A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר מדידות pH באורגנואידים בקיבה שמקורם ברקמה אנושית באמצעות מיקרואלקטרודות לאפיון מרחבי-זמני של פיזיולוגיה תוך-לומינלית.
אופטימיזציה ואפיון מפורט של מודלים אורגנואידים במערכת העיכול דורשים שיטות מתקדמות לניתוח הסביבה הלומינלית שלהם. מאמר זה מציג שיטה בעלת יכולת שחזור גבוהה למדידה מדויקת של pH בתוך הלומינה של אורגנואידי קיבה אנושיים תלת-ממדיים באמצעות מיקרואלקטרודות מבוקרות מיקרומניפולטור. מיקרואלקטרודות ה- pH זמינות באופן מסחרי ומורכבות מקצות זכוכית משופעים בקוטר 25 מיקרומטר. לצורך מדידות, מיקרואלקטרודת ה- pH מתקדמת ללומן של אורגנואיד (>200 מיקרומטר) התלוי במטריג'ל, בעוד אלקטרודת ייחוס מונחת שקועה בתווך שמסביב בלוח התרבית.
באמצעות מיקרואלקטרודות כאלה לפרופיל אורגנואידים שמקורם בגוף הקיבה האנושי, אנו מראים כי pH לומינלי עקבי יחסית בכל תרבית היטב ב~7.7 ± 0.037 וכי ניתן להשיג מדידות רציפות במשך מינימום של 15 דקות. בכמה אורגנואידים גדולים יותר, המדידות חשפו שיפוע pH בין משטח האפיתל לבין הלומן, מה שמרמז על כך שניתן להשיג מדידות pH באורגנואידים ברזולוציה מרחבית גבוהה. במחקר קודם, מיקרואלקטרודות שימשו בהצלחה למדידת ריכוזי חמצן לומינלי באורגנואידים, והדגימו את הרבגוניות של שיטה זו לניתוח אורגנואידים. לסיכום, פרוטוקול זה מתאר כלי חשוב לאפיון פונקציונלי של המרחב הלומינלי המורכב בתוך אורגנואידים תלת-ממדיים.
אורגנואידים – מבנים רב-תאיים זעירים שמקורם בתאי גזע – חוללו מהפכה ביכולתנו לחקור את הפיזיולוגיה האנושית ומתחילים להחליף מודלים של בעלי חיים, אפילו במסגרות רגולטוריות1. מאז התיאור הראשוני של אורגנואידים במעיים על ידי Sato et al. בשנת 2009, טכנולוגיית אורגנואידים הפכה פופולרית מאוד2. מספר רב של מחקרים אפיינו את ההרכב והתפקוד התאי של מודלים אורגנואידים בפירוט רב 3,4,5,6. עם זאת, המרחב המואר של מבנים רב-תאיים תלת-ממדיים אלה נותר במידה רבה בלתי מוגדר 7,8
פרוטוקול זה דורש אורגנואידים תלת-ממדיים בקוטר של לפחות 200 מיקרומטר, בעלי לומן מובחן ומוטמעים במטריצה חוץ-תאית מלאכותית (ECM, למשל, Matrigel). רקמות קיבה אנושיות לגזירת אורגנואידים התקבלו באישור מועצת הסקירה המוסדית של אוניברסיטת מונטנה סטייט והסכמה מדעת מחולים שעברו אנדוסקופיה עליונה ב- Bozeman Health (פרוטוקול # 2023-48-FCR, ל- D.B.) או כדגימות פטורות מכריתת קיבה שלמה או שרוול מהמחלף הלאומי לחקר מחלות (פרוטוקול #DB062615-EX). מידע על קווי האורגנואידים ומספרי המעבר ששימשו למחקר זה מופיע בטבלה 1, והרכב המדיה מופיע בטבלה 2. עיין בפרוטוקולים שפורסמו בעבר ליצירה ותחזוקה של קווי אורגנואידים במערכת העיכול....
הפרשת חומצה היא פונקציה מכרעת של הקיבה האנושית. עם זאת, עד כמה ניתן למדל הפרשת חומצה באורגנואידים היא עדיין נושא לוויכוח 6,32,33,34. לכן פיתחנו את הפרוטוקול המפורט לעיל כדי למדוד במדויק את ייצור החומצה באורגנואידים בקיבה. י?.......
גישה מוגבלת למרחב הלומינלי של אורגנואידים הגבילה מאוד את הבנתנו את הדינמיקה הפיזיולוגית של מיקרו-סביבה זו. כלי אמין לניתוחים פונקציונליים של פיזיולוגיה לומינלית ירחיב את יכולתנו למנף אורגנואידים כמודלים חוץ גופיים לפיזיולוגיה, פרמקולוגיה וחקר מחלות. אורגנואידים הם מודלים רלוונטי?.......
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
המחברים רוצים להודות לד"ר אלן לאושנור, ד"ר פיל סטיוארט ובנגיסו קיליק על עבודתם הקודמת ועל עזרתם במיקרו-חיישנים O2 ; אנדי סברל להכשרה בתרבית אורגנואידים ומיקרומניפולציה; לקסי בורצ'אם לסיוע בתרבות אורגנואידים, הכנת מדיה, רישום נתונים וארגון; וד"ר סוזי קוהוט לייעוץ כללי באלקטרופיזיולוגיה. ברצוננו להודות לד"ר היידי סמית על עזרתה בדימות ולהודות למרכז להנדסת ביופילם מתקן הדמיה ביולוגית באוניברסיטת מונטנה, הנתמך על ידי מימון מתוכנית MRI של הקרן הלאומית למדע (2018562), קרן הצדקה M.J. Murdock (202016116), משרד ההגנה האמריקאי (77369LSRIP &W911NF1910288), ומתקן הננוטכנולוגיה במונטנה (חבר NNCI הנתמך על ידי NSF Grant ECCS-2025391).
תודה מיוחד....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3 M KCl | Unisense | ||
5 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile | CellTreat | 229091B | |
10 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile | CellTreat | 229092B | |
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile | CellTreat | 229412 | |
24 Well Tissue Culture Plate, Sterile | CellTreat | 229124 | |
25 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, Sterile | CellTreat | 229093B | |
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
50 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile | CellTreat | 229422 | |
70% Ethanol | BP82031GAL | BP82031GAL | |
70 μm Cell Strainer, Individually Wrapped, Sterile | CellTreat | 229483 | |
1,000 µL Extended Length Low Retention Pipette Tips, Racked, Sterile | CellTreat | 229037 | |
Amphotericin B (Fungizone) Solution | HyClone Laboratories, Inc | SV30078.01 | |
Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | Class II Type A/B3 |
Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1605-100 | |
Cell recovery solution | Corning | 354253 | Cell dissociation solution |
DMEM/F-12 (Advanced DMEM) | Gibco | 12-491-015 | |
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Fisher Scientific | 15017CV | |
Fetal Bovine Serum | HyClone Laboratories, Inc | SH30088 | |
G418 Sulfate | Corning | 30-234-CR | |
Gentamycin sulfate | IBI Scientific | IB02030 | |
HEPES, Free Acid | Cytiva | SH30237.01 | |
HP Pavillion 2-in-1 14" Laptop Intel Core i3 | HP | M03840-001 | |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144C-212 | |
Incubator | Fisher Scientific | 11676604 | |
iPhone 12 camera | Apple | ||
L-glutamine | Cytiva | SH3003401 | |
Large Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 34133 | |
M 205 FA Stereomicroscope | Leica | ||
Matrigel Membrane Matrix 354234 | Corning | CB-40234 | |
MC-1 UniMotor Controller | Unisense | ||
Methyl red | |||
MM33 Micromanipulator | Marzhauser Wetzlar | 61-42-113-0000 | Right handed |
MS-15 Motorized Stage | Unisense | ||
Nanoject-II | Drummond | 3-000-204 | nanoliter autoinjector |
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-148 | |
pH Microelectrodes | Unisense | 50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160 | SensorTrace software is not compatible with Apple computers |
Reference Electrode | Unisense | REF-RM-001652 | SensorTrace software is not compatible with Apple computers |
SB 431542 | Tocris Bioscience | 16-141-0 | |
Smartphone Camera Adapter | Gosky | ||
Specifications Laboratory Stand LS | Unisense | LS-009238 | |
Trypsin-EDTA 0.025%, phenol red | Gibco | 25-200-056 | |
UniAmp | Unisense | 11632 | |
United Biosystems Inc MINI CELL SCRAPERS 200/PK | Fisher | MCS-200 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 12-541-0 | |
µSensor Calibration Kit | Unisense/ Mettler Toledo | 51-305-070, 51-302-069 | pH 4.01 and 9.21, 20 mL packets |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved