יצירת פרופיל pH לומינלי באורגנואידים תלת מימדיים במערכת העיכול באמצעות מיקרואלקטרודות

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מדידות pH באורגנואידים בקיבה שמקורם ברקמה אנושית באמצעות מיקרואלקטרודות לאפיון מרחבי-זמני של פיזיולוגיה תוך-לומינלית.

Abstract

אופטימיזציה ואפיון מפורט של מודלים אורגנואידים במערכת העיכול דורשים שיטות מתקדמות לניתוח הסביבה הלומינלית שלהם. מאמר זה מציג שיטה בעלת יכולת שחזור גבוהה למדידה מדויקת של pH בתוך הלומינה של אורגנואידי קיבה אנושיים תלת-ממדיים באמצעות מיקרואלקטרודות מבוקרות מיקרומניפולטור. מיקרואלקטרודות ה- pH זמינות באופן מסחרי ומורכבות מקצות זכוכית משופעים בקוטר 25 מיקרומטר. לצורך מדידות, מיקרואלקטרודת ה- pH מתקדמת ללומן של אורגנואיד (>200 מיקרומטר) התלוי במטריג'ל, בעוד אלקטרודת ייחוס מונחת שקועה בתווך שמסביב בלוח התרבית.

באמצעות מיקרואלקטרודות כאלה לפרופיל אורגנואידים שמקורם בגוף הקיבה האנושי, אנו מראים כי pH לומינלי עקבי יחסית בכל תרבית היטב ב~7.7 ± 0.037 וכי ניתן להשיג מדידות רציפות במשך מינימום של 15 דקות. בכמה אורגנואידים גדולים יותר, המדידות חשפו שיפוע pH בין משטח האפיתל לבין הלומן, מה שמרמז על כך שניתן להשיג מדידות pH באורגנואידים ברזולוציה מרחבית גבוהה. במחקר קודם, מיקרואלקטרודות שימשו בהצלחה למדידת ריכוזי חמצן לומינלי באורגנואידים, והדגימו את הרבגוניות של שיטה זו לניתוח אורגנואידים. לסיכום, פרוטוקול זה מתאר כלי חשוב לאפיון פונקציונלי של המרחב הלומינלי המורכב בתוך אורגנואידים תלת-ממדיים.

Introduction

אורגנואידים – מבנים רב-תאיים זעירים שמקורם בתאי גזע – חוללו מהפכה ביכולתנו לחקור את הפיזיולוגיה האנושית ומתחילים להחליף מודלים של בעלי חיים, אפילו במסגרות רגולטוריות¹. מאז התיאור הראשוני של אורגנואידים במעיים על ידי Sato et al. בשנת 2009, טכנולוגיית אורגנואידים הפכה פופולרית מאוד². מספר רב של מחקרים אפיינו את ההרכב והתפקוד התאי של מודלים אורגנואידים בפירוט רב 3,4,5,6. עם זאת, המרחב המואר של מבנים רב-תאיים תלת-ממדיים אלה נותר במידה רבה בלתי מוגדר ^7,8

Protocol

פרוטוקול זה דורש אורגנואידים תלת-ממדיים בקוטר של לפחות 200 מיקרומטר, בעלי לומן מובחן ומוטמעים במטריצה חוץ-תאית מלאכותית (ECM, למשל, Matrigel). רקמות קיבה אנושיות לגזירת אורגנואידים התקבלו באישור מועצת הסקירה המוסדית של אוניברסיטת מונטנה סטייט והסכמה מדעת מחולים שעברו אנדוסקופיה עליונה ב- Bozeman Health (פרוטוקול # 2023-48-FCR, ל- D.B.) או כדגימות פטורות מכריתת קיבה שלמה או שרוול מהמחלף הלאומי לחקר מחלות (פרוטוקול #DB062615-EX). מידע על קווי האורגנואידים ומספרי המעבר ששימשו למחקר זה מופיע בטבלה 1, והרכב המדיה מופיע בטבלה 2. עיין בפרוטוקולים שפורסמו בעבר ליצירה ותחזוקה של קווי אורגנואידים במערכת העיכול....

תוצאות

הפרשת חומצה היא פונקציה מכרעת של הקיבה האנושית. עם זאת, עד כמה ניתן למדל הפרשת חומצה באורגנואידים היא עדיין נושא לוויכוח 6,32,33,34. לכן פיתחנו את הפרוטוקול המפורט לעיל כדי למדוד במדויק את ייצור החומצה באורגנואידים בקיבה. י?.......

Discussion

גישה מוגבלת למרחב הלומינלי של אורגנואידים הגבילה מאוד את הבנתנו את הדינמיקה הפיזיולוגית של מיקרו-סביבה זו. כלי אמין לניתוחים פונקציונליים של פיזיולוגיה לומינלית ירחיב את יכולתנו למנף אורגנואידים כמודלים חוץ גופיים לפיזיולוגיה, פרמקולוגיה וחקר מחלות. אורגנואידים הם מודלים רלוונטי?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 M KCl	Unisense
5 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile	CellTreat	229091B
10 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile	CellTreat	229092B
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile	CellTreat	229412
24 Well Tissue Culture Plate, Sterile	CellTreat	229124
25 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile	CellTreat	229093B
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated	MatTek	P35G-1.5-20-C
50 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile	CellTreat	229422
70% Ethanol	BP82031GAL	BP82031GAL
70 μm Cell Strainer, Individually Wrapped, Sterile	CellTreat	229483
1,000 µL Extended Length Low Retention Pipette Tips, Racked, Sterile	CellTreat	229037
Amphotericin B (Fungizone) Solution	HyClone Laboratories, Inc	SV30078.01
Biosafety Cabinet	Nuaire	NU-425-600	Class II Type A/B3
Bovine Serum Albumin	Fisher Bioreagents	BP1605-100
Cell recovery solution	Corning	354253	Cell dissociation solution
DMEM/F-12 (Advanced DMEM)	Gibco	12-491-015
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM)	Fisher Scientific	15017CV
Fetal Bovine Serum	HyClone Laboratories, Inc	SH30088
G418 Sulfate	Corning	30-234-CR
Gentamycin sulfate	IBI Scientific	IB02030
HEPES, Free Acid	Cytiva	SH30237.01
HP Pavillion 2-in-1 14" Laptop Intel Core i3	HP	M03840-001
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144C-212
Incubator	Fisher Scientific	11676604
iPhone 12 camera	Apple
L-glutamine	Cytiva	SH3003401
Large Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fisher Scientific	34133
M 205 FA Stereomicroscope	Leica
Matrigel Membrane Matrix 354234	Corning	CB-40234
MC-1 UniMotor Controller	Unisense
Methyl red
MM33 Micromanipulator	Marzhauser Wetzlar	61-42-113-0000	Right handed
MS-15 Motorized Stage	Unisense
Nanoject-II	Drummond	3-000-204	nanoliter autoinjector
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15-140-148
pH Microelectrodes	Unisense	50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160	SensorTrace software is not compatible with Apple computers
Reference Electrode	Unisense	REF-RM-001652	SensorTrace software is not compatible with Apple computers
SB 431542	Tocris Bioscience	16-141-0
Smartphone Camera Adapter	Gosky
Specifications Laboratory Stand LS	Unisense	LS-009238
Trypsin-EDTA 0.025%, phenol red	Gibco	25-200-056
UniAmp	Unisense	11632
United Biosystems Inc MINI CELL SCRAPERS 200/PK	Fisher	MCS-200
Y-27632 dihydrochloride	Tocris Bioscience	12-541-0
µSensor Calibration Kit	Unisense/ Mettler Toledo	51-305-070, 51-302-069	pH 4.01 and 9.21, 20 mL packets