימות. השהה מחדש את הכדוריות ב 40 μL של DMEM / 10% FBS והנח אותם על קרח.
   הערה: גודל הגלולה ישתנה בהתאם למספר העוברים המאוגמים. ייתכן כי הגלולה אינה נראית לעין אלא להמשיך לשלב הבא. כמות DMEM/10% FBS הנדרשת לנטרול טריפסין תהיה תלויה בכמות הטריפסין שנוספה. הוסף פי 3 מכמות DMEM/10% לכמות הטריפסין.
5. קבע את ריכוז התאים המרחפים מחדש (40 μL) באמצעות מונה תאים אוטומטי. מערבבים 5 μL של תאים עם 5 μL של כחול טריפאן בצינור חדש של 1.5 מ"ל. פיפטה מערבבים היטב פיפטה על שקופית כדי לקבוע את מספר התא ואת כדאיות התא. הריכוז האופטימלי של תאים הוא 700-1200 תאים/μL, ויכולת הקיום של התא היא 90% ומעלה.
   הערה: אם הריכוז נמוך מ-200 תאים/מיקרוליטר והכדאיות נמוכה מ-50%, אין להמשיך בניסוי. אם ריכוז התאים גבוה מדי, דללו את תרחיף התא וספרו שוב תאים. אם נצפים גושי תאים, השתמש במסננת תאים כדי להבטיח השעיה של תא יחיד.
6. המשך לחלוקה של תא בודד באמצעות שבב מיקרופלואידי ופעל לפי הפרוטוקול של יצרני השבבים המיקרופלואידים¹¹.

5. עוברי עכבר מבודדים גרעינים (אפשרות לנקודות זמן עובריות גדולות יותר מ-E8 ואילך)

1. הכינו ליזה טרייה ושטפו את מאגרי המתאר בטבלה 1, והניחו אותם על קרח.
   הערה: בידוד גרעינים יכול להתבצע על דגימות טריות או קפואות. אם הדגימות קפואות, אפשרו להן להפשיר במשך 2-5 דקות על קרח.
2. לפני תחילת הניסוי, לאשר את כל הגנוטיפים ולצרף רק עוברים עם גנוטיפים ברורים.
3. באמצעות פיפטה P200, הוסף 50 μL של חיץ גרעיני ליזה לעוברים מאוגמים בצינור של 1.5 מ"ל, במטרה למינימום של 3 עוברים לכל קבוצה מוטנטית. אפשר לדגימות לשבת על קרח עם חיץ ליזיס למשך 5 דקות ומערבולת כל 30 שניות.
4. לאחר 5 דקות של דגירה, צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. באמצעות פיפטה P200, להסיר את supernatant ולתלות מחדש את הגלולה ב 50 μL של חיץ שטיפה. לאחר השעיה מחדש, צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
5. הסר את supernatant ו resuspend ב 40 μL של ^DPBS-/-. ספור את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי. מערבבים 5 μL של גרעינים עם 5 μL של כחול טריפאן בצינור חדש של 1.5 מ"ל. פיפטה את התערובת ביסודיות ולטעון אותו על שקופית כדי לקבוע את מספר התא ואת הכדאיות.
   הערה: קרום הגרעין חדיר לכחול טריפאן; לכן, כתם הגרעינים המבודדים חיובי לכחול טריפאן. במונה תאים אוטומטי, אחוז התאים המתים משמש להערכת אחוז הגרעינים המבודדים (איור 5A).
6. אם אחוז הגרעינים השלמים גדול מ-90% (כלומר, לפחות 90% מהגרעינים מוכתמים בכחול טריפאן ומציגים צורה מעוגלת והיבט טורגידי; עיין באיור 5B, C), המשך להשתמש בשבב מיקרופלואידי ופעל לפי פרוטוקול מיצרני השבבים המיקרופלואידים¹¹.

6. חלוקה חד-תאית (כולל הגברה cDNA ובניית ספרייה)

1. המשך באופן מיידי עם פרוטוקול ריצוף RNA חד-תאי בהתאם לפרוטוקול¹¹ של יצרן השבבים המיקרופלואידים לקבלת התוצאות האופטימליות ביותר. הגדר את שחזור תאי היעד ל- 6000 תאים ומעלה.

7. רצף

1. לאחר בניית הספריות, מדדו את התפלגות גודל המקטע ואת ריכוזי הדגימות באמצעות מנתח אלקטרופורזה אוטומטי.
   הערה: התפלגות גודל המקטע האופטימלית היא בין 300-1000 bp.
2. הדגימות מוכנות לטעינה לתוך הרצף. ספריות בריכה מדוגמאות שונות יחד. ריכוז הטעינה הסופי של ספריות מאוגמות הוא 750 pM בנפח כולל של 24 μL. טען את הספריות המאוגדות למחסנית המגיב, בהתאם לפרוטוקול יצרן הרצף¹².
3. רצף את הספריות הטעונות לתוך תא הזרימה והמחסנית שהורכבו מראש בהתאם לעומק הרצף הרצוי עם אינדקס כפול. קריאות הריצוף הנצמדות לפרוטוקול שהותוו על ידי יצרני שבבים מיקרופלואידים הוא כדלקמן:¹¹: קרא 1: 28 מחזורים, מדד i7: 10 מחזורים, מדד i5: 10 מחזורים, וקרא 2: 90 מחזורים. לאחר השלמת הריצוף, הנתונים עוברים ניתוח ביואינפורמטיקה.
4. השתמש בשיטות ביואינפורמטיקה כדי לבצע בקרות איכות. זה כולל הערכת מספר התאים המרוצפים, קריאות לכל תא ומספר הגנים שמופו לכל תא.
   הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, מספר התאים המרוצפים הוא לפחות 80% מתאי היעד. מומלץ שמספר הקריאות בכל תא יהיה לפחות 30,000, ומספר הגנים שזוהו גבוה מ-3000 (עבור דגימות עכברים).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

המתודולוגיה שתוכננה במאמר זה נועדה במיוחד לשפר את הכנת דגימות העוברים עבור אומיקה חד-תאית מ-E6.5 עד E8. הצינור החזק הזה מורכב מחמישה שלבים עיקריים: הריונות מתוזמנים מסונכרנים, בידודים של עוברים, גנוטיפ באותו יום, דיסוציאציה של תאים והערכת כדאיות התא (איור 1A). בעוד שהנתונים המו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

במאמר זה מוצג צינור איתן להשגת תרחיפים חד-תאיים וגרעינים באיכות גבוהה מעוברי עכברים מגזימים, שתוכננו במיוחד כדי להקל על מחקרים על מנגנונים של אפיון גורל התא בהתפתחות מוקדמת. שיטה זו מטפלת בפער מכריע בתחום הגסטרולציה על ידי אופטימיזציה של ניתוח עוברים הדורשים גנוטיפים, כגון מין או גנים סו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-202
1000 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	23-430
20 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-404
300 µL Reach Barrier Tip	Genesee Scientific	24-415
37 µm Reversible Strainer, small	Stem Cell	27215
6 cm Petri dish	Genesee Scientific	25-260
8-strip PCR tubes	Genesee Scientific	27-125U
Agarose	Apex Bioresearch Product	20-102
Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry Bath	Genesee	31-437
Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated Microcentrifuge	Genesee	33-759R
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Chromium Controller	10X	PN-1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X	PN-1000269
Countess 3 Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX2000
Countess Cell Couning Chamber Slides	Invitrogen	C10283
D1000 Reagents	Agilent	5067-5583
D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582
Digitonin	ThermoFisher Scientific	BN2006
DirectPCR yolk sac	Viagen	201-Y
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861
DNA LoBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	22431021
Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)	CORNING	10-013-CV
Dulbecco's PBS	GenClone	25-508
Dumont #5 Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Ethanol	Koptec	V1401
EVOS M7000 Imaging System	Invitrogen	AMF7000
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-11
GoTaq G2 Green Master Mix	Promega	M7823
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11049-10
MgCl2	ThermoFisher Scientific	AC223211000
MiniAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems	A37834
NaCl	Fisher Chemical	S271-500
NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3	Illumina	20046811
NextSeq2000	Illumina
Nikon SMZ 1000 Stereo Microscope	Nikon
Nondiedt P40	Sigma-Aldrich	74385
Nuclease-free Water	GenClone	25-511
Optical Tube 8x Strip (401428)	Agilent	401428
Optical Tube Cap 8x Strip (401425)	Agilent	401425
Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/Unit	Genesee	31-511
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P6556
Qubit dsDNA Quantification Assay Kits	Invitrogen	Q32851
Qubit Flex 3	Invitrogen
RNase inhibitor	Fisher Scientific	12-141-368
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12
Tape Station Loading tips	Agilent	5067-5598
Tapestation 4150	Agilent	G2992AA
Tris-HCL (Ph7)	Quality Biological	351-007-101
Trypan Blue Stain 0.4%	Theromo Fisher Scientific	T10282
Tryple Express	Gibco	12604-021
Tween-20	Bio-Rad	1662404
Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapter	IKA	3617000