פיתוח טיפולים קומבינטוריים לפגיעות בחוט השדרה באמצעות העברת תאי גזע

Inha Baek; Younghye Song

doi:10.3791/66872

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

במחקר זה, פותחו ואופיינו הידרוג'לים מרוכבים מחקי עצב שניתן להשתמש בהם כדי לחקור ולהפיק תועלת מההתנהגות הפרו-רגנרטיבית של תאי גזע שמקורם בשומן לתיקון פגיעות בחוט השדרה.

Abstract

פגיעה טראומטית בחוט השדרה (SCI) גורמת לגירעון תחושתי-מוטורי קבוע מתחת למקום הפגיעה. היא משפיעה על כרבע מיליון אנשים בארה"ב, והיא מייצגת דאגה לבריאות הציבור לאין שיעור. נערך מחקר כדי לספק טיפול יעיל; עם זאת, SCI עדיין נחשב חשוך מרפא בשל האופי המורכב של אתר הפציעה. נחקרו מגוון אסטרטגיות, כולל אספקת תרופות, השתלת תאים וביו-חומרים הניתנים להזרקה, אך אסטרטגיה אחת לבדה מגבילה את יעילותן להתחדשות. ככזה, טיפולים קומבינטוריים זכו לאחרונה לתשומת לב שיכולה להתמקד במאפיינים מרובי פנים של הפציעה. הוכח כי מטריצות חוץ-תאיות (ECM) עשויות להגביר את היעילות של השתלת תאים עבור SCI. לשם כך, הידרוג'לים תלת מימדיים המורכבים מחוטי שדרה נטולי תאים (dSCs) ועצבים סיאטיים (dSNs) פותחו ביחסים שונים ואופיינו. ניתוח היסטולוגי של dSCs ו-dSNs אישר את הסרת הרכיבים התאיים והגרעיניים, וארכיטקטורות רקמות מקומיות נשמרו לאחר דה-סלולריזציה. לאחר מכן, הידרוג'לים מרוכבים נוצרו ביחסים נפחיים שונים ועברו ניתוחים של קינטיקה של ג'לציה עכירות, תכונות מכניות וכדאיות תאי גזע משובצים שמקורם בשומן אנושי (hASC). לא נמצאו הבדלים משמעותיים בתכונות המכניות בין היחסים השונים של הידרוג'לים ומטריצות חוט השדרה נטולות תאים. ASCs אנושיים המוטבעים בג'לים נותרו ברי קיימא לאורך כל התרבית בת 14 הימים. מחקר זה מספק אמצעי ליצירת הידרוג'לים קומבינטוריים מהונדסי רקמות המציגים ECM ספציפי לעצב ותאי גזע מזנכימליים פרו-רגנרטיביים. פלטפורמה זו יכולה לספק תובנות חדשות לגבי אסטרטגיות נוירו-רגנרטיביות לאחר SCI עם חקירות עתידיות.

Introduction

כ-296,000 אנשים סובלים מ-SCI טראומטי, ובכל שנה מתרחשים כ-18,000 מקרי SCI חדשים בארה"^ב. SCI טראומטי נגרם בדרך כלל מנפילות, פצעי ירי, תאונות דרכים ופעילויות ספורטיביות ולעתים קרובות גורם לאובדן קבוע של תפקוד תחושתי-מוטורי מתחת למקום הפציעה. ההוצאות המשוערות לכל החיים לטיפול ב-SCI נעות בין מיליון לחמישה מיליון דולר לאדם עם תוחלת חיים נמוכה משמעותית¹. עם זאת, SCI עדיין לא מובן היטב ובמידה רבה חשוך מרפא, בעיקר בשל השלכות פתופיזיולוגיות מורכבות לאחר הפציעה². אסטרטגיות שונות נחקרו, כולל השתלת תאים ופיגומים מבוססי ביו-חומרים. בעוד שהשתלת תאים וביו-חומרים הוכיחה פוטנציאל, האופי הרב-גוני של SCI מצביע על כך שגישות קומבינטוריות עשויות להיות מועילות יותר³. כתוצאה מכך, אסטרטגיות קומבינטוריות רבות נחקרו והוכיחו יעילות טיפולית טובה יותר מאשר רכיבים בודדים. עם זאת, יש צורך במחקרים נוספים כדי לספק ביו-חומרים חדשים להעברת תאים ותרופות³.

גישה מבטיחה אחת לייצור הידרוג'לים טבעיים היא דה-סלולריזציה של רקמות. תהליך הדה-סלולריזציה משתמש בשיטות יוניות, לא יוניות, פיזיקליות וקומבינטוריות כדי להסיר את כל או רוב החומרים התאיים והגרעיניים תוך שמירה על רכיבי ECM. על ידי הסרת כל או רוב הרכיבים התאיים, הידרוג'לים שמקורם ב-ECM פחות מגיבים למארח לאחר ההשתלה/הזרקה⁴. ישנם מספר פרמטרים שיש למדוד על מנת להעריך את איכות הרקמות שעברו דה-סלולריזציה: הסרת תכולת תאים/גרעין, תכונות מכניות ושימור ECM. הקריטריונים הבאים נקבעו כדי למנוע תגובות חיסוניות שליליות: 1) פחות מ-50 ננוגרם DNA דו-גדילי (dsDNA) למ"ג משקל יבש של ECM, 2) פחות מ-200 bp אורך מקטע DNA, ו-3) כמעט או ללא חומר גרעיני גלוי מוכתם ב-4'6-diamidino-2-phenuylindole (DAPI)⁵. ניתן לכמת תכונות מכניות על ידי בדיקות מתיחה, דחיסה ו/או ריאולוגיות, והן צריכות להיות דומות לרקמה המקורית⁶. בנוסף, ניתן להעריך את שימור החלבון על ידי פרוטאומיקה או בדיקות כמותיות המתמקדות במרכיבים העיקריים של רקמות נטולות תאים, למשל, למינין, גליקוזאמינוגליקן (GAG) וכונדרואיטין סולפט פרוטאוגליקן (CSPG) לחוט השדרה ^7,8. הידרוג'לים מאומתים שמקורם ב-ECM ניתנים להתאמה מחדש עם סוגים שונים של תאים כדי לסייע בטיפול מבוסס תאים⁹.

מגוון סוגי תאים, כגון תאי שוואן, תאי מעטפת ריח, תאי גזע מזנכימליים שמקורם במח העצם (MSCs) ותאי גזע/אב עצביים, נחקרו לתיקון SCI 10,11,12. עם זאת, השימוש הקליני בתאים אלה מוגבל עקב חששות אתיים, אינטגרציה דלילה עם תאים/רקמות שכנות, מחסור במקורות רקמה לתפוקה גבוהה, חוסר יכולת להתחדש בעצמו ו/או יכולת שגשוג מוגבלת 13,14,15. בניגוד לסוגי תאים אלה, MSCs שמקורם בשומן אנושי (hASCs) הם מועמדים אטרקטיביים מכיוון שהם מבודדים בקלות בצורה זעיר פולשנית באמצעות ליפואספיראטים, וניתן להשיג מספר רב של תאים¹⁶. בנוסף, ל-hASCs יש את היכולת להפריש גורמי גדילה וציטוקינים בעלי פוטנציאל להגנה עצבית, אנגיוגנטית, ריפוי פצעים, התחדשות רקמות ודיכוי חיסוני 17,18,19,20,21.

כפי שתואר, נערכו מחקרים מרובים 22,23,24, ונלמד מהם הרבה, אך מאפיינים הטרוגניים של SCI הגבילו את יעילותם בקידום התאוששות תפקודית. ככזה, הוצעו גישות קומבינטוריות להגברת יעילות הטיפול ב-SCI. במחקר זה, הידרוג'לים מרוכבים פותחו על ידי שילוב של חוטי שדרה נטולי תאים ועצבים סיאטיים לתרבית hASC תלת מימדית (3D). דה-סלולריזציה מוצלחת אושרה על ידי ניתוחים היסטולוגיים ו-DNA, ויחסים שונים של הידרוג'לים מרוכבים עצביים אופיינו בקינטיקה של ג'לציה ובדיקות דחיסה. הכדאיות של hASCs בהידרוג'לים המרוכבים של העצבים נחקרה כדי להוכיח שניתן להשתמש בהידרוג'ל זה כפלטפורמה לתרבית תאים תלת מימדית.

Protocol

רקמות החזיר הושגו באופן מסחרי, כך שלא נדרש אישור של ועדת האתיקה של בעלי החיים.

1. דה-סלולריזציה של חוט השדרה החזירי (זמן משוער: 5 ימים)

הערה: בצע את הפירוק באמצעות פרוטוקולים שנקבעו בעבר עם שינויים^25,26. כל ההליכים צריכים להיעשות בארון בטיחות ביולוגית סטרילי בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. יש לסנן את כל התמיסות באופן סטרילי באמצעות מסנן בקבוק עליון (גודל נקבוביות של 0.2 מיקרומטר) לבקבוקים שעברו חיטוי. הליכים שיבוצעו ב-37 מעלות צלזיוס יכולים להיעשות בתוך אינקובטור או תנור נקי המכוון ל-37 מעלות צלזיוס.

הכנת פתרונות דה-סלולריזציה
הערה: כל הפתרונות מחושבים עבור 1 ליטר. ייתכן שהמשתמשים יצטרכו להתאים את אמצעי האחסון הסופי הנדרש בהתאם לצרכים הניסיוניים שלהם.
1. יש לדלל 500 מ"ל של 0.05% חומצה טריפסין/אתילנדיאמין-טטראצטית (EDTA) עם 500 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) כדי לייצר 0.025% טריפסין/EDTA.
2. יש לדלל 300 מ"ל של 10% טריטון X-100 עם 700 מ"ל PBS כדי לייצר 3% טריטון X-100. מערבבים 0.56 גרם NaCl, 1.31 גרם NaH₂PO₄H₂O, ו-10.85 גרם HNa₂O₄P·7H₂O ב-1 ליטר מים נטולי יונים כדי ליצור 100 מ"מ Na/50 מ"מ מאגר פוס.
3. מערבבים 32.4 גרם סוכרוז בליטר אחד של מים נטולי יונים להכנת סוכרוז של 1 M. יש לערבב 40 גרם נתרן דאוקסיכולאט (SD) ב-1 ליטר מים נטולי יונים כדי ליצור תמיסת SD של 4%. יש לדלל 6.7 מ"ל של 15% חומצה פראצטית עם 993.3 מ"ל של 4% אתנול.
הכנת חוט שדרה חזירי
הערה: חוטי השדרה נשלחו קפואים ללא כל תמיסה ונשמרו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
1. יש להפשיר את חוט השדרה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במקרר למשך 18-24 שעות לפני הסרת התאית. השתמש במספריים סטריליים כדי להסיר את הדורה מאטר בזהירות.
2. חותכים את חוט השדרה לחתיכות קטנות (באורך של כ -1 ס"מ). מניחים חתיכה אחת בצינור של 15 מ"ל או מקסימום שלוש חתיכות בצינור של 50 מ"ל.
דה-סלולריזציה של חוט השדרה
הערה: לאחר כל שלב, תמיסות דה-סלולריזציה מוזגות ידנית לכוס גדולה להשלכה. ניתן להשתמש במסננת נירוסטה קטנה הניתנת לחיטוי כדי לסייע בהשלכת תמיסות דה-סלולריזציה מבלי לאבד את הרקמות הדרושות לכל שלב. חוט השדרה נסער ב-83 סל"ד אלא אם כן צוין אחרת.
1. שטפו את חוט השדרה במים נטולי יונים למשך 18-24 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ו-60 סל"ד.
2. שטפו את חוט השדרה עם 0.025% טריפסין/EDTA למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס ו-40 סל"ד. לאחר מכן, שטפו את חוט השדרה עם PBS למשך 15 דקות, פי 2.
3. שטפו את חוט השדרה עם 3% Triton X-100 למשך שעתיים. שטפו את חוט השדרה עם מאגר פוס של 100 מ"מ Na/50 מ"מ למשך 15 דקות, פי 2.
4. שטפו את חוט השדרה עם סוכרוז 1 M למשך שעה. לאחר מכן, שטפו את חוט השדרה במים נטולי יונים למשך שעה.
5. שטפו את חוט השדרה עם 4% SD למשך שעתיים. לאחר מכן, שטפו את חוט השדרה עם מאגר פוס של 100 מ"מ Na/50 מ"מ למשך 15 דקות, פי 2.
6. שוטפים את חוט השדרה עם 0.1% חומצה פראצטית באתנול 4% למשך 4 שעות. לאחר מכן, שטפו את חוט השדרה עם PBS למשך שעה.
7. שטפו את חוט השדרה במים נטולי יונים למשך שעה, פי 2. לאחר מכן, שטפו את חוט השדרה עם PBS למשך שעה.
8. ליופיליזציה של חוט השדרה בטמפרטורה של 0.01 מבר ו-56 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים ואחסון יבש עד לשימוש.

2. דה-סלולריזציה של עצב סיאטי חזירי (זמן משוער: 5 ימים)

הערה: בצע את הפירוק באמצעות פרוטוקול²⁷ שהוקם קודם לכן. כל ההליכים צריכים להיעשות בארון בטיחות ביולוגית סטרילי בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. יש לסנן את כל התמיסות באופן סטרילי באמצעות מסנן בקבוק עליון (גודל נקבוביות של 0.2 מיקרומטר) לבקבוקים שעברו חיטוי. הליכים שיבוצעו ב-37 מעלות צלזיוס יכולים להיעשות בתוך אינקובטור או תנור נקי המכוון ל-37 מעלות צלזיוס.

הכנת פתרונות דה-סלולריזציה
הערה: כל הפתרונות מחושבים עבור 1 ליטר. ייתכן שהמשתמשים יצטרכו להתאים את אמצעי האחסון הסופי הנדרש בהתאם לצרכים הניסיוניים שלהם.
1. הכן 50 מ"מ Na/10 מ"מ מאגר פוס על ידי ערבוב של 1.86 גרם NaCl, 0.262 גרם של d NaH₂PO₄H₂O, ו-2.17 גרם של HNa₂O₄P·7H₂O ב-1 ליטר של מים נטולי יונים.
2. הכן תמיסת 125 מ"מ סולפובטאין-10 (SB-10) על ידי ערבוב 38.4 גרם של SB-10 ב-1 ליטר של 50 מ"מ Na/10 מ"מ מאגר פוס.
3. הכן תמיסת 3% SD/0.6 מ"מ סולפובטאין-16 (SB-16) על ידי ערבוב של 30 גרם SD ו-0.24 גרם SB-16 ב-1 ליטר של 50 מ"מ Na/10 מ"מ מאגר פוס.
הכנת עצב סיאטי חזירי
הערה: עצבים סיאטיים נשלחו קפואים עם PBS ונשמרו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
1. יש להפשיר את העצב הסיאטי בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במקרר 18-24 שעות לפני הפירוק.
2. חותכים את העצב הסיאטי לחתיכות קטנות (באורך של כ -1 ס"מ). מניחים חתיכה אחת בצינור של 15 מ"ל או מקסימום שלוש חתיכות בצינור של 50 מ"ל.
דה-סלולריזציה של העצב הסיאטי
הערה: לאחר כל שלב, תמיסות דה-סלולריזציה מוזגות ידנית לכוס גדולה להשלכה, וניתן להשתמש במסננת נירוסטה קטנה הניתנת לחיטוי כדי לסייע בהשלכת תמיסות דה-סלולריזציה מבלי לאבד את הרקמות הדרושות לכל שלב. העצב הסיאטי נסער ב-15 סל"ד אלא אם כן צוין אחרת.
1. שטפו את העצב הסיאטי במים נטולי יונים למשך 7 שעות. לאחר מכן, שטפו את העצב הסיאטי עם 125 מ"מ סולפובטאין-10 (SB-10) במאגר פוס של 50 מ"מ Na/10 מ"מ למשך 18 שעות.
2. שטפו את העצב הסיאטי עם מאגר פוס 100 מ"מ Na/50 מ"מ למשך 15 דקות. לאחר מכן, שטפו את העצב הסיאטי עם 3% SD/0.6 מ"מ סולפובטאין-16 (SB-16) במאגר פוס של 50 מ"מ Na/10 מ"מ למשך שעתיים.
3. שטפו את העצב הסיאטי עם מאגר פוס של 100 מ"מ Na/50 מ"מ למשך 15 דקות, פי 3. לאחר מכן, שטפו את העצב הסיאטי עם 125 מ"מ SB-10 במאגר פוס של 50 מ"מ Na/10 מ"מ למשך 7 שעות.
4. שטפו את העצב הסיאטי עם מאגר פוס 100 מ"מ Na/50 מ"מ למשך 15 דקות. לאחר מכן, שטפו את העצב הסיאטי עם 3% SD/0.6 mM SB-16 במאגר פוס של 50 מ"מ Na/10 מ"מ למשך 1.5 שעות.
5. שטפו את העצב הסיאטי עם מאגר פוס של 50 מ"מ Na/10 מ"מ למשך 15 דקות, פי 3. לאחר מכן, שטפו את העצב הסיאטי עם 75 U/mL של דאוקסיריבונוקלאז (DNase) למשך 3 שעות ללא תסיסה.
6. שטפו את העצב הסיאטי עם מאגר פוס של 50 מ"מ Na/10 מ"מ למשך שעה, פי 3. לאחר מכן, שטפו את העצב הסיאטי עם 0.2 U/mL של כונדרואיטינאז ABC למשך 16 שעות ללא תסיסה ב-37 מעלות צלזיוס.
7. שטפו את העצב הסיאטי עם PBS למשך 3 שעות, פי 3. ליופיליזציה של העצב הסיאטי ב-0.01 מבר ו-56 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים ואחסון יבש עד לשימוש.

3. עיכול רקמות נטולות תאים וייצור הידרוג'לים מרוכבים (זמן משוער: 4 ימים)

קוצצים או טוחנים את הרקמות המפורקות לאבקה באמצעות מספריים או הומוגנייזר. עקרו את הכלים כדי לקצוץ או לטחון את הרקמות באמצעות חיטוי בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. שיטת תחמוצת האתילן ישימה גם היא.
עיכול הרקמות בנפרד בתמיסת חומצה הידרוכלורית (HCl) של 0.01 N המכילה 1 מ"ג/מ"ל פפסין בריכוז של 15 מ"ג/מ"ל. המשקלים המשוערים של חוט השדרה והעצב הסיאטי הם 50-100 מ"ג ו-100-150 מ"ג ליחידה, בהתאמה.
מניחים את הפס המגנטי ומערבבים ב-500 סל"ד ו-4 מעלות צלזיוס למשך 4 ימים לפחות ליצירת תמיסות פרה-ג'ל.
מערבבים פרג'ל עצב סיאטי וחוט שדרה ביחסים הנפחיים הבאים: 2:1, 1:1 ו-1:2. התאם את ה-pH 7.4 באמצעות 1 N נתרן הידרוקסיד (NaOH) ו-HCl ודלל לריכוז הרצוי באמצעות מדיה M199 ו-1x PBS. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
הערה: הוסף NaOH 1 μL בכל פעם. מדיית M199 יכולה לשמש כמחוון pH מכיוון שהיא הופכת לוורוד בהיר כאשר ה-pH הוא 7.4, אך יש להשתמש ברצועות pH כדי לאשר את רמת ה-pH.

4. אימות דה-סלולריזציה

צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E; זמן משוער: 8 ימים)
הערה: לאחר כל שלב שטיפה, התמיסות מוזגות ידנית לכוס גדולה שיש להשליך.
1. תקן חוט שדרה טרי ונטול תאים ועצב סיאטי בפורמלדהיד 3.7% בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות. מניחים חתיכה אחת בצינור של 15 מ"ל.
2. הסר פורמלדהיד והניח את הרקמות בסוכרוז 10% למשך יום אחד. הסר 10% סוכרוז והניח את הרקמות ב-30% סוכרוז למשך 6 ימים.
3. מלאו קריומולד בגודל מתאים בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) באמצע הדרך. הניחו את הרקמות נטולות התאים, כסו אותן ב-OCT ואפשרו להן לספוג את ה-OCT למשך יום אחד.
4. לאחר יום אחד, הקפיאו את הרקמות למשך הלילה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. הקפאת הרקמות בעובי של 10 מיקרומטר באמצעות קריוסטט.
5. יש לשטוף עם PBS 1x למשך 5 דקות, 2x. לאחר מכן, שטפו במי ברז למשך 5 דקות.
6. מכתים בתמיסת המטוקסילין למשך דקה. יש לשטוף במי ברז למשך דקה אחת, 3 פעמים.
7. מכתים בתמיסת אאוזין למשך דקה. שטפו עם 95% אתנול למשך דקה אחת, פעמיים ועם 100% אתנול למשך דקה אחת, פי 3.
8. שוטפים עם קסילן למשך דקה, 2 דקות ולאחר מכן דקה אחת. תן לשקופיות להתייבש במשך 5 דקות.
9. השתמש בצמר גפן כדי לטפטף 3-4 טיפות של תמיסת הרכבה של פוליסטירן קסילן (DPX) דיבוטילפתלט על המגלשות. הנח את פתקי הכיסוי על גבי שקופיות מכוסות DPX. תן למגלשות להתייבש למשך הלילה.
ניתוח DNA (זמן משוער: שעה)
1. שקלו רקמות נטולות תאים וליופיליזציה. לבודד ולכמת DNA באמצעות ערכות זמינות מסחרית בהתאם להוראות היצרן.

5. אפיון הידרוג'לים מרוכבים

בדיקת עכירות ג'לציה (זמן משוער: 1 שעה)
1. מניחים 100 מיקרוליטר של תמיסות פרה-ג'ל בכל באר של צלחת של 96 בארות על קרח. קרא ספיגה ב-405 ננומטר כל 2 דקות למשך 45 דקות באמצעות קורא צלחות.
2. חשב ספיגה מנורמלת באמצעות המשוואה הבאה:
  (ספיגה_{- ספיגה ראשונית}) / (_{ספיגה מקסימלית} -_{ספיגה ראשונית})
3. חשב את שיפוע העקומה ואת הזמן להשגת 50% ו-95% ג'לציה, t_1/2 ו-t₉₅, בהתאמה.
בדיקת דחיסה (זמן משוער: דקה אחת לכל הידרוג'ל)
1. ייצור הידרוג'לים מרוכבים בריכוז של 12 מ"ג/מ"ל בקוטר 8 מ"מ וגובה 2 מ"מ.
2. השתמש בריאומטר כדי לדחוס את הדגימות בעומס של 250 N בין לוחות מקבילים מנירוסטה בקצב מתח של 10% מגובה הדגימה/דקה. התוכנה המספקת קריאות ריאומטר תספק עקומת מתח-מתח על ידי הפעלת הכוח ומדידת המתח עד שההידרוג'לים נשברים.
3. חשב את המודול של יאנג מהשיפוע של האזור הליניארי של עקומות המתח-מתח.

6. תרבית תלת מימדית של ASCs אנושיים בהידרוג'לים מרוכבים עצביים

הכנת פלטפורמה תלת מימדית (תלת מימד) (זמן משוער: 3 שעות)
1. פרוסת סיליקון חרוטה עם פוטו-רזיסט SU-8 ליצירת דפוסים מעגליים בעומק של 200 מיקרומטר וקוטר 4 מ"מ.
2. מערבבים בסיס פולידימתילסילוקסן (PDMS) וחומר ריפוי ביחס של 10:1. יוצקים את התערובת על פרוסת הסיליקון ומניחים לה לשבת במשך 20 דקות כדי להסיר את כל הבועות הנובעות מערבוב בסיס ה-PDMS וחומר הריפוי.
3. מכניסים לתנור ומרפאים במשך שעתיים בחום של 70 מעלות צלזיוס. הסר את יריעת ה-PDMS המתרפאת ונקב החוצה באמצעות אגרוף ביופסיה בקוטר 8 מ"מ כדי ליצור מיקרו-בארות PDMS.
4. הניחו מיקרו-בארות בצלחת של 96 בארות והכניסו את צלחת הבאר למנקה פלזמה אוויר כדי לעקר מיקרו-בארות PDMS.
5. פונקציונליזציה של מיקרו-בארות PDMS עם 1% פוליאתילן (PEI) ו-0.1% גלוטראלדהיד (GA) למשך 10 דקות ו-20 דקות, בהתאמה. שוטפים מיקרובארות במים מזוקקים, פי 2.
הכנת hASCs (זמן משוער: 7 ימים)
1. תאי מעבר תרבית עבור 2-5 מעברים במצע הגדילה של hASCs (hASCs מדיה בסיסית בתוספת סרום בקר עוברי (FBS) ופניצילין/סטרפטומיצין (Pen-strep)) עד להתלכדות. מעבר וחישוב מספר התאים באמצעות המציטומטר או מונה תאים.
הידרוג'לים מרוכבים עצביים עמוסי ASC (זמן משוער: 2 שעות)
1. מערבבים פרג'ל עצב סיאטי וחוט השדרה ביחס נפחי של 2:1, 1:1, 1:2, ומכינים הידרוג'ל לחוט השדרה בלבד מבלי לערבב שום פרג'ל עצב סיאטי.
2. הוסף מדיית M199 והתאם את ה-pH 7.4 באמצעות 1 N NaOH ו-HCl. השהה מחדש את ה-hASCs עם מצע גידול בפרה-ג'ל בצפיפות של 1 x 10⁶ תאים/מ"ל.
  הערה: כמות ה-M199 ותרחיף התאים צריכה להיות 10% מהפרגל.
3. מדללים את הפרג'ל ל-12 מ"ג/מ"ל באמצעות 1x PBS. מניחים את הפרג'ל על מיקרו-בארות ומדגרים למשך 30 דקות. תרבית הידרוג'לים עמוסי ASC במצעי גידול hASCs.
מבחן כדאיות התא (זמן משוער: 4 שעות ביום)
1. הכן פתרונות בדיקת כדאיות באמצעות ריאגנטים זמינים מסחרית בהתאם להוראות היצרן.
2. שאיבה מדיה בימים 1, 4, 7 ו-14. מוסיפים מגיב לבארות ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות בהתאם להוראות היצרן.
3. קרא פלואורסצנטיות בעירור/פליטה של 560/590 ננומטר באמצעות קורא צלחות. חשב את ההפרש באחוזים באמצעות המשוואה הבאה:
  [(_דגימת פלואורסצנטיות - פלואורסצנטי_ריק) / פלואורסצנטי_ריק] x 100

תוצאות

רקמות נטולות תאים הוכנו באמצעות פרוטוקולים שנקבעו בעבר עם שינויים קלים^26,27. לאחר דה-סלולריזציה, ליופיליזציה ועיכול, יוצרו הידרוג'לים מרוכבים עצביים ביחסים של SN:SC = 2:1, 1:1, 1:2 והידרוג'לים לחוט השדרה בלבד (איור 1). הסרת רכיבים גרע?...

Discussion

הדעה הרווחת היא כי הפתופיזיולוגיה של SCI היא מורכבת ורבת פנים. למרות שטיפולים בודדים כגון השתלת תאים, אספקת תרופות וביו-חומרים סיפקו תובנות חשובות לגבי SCI, האופי המורכב של SCI עשוי להגביל את יעילותם האישית 28,29,30,31.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי קרן PhRMA והמכונים הלאומיים לבריאות באמצעות הפרס מספר P20GM139768 ו-R15NS121884 שהוענקו ל-YS. אנו רוצים להודות לד"ר קארטיק בלצ'נדרן ולד"ר ראג' ראו במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת ארקנסו על שאפשרו לנו להשתמש בציוד שלהם. כמו כן, אנו רוצים להודות לד"ר ג'ין-וו קים ולמר פטריק קוצ'ווארה מהמחלקה להנדסה ביולוגית וחקלאית באוניברסיטת ארקנסו על מתן הכשרה בנושא ריאומטר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-(Decyldimethylammonio)propane sulfonate inner salt	Sigma-Aldrich	D4266	Used during sciatic nerve decellularization, SB-10
3-(N,N-Dimethylpalmitylammonio)propane sulfonate	Sigma-Aldrich	H6883	Used during sciatic nerve decellularization, SB-16
AlamarBlue reagent	Fisher Scientific	DAL1100	Used during AlamaBlue cell viabiiltiy test
Chondroitinase ABC	Sigma-Aldrich	C3667	Used during sciatic nerve decellularization
Cryostat	Leica	CM1860
Deoxyribonuclase	Sigma-Aldrich	D4263	Used during sciatic nerve decellularization
Disodium hydrogen phosphate heptahydrate	VWR	BDH9296	Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer
DNeasy Blood & Tissue kit	Qiagen	69506	Used during DNA analysis
Dpx Mountant for histology,slide mounting medium	Sigma-Aldrich	6522	Used during H&E staining
Eosin	Sigma-Aldrich	HT110216	Used during H&E staining
Ethanol	VWR	89125-172
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Used during H&E staining
Glutaraldehyde (GA)	Sigma-Aldrich	G6257	Used during PDMS surface functionalization
hASC growth media	Lonza	PT-4505	Used to culture hASCs, containing of fetal bovine serum and penicilin/streptomycin
Hematoxylin	VWR	26041-06	Used during H&E staining
human adipose-derived stem cell	Lonza	PT-5006
Hydrochloric acid (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Used to digest decellularizied tissues and adjust pregels solutions
M199 media	Sigma-Aldrich	M0650	Used to dilute pregels to desired concentration
Optimal cutting temperatue compound	Tissue-Tek	4583
Pepsin	Sigma-Aldrich	P7000	Used to digest decellularized tissues
Peracetic acid	Lab Alley	PAA1001	Used during spinal cord decellularization
Phosphate buffered saline (PBS)	VWR	97062-948
Plate reader	BioTek Instruments	Synergy Mx
Polyethyleneimine (PEI)	Sigma-Aldrich	181978	Used during PDMS surface functionalization
Porcine sciatic nerve	Tissue Source LLC		Live pigs, with no identifiable information and no traceability details
Porcine spinal cord	Tissue Source LLC		Live pigs, with no identifiable information and no traceability details
QuantiFluor dsDNA system	Promega	E2670	Used to analyze DNA contents
Rheometer	TA Instruments	DHR 2
Rugged rotator	Glas-co	099A RD4512	Used during spinal cord decellularization
Sodium chloride (NaCl)	VWR	BDH9286	Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer
sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate	VWR	BDH9298	Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer
Sodium hydroxide solution (NaOH)	Sigma-Aldrich	415443	Used to adjust pregels solutions
SU-8	Kayaku advnaced materials	SU8-100	Used to coat silicon wafer
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501	Used during spinal cord decellularization
Sylgard 184 silicone elastomer kit	DOW	1317318	Polydimethylxiloxane (PDMS) base and curing agent
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Used during spinal cord decellularization
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher	25300062	Used during hASC work and during spinal cord decellularization
Tube revolver rotator	Thermo Fisher	88881001	Used during sciatic nerve decellularization
Xylene	VWR	MK866816	Used during H&E staining

References

National Spinal Cord Injury Statistical Center. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. National Spinal Cord Injury Statistical Center. , (2017).
Anjum, A., et al. Spinal cord injury: Pathophysiology, multimolecular interactions, and underlying recovery mechanisms. Int J Mol Sci. 21 (20), 1-35 (2020).
Führmann, T., Anandakumaran, P. N., Shoichet, M. S. Combinatorial therapies after spinal cord injury: How can biomaterials help. Adv Healthcare Mater. 6 (10), 1-21 (2017).
Xu, Y., et al. Understanding the role of tissue-specific decellularized spinal cord matrix hydrogel for neural stem/progenitor cell microenvironment reconstruction and spinal cord injury. Biomaterials. 268, 120596 (2021).
Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
Franko, R., et al. Mechanical properties of native and decellularized reproductive tissues: insights for tissue engineering strategies. Sci Rep. 14 (1), 1-14 (2024).
Rowlands, D., Sugahara, K., Kwok, J. C. F. Glycosaminoglycans and glycomimetics in the central nervous system. Molecules. 20 (3), 3527-3548 (2015).
Silver, D. J., Silver, J. Contributions of chondroitin sulfate proteoglycans to neurodevelopment, injury, and cancer. Curr Opinion Neurobiol. 27, 171-178 (2014).
Porzionato, A., et al. Tissue-engineered grafts from human decellularized extracellular matrices: A systematic review and future perspectives. Int J Mol Sci. 19 (12), 4117 (2018).
Deng, L. X., et al. A novel growth-promoting pathway formed by GDNFoverexpressing Schwann cells promotes propriospinal axonal regeneration, synapse formation, and partial recovery of function after spinal cord injury. J Neurosci. 33 (13), 5655-5667 (2013).
Tabakow, P., et al. Transplantation of autologous olfactory ensheathing cells in complete human spinal cord injury. Cell Transpl. 22 (9), 1591-1612 (2013).
Hawryluk, G. W. J., et al. An in vivo characterization of trophic factor production following neural precursor cell or bone marrow stromal cell transplantation for spinal cord injury. Stem Cells Dev. 21 (12), 2222-2238 (2012).
Zipser, C. M., et al. Cell-based and stem-cell-based treatments for spinal cord injury: evidence from clinical trials. Lancet Neurol. 21 (7), 659-670 (2022).
Mackay-Sim, A., et al. Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human paraplegia: A 3-year clinical trial. Brain. 131 (9), 2376-2386 (2008).
Suzuki, H., et al. Current concepts of neural stem/progenitor cell therapy for chronic spinal cord injury. Front Cell Neurosci. 15, 794692 (2022).
Kokai, L. E., Marra, K., Rubin, J. P. Adipose stem cells: Biology and clinical applications for tissue repair and regeneration. Trans Res. 163 (4), 399-408 (2014).
Kingham, P. J., Kolar, M. K., Novikova, L. N., Novikov, L. N., Wiberg, M. Stimulating the neurotrophic and angiogenic properties of human adipose-derived stem cells enhances nerve repair. Stem Cells Dev. 23 (7), 741-754 (2014).
Song, Y. H., Shon, S. H., Shan, M., Stroock, A. D., Fischbach, C. Adipose-derived stem cells increase angiogenesis through matrix metalloproteinase-dependent collagen remodeling. Integr Biol (United Kingdom). 8 (2), 205-215 (2016).
Ribeiro, C. A., et al. The secretome of stem cells isolated from the adipose tissue and Wharton jelly acts differently on central nervous system derived cell populations. Stem Cell Res Ther. 3 (3), 18 (2012).
Salgado, J. B. O. G., et al. Adipose tissue derived stem cells secretome: Soluble factors and their roles in regenerative medicine. Curr Stem Cell Res Ther. 5 (2), 103-110 (2010).
Kapur, S. K., Katz, A. J. Review of the adipose derived stem cell secretome. Biochimie. 95 (12), 2222-2228 (2013).
Xu, X. M., Chen, A., Guénard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord. J Neurocytol. 26 (1), 1-16 (1997).
Guest, J. D., et al. Influence of IN-1 antibody and acidic FGF-fibrin glue on the response of injured corticospinal tract axons to human Schwann cell grafts. J Neurosci Res. 50 (5), 888-905 (1997).
Cornelison, R. C., et al. Injectable hydrogels of optimized acellular nerve for injection in the injured spinal cord. Biomed. Mater. 13 (3), 034110 (2018).
Crapo, P. M., et al. Biologic scaffolds composed of central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 33 (13), 3539-3547 (2012).
Medberry, C. J., et al. Hydrogels derived from central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 34 (4), 1033-1040 (2013).
McCrary, M. W., et al. Novel sodium deoxycholate-based chemical decellularization method for peripheral nerve. Tissue Eng Part C. 26 (1), 23-36 (2020).
Shahemi, N. H., et al. Application of conductive hydrogels on spinal cord injury repair: A Review. ACS Biomater Sci Eng. 9 (7), 4045-4085 (2023).
Huang, L. Y., et al. Cell transplantation therapies for spinal cord injury focusing on bone marrow mesenchymal stem cells: Advances and challenges. World J Stem Cells. 15 (5), 385-399 (2023).
Chakraborty, A., Ciciriello, A. J., Dumont, C. M., Pearson, R. M. Nanoparticle-based delivery to treat spinal cord injury - a mini- review. AAPS PharmSciTech. 22 (3), 101 (2022).
Upadhyay, R. K. Drug delivery systems, CNS protection, and the blood brain barrier. BioMed Res Int. , d869269 (2014).
Liu, G., et al. Transplantation of adipose-derived stem cells for peripheral nerve repair. Int J Mol Med. 28 (4), 565-572 (2011).
Sun, T., et al. Adipose-derived stem cells in immune-related skin disease: a review of current research and underlying mechanisms. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 1-14 (2024).
Lewis, M., et al. Materials today bio neuro-regenerative behavior of adipose-derived stem cells in aligned collagen I hydrogels. Mater Today Bio. 22, 100762 (2023).
Thuret, S., Moon, L. D. F., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nat Rev Neurosci. 7 (8), 628-643 (2006).
Ohta, Y., et al. Intravenous infusion of adipose-derived stem/stromal cells improves functional recovery of rats with spinal cord injury. Cytotherapy. 19 (7), 839-848 (2017).
Hur, J. W., et al. Intrathecal transplantation of autologous adipose-derived mesenchymal stem cells for treating spinal cord injury: A human trial. J Spinal Cord Med. 39 (6), 655-664 (2016).
Muehlberg, F. L., et al. Tissue-resident stem cells promote breast cancer growth and metastasis. Carcinogenesis. 30 (4), 589-597 (2009).
Ji, S. Q., et al. Adipose tissue-derived stem cells promote pancreatic cancer cell proliferation and invasion. Brazilian J Med Biol Res. 46 (9), 758-764 (2013).
Zhu, Y., et al. Human mesenchymal stem cells inhibit cancer cell proliferation by secreting DKK-1. Leukemia. 23 (5), 925-933 (2009).
Cousin, B., et al. Adult stromal cells derived from human adipose tissue provoke pancreatic cancer cell death both in vitro and in vivo. PLoS ONE. 4 (7), 31-34 (2009).
Tukmachev, D., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. 22 (3-4), 306-317 (2016).
Bousalis, D., et al. Decellularized peripheral nerve as an injectable delivery vehicle for neural applications. Biomed Mater Res Part A. 110, 595-611 (2022).
Sharma, A., Liao, J., Williams, L. N. Structure and mechanics of native and decellularized porcine cranial dura mater. Eng. 4 (2), 205-213 (2023).
Ozudogru, E., et al. Decellularized spinal cord meninges extracellular matrix hydrogel that supports neurogenic differentiation and vascular structure formation. J Tissue Eng Regen Med. 15 (11), 948-963 (2021).
Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
Saha, K., et al. Substrate modulus directs neural stem cell behavior. Biophys J. 95 (9), 4426-4438 (2008).
Jiang, T., et al. Preparation and characterization of genipin-crosslinked rat acellular spinal cord scaffolds. Mater Sci Eng C. 33 (6), 3514-3521 (2013).
Gao, S., et al. Comparison of glutaraldehyde and carbodiimides to crosslink tissue engineering scaffolds fabricated by decellularized porcine menisci. Mater Sci Eng C. 71, 891-900 (2017).
Zhou, J., et al. Tissue engineering of heart valves: PEGylation of decellularized porcine aortic valve as a scaffold for in vitro recellularization. BioMe Eng Onl. 12 (1), 1-12 (2013).
Sun, D., et al. Novel decellularized liver matrix-alginate hybrid gel beads for the 3D culture of hepatocellular carcinoma cells. Int J Biol Macromol. 109, 1154-1163 (2018).
Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization orotocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tiss Engi C. 24 (12), 697-708 (2018).
Mendicino, M., Fan, Y., Griffin, D., Gunter, K. C., Nichols, K. Current state of U.S. Food and Drug Administration regulation for cellular and gene therapy products: potential cures on the horizon. Cytotherapy. 21 (7), 699-724 (2019).
Lim, H. C., et al. Allogeneic umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell implantation versus microfracture for large, full-thickness cartilage defects in older patients: A multicenter randomized clinical trial and extended 5-year clinical follow-up. Ortho J Sports Med. 9 (1), 1-15 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

SCI

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: