מודל נושא משקל ללא מתח של אוסטאונקרוזיס המושרה על ידי סטרואידים של ראש הירך בחולדות

Summary

הפרוטוקול מראה בניית מודל אימון פשוט וחסכוני לנשיאת משקל חולדה עבור אוסטאונקרוזיס המושרה על ידי סטרואידים של ראש הירך באמצעות סרט טיפולי אלסטי.

Abstract

בניגוד לבני אדם, חולדות הן חיות שהולכות על ארבע, בעוד בני אדם הם בעלי חיים דו-רגליים שעומדים, והירכיים נתונות ללחץ עצום בעת הליכה ועמידה. במודלים של נמק ראש הירך המושרה על ידי סטרואידים של חולדות, לעתים קרובות יש צורך לדמות את המאפיינים הביומכניים של הירך האנושית בלחץ גבוה יותר. יש חוקרים שמנסים לחקות את מצב לחץ הירך האנושי על ידי כך שהם גורמים לחולדות לשאת משקל מסוים, אבל קיבוע החפץ נושא המשקל על החולדה הוא קשה. חולדות יכולות להשתחרר בקלות מאימוביליזציה, והדבקת המשקל על החולדות עם סרט הדבקה תגרום לחולדות להיחנק או למות מחסימת מעיים. קבוצת המחקר שלנו השתמשה בטייפ טיפולי אלסטי כדי לבצע אימוביליזציה ללא מתח של חפצים נושאי משקל בחולדות, כך שהחולדות יוכלו לנשום בחופשיות ולא להתנתק מהאימוביליזציה בתנאי נשיאת משקל. בהשוואה למודל הרגיל של נמק ראש הירך הנגרם על ידי סטרואידים, מצאנו כי התערבות נושאת משקל זו יכולה להחמיר את התקדמות נמק ראש הירך בחולדות.

Introduction

מתן גלוקוקורטיקואידים הוא גורם הסיכון השכיח ביותר לאוסטאונקרוזיס לא טראומטי של ראש הירך (ONFH)¹. ראיות רבות מצביעות על כך שבנוסף לגלוקוקורטיקואידים, עומס הלחץ על מפרק הירך בחולים קשור גם להתרחשות של ONFH. גורמים כגון משקל גוף ועוצמת עבודה פיזית מוכרים כגורמי סיכון ל- ONFH². מחקרים קליניים רבים הדגימו קשר הדוק בין תנאי העמסת מפרק הירך לבין העיתוי והשכיחות של החלפת מפרק 3,4,5,6. לכן, קביעת מודל המשקף את הקשר בין נשיאת עומס לבין אוסטאונקרוזיס הנגרמת על ידי סטרואידים של ראש הירך (SONFH) חשובה לחקירה מקיפה של מצב זה.

ציפורים דו-רגליות גדולות, כגון יענים ואמוס, משמשות כמודלים טובים להדמיית לחץ על מפרקי הירך, בדומה לעומסי רגליים אנושיים ^7,8. עם זאת, שמירה על מיני ציפורים גדולים היא מאתגרת, ועלויות המחקר הנלוות גבוהות. מודלים ספונטניים של חולדות עם יתר לחץ דם ^9,10 יכולים להציג שיעורים גבוהים יותר של ONFH, אך עומס לחץ התא במח שנוצר על ידי יתר לחץ דם ספונטני שונה באופן משמעותי מלחץ מכני ואינו מתאים לחקר ההשפעה של לחץ מכני על SONFH.

מודלים של בעלי חיים קטנים משמשים בדרך כלל במחקר על SONFH. עם זאת, לזוחלים מרובעים יש לחץ נמוך יותר על מפרקי הירך, ודגמי הירך שלהם אינם יכולים לדמות את הסביבה הביומכנית של מפרקי הירך האנושיים במהלך הליכה דו-רגלית. דגמי אימוביליזציה של גפה אחת¹¹ ופריקה חלקית¹² נפוצים, אך שניהם מפחיתים את עומס הגפיים. מכיוון שבני אדם הם אורגניזמים דו-רגליים עם עומס משמעותי בגפיים התחתונות בזמן עמידה והליכה, הפחתת העומס במודלים אלה מפחיתה את הקשר בין מודלים של בעלי חיים למחלות אנושיות.

מחקר זה נועד לבסס מודל פשוט וחסכוני לאימון נשיאת משקל כדי לחקור את ההשפעה של אימון נשיאת משקל על אוסטאונקרוזיס הנגרם על ידי סטרואידים של ראש עצם הירך בחולדות. נכון לעכשיו, מודלים של חולדות שימשו לחקר אוסטאונקרוזיס המושרה על ידי סטרואידים של ראש הירך^13,14, אך עדיין אין מודל שיכול לספק קיבוע ארוך טווח ובטוח עם הפרעה מינימלית לתנועה, שהיא גם פשוטה יחסית וזולה. במחקר זה מיושם חומר קיבוע בעל הדבקה גבוהה, המאמץ קיבוע ללא מתח, השומר על ניידות החולדות ומפחית את הסבל ואף המוות הנגרמים כתוצאה מקיבוע לא נכון.

Protocol

הפרוטוקול תואם את ההנחיות האתיות שנקבעו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת בייג'ינג לרפואה סינית, פרוטוקול מספר BUCM-4-2022062001-2109. הפרוטוקול משתמש בחולדות Sprague Dawley (SD) (SCXK(Jing)2019-0008), בנות 8-10 שבועות ובמשקל 200 גרם-250 גרם.

1. אימון הסתגלות

1. לחולדות אלבינו יש בדרך כלל טווח ראייה של פחות מ 60 ס"מ¹⁵. במהלך תהליך הדוגמנות, הניחו את החולדות בכלובים אטומים והרחיקו אותן ככל האפשר מחולדות שאינן מודלות (לפחות, חולדות אחרות צריכות להיות מחוץ לטווח הראייה המרבי של החולדות המודלות) כדי למנוע מהן לחוות לחץ טראומטי.
2. הפעילו את החשמל וכוונו את ההליכון ל-10 מ' לדקה בשיפוע של 0°. הניחו את החולדות על ההליכון וודאו שהתנועות עדינות ככל האפשר כדי למנוע לחץ. אין להשתמש בגירוי נוסף; החולדות יזחלו קדימה באופן טבעי מכיוון שהן אינן מכירות את הסביבה.
3. האימון נמשך 15 דקות. לאחר האימון, נקו את הצואה והשתן שהשאירו החולדות ורססו אלכוהול כדי לחסל את ריח בעלי החיים. לאחר מכן, הכינו את החולדה הבאה לאילוף.
   הערה: אם חולדה מסרבת ללכת על ההליכון במשך 5 דקות, אל תוציאו אותה מהמחקר.
4. המשיכו באימונים אדפטיביים עד^{סוף השבוע הראשון} .

2. מדידת יכולת נשיאת המשקל המרבית בחולדות

1. הכינו שתי מבחנות, וו ומהדק לולאה באורך של כ-80 ס"מ. הכניסו כדורי פלדה למבחנות, וודאו שהמשקל המשולב הראשוני של המבחנות, הוו ומהדק הלולאה הוא 150 גרם. הכינו מבחנות במשקלים כוללים שונים במרווחים של 10 גרם, כאשר המשקל המרבי הוא 350 גרם.
2. חוקר משתמש בשתי ידיו כדי להדק חולדות באמצעות כפפות (איור 1). חוקר אחר מניח את המבחנה על גב החולדה במרחק של כ-1 ס"מ מקו האמצע של הגב. מכיוון ששלב זה אינו דורש תנועה של החולדה, בצעו קיבוע פשוט על ידי כריכת הוו ומהדק הלולאה סביב החולדה מבלי להשתמש באמצעים נוספים כדי לאבטח את הצינור.
3. החליפו את הצינורית עד להגעה למשקל המרבי של החולדה. כאשר החולדה מגיעה לנשיאת משקל מקסימלית, היא אינה יכולה לעמוד כאשר דוחפים אותה או כאשר הנסיין עוזב. הפחיתו את המשקל ב-10 גרם כדי לאפשר לחולדה לעמוד. משקל זה מייצג את יכולת נשיאת המשקל המרבית של החולדה.

3. הכנת עומס משקל

1. מכיוון שנדרש קיבוע מאובטח במהלך האימון, אבטחו את החפצים באמצעות סרט טיפולי אלסטי באורך 1-1.5 מ' המבוסס על גודל החולדה, שיש לו הדבקה חזקה. השתמש בחימר כדי להתאים את משקל המבחנות כדי להפחית את הנדנוד של העומס.
2. לאחר שקילת משקל המבחנות וחפצי הקיבוע, מוסיפים כמות מתאימה של חימר למבחנות כדי להתאימם למשקל היעד. השתמשו במוט ערבוב זכוכית כדי לפזר את החימר באופן שווה בתוך המבחנות. חימר מרוכז בקצה אחד של המבחנה עלול לגרום לה להתנתק בקלות במהלך האימון.
3. התאימו את המשקל הכולל של המבחנות והחימר המותאמים ל-50% מיכולת נשיאת המשקל המרבית של החולדה (איור 1A). חריגה ממשקל זה תקשה על החולדה להשלים את האימון. אין לכוונן שוב את משקל העומס עד סוף הניסוי.

4. ביסוס אוסטאונקרוזיס כתוצאה מסטרואידים של מודל ראש הירך

1. השתמש בשיטת methylprednisolone בשילוב עם lipopolysaccharide (LPS + MPS) עבור הקמת מודל SONFH^16,17. יש לבצע הזרקה תוך צפקית של LPS (20 מק"ג/ק"ג) באמצעות מחט סטנדרטית בקו האמצע של בטן החולדה אחת ל-24 שעות, ובסך הכל 2 זריקות.
2. לאחר הזרקת LPS האחרונה, יש להזריק MPS (40 מ"ג/ק"ג) לשריר הגלוטאלי החד-צדדי 24 שעות לאחר הזנה רגילה ולהמשיך בהזרקות כל 24 שעות, לסירוגין בין שני אזורי הגלוטאל, בסך הכל שלוש זריקות.

5. אימוביליזציה ללא מתח נושאת משקל באמצעות סרט טיפולי אלסטי ואימון הליכון

1. סמן את קו האמצע האחורי של החולדה ב 1-2 ס"מ משני הצדדים; זוהי נקודת הייחוס לעומס המשקל. ודאו שהסימנים ממוקמים כראוי כדי למנוע מהחולדה להטות או להפריע לתנועה במהלך אימון הליכון.
2. כאשר חוקר אחד מתקן את החולדה באמצעות כפפות, מניחים יד אחת מתחת לבית השחי של החולדה כדי לאבטח את הגפה הקדמית והלסת בעוד היד השנייה מאבטחת את הגפיים האחוריות והזנב. הימנעו משימוש מופרז בכוח כדי למנוע סטרס או חנק (איור 1B).
3. הדביקו את הסרט הטיפולי האלסטי למבחנה מבלי להפעיל מתח כדי לאבטח את העומס על גבה של החולדה. בתהליך של סלילה, לא למתוח את הסרט הטיפולי האלסטי כדי להשיג קיבוע ללא מתח.
   הערה: הטייפ הטיפולי האלסטי המשמש במודל זה מיועד להקלטה במהלך פעילות גופנית אינטנסיבית, ומספק הדבקה גבוהה ואלסטיות¹⁸. בשל גמישותו הגבוהה, הוא מפחית מאוד את ההשפעה על תנועת החולדה בזמן הזחילה.
4. בקשו מהחוקר השני לקבע את המבחנה לגבה של החולדה במקביל לעמוד השדרה של החולדה, כאשר מיקום הקיבוע מבוסס על הסימונים שנוצרו, כלומר במרחק של 1-2 ס"מ מקו האמצע משני צידי גבה של החולדה.
5. כדי למזער את הסבל של החולדה, להפחית את ההשפעה על התנועה של החולדה, ולהפחית את התמותה הנגרמת על ידי קיבוע, לבצע קיבוע ללא הפעלת מתח. הדביקו את המבחנה עם משקל מותאם על סרט הטיפול האלסטי, ואז עטפו את המבחנה סביב גוף החולדה בטכניקה נטולת מתח.
6. הקפידו על אימוביליזציה ללא מתח ושמרו על האורך המקורי של הסרט הטיפולי האלסטי ללא מתיחה כדי למנוע השפעות שליליות על הנשימה והתנועה של חולדות (איור 1C).
7. לאחר כריכת המבחנה סביב גופה של החולדה, הניחו את החולדה במקום פתוח או בכלוב בודד, תוך מעקב אחר נשימתה וכיוונה. אם מופיעים סימנים של נשימה מהירה או פתיחת פה, שחררו מיד את החולדה כדי למנוע חנק.
   1. אימוביליזציה אידיאלית מאפשרת לחולדה לנוע בחופשיות ולבצע פעילויות כמו שתייה, הרמת גפיים קדמיות והאכלה (איור 1D). אם האימוביליזציה אינה מספקת, שחררו באופן זמני ושתקו מחדש לאחר 20 דקות כדי למזער את הלחץ על החולדה עקב גירויי אימוביליזציה חוזרים ונשנים.
8. הפעילו את החשמל וכוונו את ההליכון ל-1 מ'/דקה בשיפוע של 0°. זמן האימון על ההליכון הוא 30 דקות. העבירו בעדינות את החולדה להליכון והפעילו את הטיימר.
9. אין לספק גירוי נוסף לחולדה. אם החולדה אינה יכולה להשלים את 30 דקות האימון, הניחו אותה בכלוב למנוחה של 10 דקות מבלי להסיר את הקיבוע.
   הערה: לסרט הטיפולי האלסטי המשמש במחקר זה יש יכולת מתיחה והדבקה מצוינות. כאשר מאובטח כראוי ללא מתח, קיבוע לטווח ארוך לא יגרום למבחנה להתנתק או לגרום לחנק ומוות של החולדה.
10. לאחר האימון, נקו את הצואה והשתן שהשאירו החולדות ורססו אלכוהול כדי לחסל את ריח בעלי החיים.
11. הימנעו מהצעדים הנ"ל שנראים על ידי חולדות אחרות וטפלו בבעלי החיים בעדינות ככל האפשר כדי למנוע מבעלי חיים להשמיע קול, ובכך לגרום לחץ טראומטי לחולדות אחרות.
12. שחררו מיד את החולדה מהקיבוע לאחר השלמת האימון (איור 1E). במהלך השחרור, השתמשו באצבעות כדי ללחוץ מטה על פרוות החולדה כדי להגן עליה, ובכך מזערו את אובדן הפרווה במהלך השחרור (איור 1F).

6. קיבוץ בעלי חיים

1. כדי לחקור את ההשפעה של אימון נשיאת משקל על SONFH, חלקו באופן אקראי 60 חולדות לארבע קבוצות.
2. בקבוצת הביקורת, אין לקבוע את האוסטאונקרוזיס הנפוץ הנגרם על ידי סטרואידים של מודל ראש הירך (SONFH) או לבצע אימון נשיאת משקל. בקבוצת Control+Load, בצעו אימון נשיאת משקל בלבד, ללא ביסוס אוסטאונקרוזיס הנגרם על ידי סטרואידים של מודל ראש הירך. בקבוצת המודל, לקבוע אוסטאונקרוזיס המושרה על ידי סטרואידים של מודל ראש הירך בלבד. בקבוצת Model+Load, בצעו אימון נשיאת משקל לאחר ביסוס אוסטאונקרוזיס כתוצאה מסטרואידים של מודל ראש הירך.

7. המתת חסד ואיסוף דגימות

1. הכניסו את החולדות לתא המתת חסד של בעלי חיים קטנים והזריקו מספיק פחמן דו-חמצני כדי להגיע לריכוז גבוה מ-5%. ברגע שהחולדות מאבדות את הכרתן, יש לתת מינון של 0.3 מ"ל/ק"ג משקל גוף של תמיסת אשלגן כלורי 20%, בסך הכל 20 מ"ל, באמצעות זריקה תוך לבבית.
2. עקבו אחר הנשימה והדופק של החולדות כדי לוודא שהן לא חוות כאב או אי נוחות במהלך המתת חסד. אשר את המוות על ידי בדיקת היעדר נשימה ודופק. רססו אלכוהול כדי לנקות כל ריח.
3. לאחר המתת חסד, יש לנתח את אזור הירך של החולדה ולחלץ את ראש עצם הירך תוך שמירה על שלמות עצם הירך. בצע סריקת microCT לאחר טיפול מקדים, ואחריה צביעת Hematoxylin-Eosin (HE).

8. צביעת Hematoxylin-Eosin

1. לאחר השלמת הדוגמנות, להרדים את החולדות. הסר את עצם הירך להכתמת HE.
2. השרו את עצם הירך של החולדה בפרפורמלדהיד 4% למשך 24 שעות כדי לשמר רקמות ביולוגיות כדגימות. השרו את דגימות עצם הירך של החולדה בחומצה פורמית 5% לצורך הסתיידות למשך 5 ימים.
3. חתכו את הדגימות לפרוסות של 5 מיקרומטר לצביעת HE.
   הערה: לקונה ריקה מתייחסת למצב ברקמת עצם¹⁹ שבו הלאקונה, שבדרך כלל אמורה להכיל אוסטיאוציטים, נטולת תאים אלה. זהו אינדיקטור חשוב להערכת בריאות רקמת העצם. בתהליך הפתולוגי של נמק העצם, אספקת דם לא מספקת עלולה לגרום למוות אוסטאוציטים, מה שמוביל ללקונה ריקה. באבחון והערכה של נמק עצם, מספר ופיזור הלקונה הריקה הם פרמטרים חשובים למדידת חומרת המחלה^20,21.
   1. הכניסו דגימות של עצם הירך של חולדה לפרפין מומס (56-60 מעלות צלזיוס), תחילה השרו בפרפין בעל נקודת התכה נמוכה, במידת הצורך, ולאחר מכן העבירו בהדרגה לפרפין נקודת התכה גבוהה יותר, בכל פעם למשך כשעה, כדי להבטיח חדירה יסודית של הרקמה עם פרפין.
   2. מכינים תבניות הטבעה ויוצקים פרפין מומס לתוך התבניות לעומק המתאים. שולפים את דגימות הרקמה מהפרפין בעזרת מלקחיים לאחר ההשרייה, מסירים עודפי פרפין ומניחים אותם בתבניות. מצננים לטמפרטורת החדר כדי למצק את הפרפין, ויוצרים קוביות פרפין.
   3. בעזרת מיקרוטום פרפין, חותכים את קוביות הפרפין המשובצות למקטעים בעובי 5 מיקרומטר.
4. אפו את דגימות עצם הירך של החולדה עם פרוסות מחוברות במגלשה חמה יותר למשך שעה אחת כדי לשפר את ההיצמדות בין הפרוסות והכיסוי, ולהפחית את הציפה במהלך תהליכי הצביעה הבאים.
5. טבלו את הפרוסות האפויות ברצף בקסילן טהור כדי להסיר פרפין, ולאחר מכן סדרה של התייבשות באמצעות אתנול מוחלט, אתנול הדרגתי (100%, 95%, 80%, 70%) ומים, במשך 2 דקות כל אחד, השלמת תהליך deparaffinization ו rehydration.
6. טובלים את הפרוסות המפורקות בתמיסת צביעת המטוקסילין ומכתימים למשך 10 דקות. יש לשטוף במים זורמים כדי להסיר המטוקסילין לא קשור.
7. יש לטבול את החלקים המוכתמים בהמטוקסילין בתמיסת צביעת אאוסין ולהכתים למשך 2 דקות כדי לצבוע את הציטופלסמה ורקמת החיבור. נשטף בתמיסת חומצה אצטית 1% כדי לתקן את אפקט הצביעה.
8. טבלו את דגימת עצם הירך של החולדה ברצף ב-70%, 80%, 90%, 95% ו-100% אתנול, עם כל שיפוע למשך 2 דקות, תוך הסרת לחות בהדרגה.
9. טבלו את דגימת עצם הירך של החולדה בפרוסות קסילן טהור לשקיפות, ולאחר מכן שטפו במים זורמים כדי להסיר את הקסילן. החל שרף הרכבה ניטרלי, כסה את המגלשות, הקש בעדינות כדי להסיר בועות אוויר ואפשר למדיום ההרכבה להתמצק כדי להשלים את תהליך ההרכבה.
10. באמצעות חבילת הרנדומיזר ב-R, בחר 30 שקופיות מוכתמות HE-עבור כל קבוצה והקצה 15 שקופיות כל אחת לשני חוקרים. מבלי ליידע אותם על הקיבוצים, בקשו מהחוקרים לחשב את שיעור הלקונה הריק של השקפים ולאסוף את התוצאות לניתוח סטטיסטי.

9. ניתוח MicroCT

1. לאחר השלמת הדוגמנות, להרדים את החולדות. הסר את עצם הירך עבור צביעת Hematoxylin-Eosin.
2. השרו את עצם הירך של החולדה בפרפורמלדהיד 4% למשך 24 שעות כדי לשמר רקמות ביולוגיות כדגימות. הניחו את עצם הירך של החולדה במכשיר microCT קטן הספציפי לבעלי חיים.
3. הגדר את תנאי סריקת ה- microCT באופן הבא: מתח רנטגן: 80 קילו וולט, זרם: 100 μA, זמן חשיפה יחיד: 50 מטר/שניה, רזולוציית סריקה: 25 מיקרומטר. בצע סריקות במרווחים של 0.5°, תוך התמקדות בעצם הטרבקולרית מתחת לסחוס לחלק העליון של האפיפיזה כאזור המעניין.
4. הגדירו את האזור שמעל צוואר הירך של החולדה כאזור העניין.
5. לבצע שחזור מישור העטרה של תוצאות הסריקה באמצעות מכשיר microCT ולאסוף מדידות מורפומטריות עצם שנוצרו על ידי התוכנה המובנית של מכשיר microCT. רשום את המדדים הנצפים הבאים: נפח כולל (טלוויזיה), אחוז נפח עצם (BV/TV), יחס פני עצם/נפח (BS/BV), עובי מבנה (Tb.Th), הפרדת מבנה (Tb.Sp), מספר עצם (Tb.N), צפיפות עצם (BD).

10. ניתוח סטטיסטי

1. הצג את הנתונים כממוצע ± סטיית תקן (SD). ביצוע ניתוחים סטטיסטיים עבור מיקרו-CT והערכות היסטולוגיות כמותיות באמצעות מבחן t מדגם בלתי תלוי. שקול ערך p < 0.05 כמובהק סטטיסטית.

תוצאות

ניתוח היסטופתולוגיה
צביעת המטוקסילין ואוזין גילתה כי בקבוצת הביקורת ובקבוצת הביקורת+עומס, קנה הנשימה של העצם היה שלם ומסודר באופן קבוע. תאי אנדותל של כלי דם היו נוכחים בגומות עצם, והמורפולוגיה של התא נראתה שמנמנה. לעומת זאת, קבוצת המודל וקבוצת Model+Load הציגו קנה ...

Discussion

נכון לעכשיו, בעלי חיים שונים, כגון ארנבות²⁵, חולדות²⁶, עכברים²⁷, חזירים²⁸, פטמים²⁹, יענים⁸, ו emus³⁰ ניתן להשתמש כדי להקים מודלים של נמק ראש הירך. ביניהם, חולדות, עכברים וארנבות הם המין הנפו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15ml centrifuge tube	Corning,USA	430791
5mm stainless steel bead	Gelisen,China	5mm
Acetic acid	Merck KGaA, Germany	64-19-7
Anhydrous alcohol	Merck KGaA, Germany	64-17-5
clay	Mincai stationery,China	102
Coverslip	Servicebio,China	WMWD-1818
Flat pressure bottle 10ml	BEHNCKE,China	MD10ml
Formic acid	Macklin Biochemical ,China	64-18-6
HE staining kit	Solarbio,China	G1120
HistoCore AUTOCUT	Leica, Germany	149AUTO00C1
Kinesio tape (elastic therapeutic tape)	Fuluo medicine,China	CL1819
Lipopolysaccharide	Solarbio,China	L8880
Lipopolysaccharides (LPS)	Selleck,USA	S7850
Manual carbon dioxide euthanasia box	Yuyan,China	LC-500-S1
Methylprednisolone sodium succinate,MPS	AbMole,China	M25573
MicroCT	Hiscan,China	Hiscan VM Pro
Neutral resin	Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology l ,China	ZLI-9555
Paraffin	Servicebio,China	WGHB-319213129
Paraformaldehyde	Servicebio,China	G1101-500ML
Potassium chloride	Macklin Biochemical ,China	7447-40-7
Slide	Servicebio,China	WG6012
Treadmill for Rats and  mice	Litc Life Science,USA	801
Xylene	Macklin Biochemical ,China	1330-20-7