A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מדידות pH באורגנואידים בקיבה שמקורם ברקמה אנושית באמצעות מיקרואלקטרודות לאפיון מרחבי-זמני של פיזיולוגיה תוך-לומינלית.

Abstract

אופטימיזציה ואפיון מפורט של מודלים אורגנואידים במערכת העיכול דורשים שיטות מתקדמות לניתוח הסביבה הלומינלית שלהם. מאמר זה מציג שיטה בעלת יכולת שחזור גבוהה למדידה מדויקת של pH בתוך הלומינה של אורגנואידי קיבה אנושיים תלת-ממדיים באמצעות מיקרואלקטרודות מבוקרות מיקרומניפולטור. מיקרואלקטרודות ה- pH זמינות באופן מסחרי ומורכבות מקצות זכוכית משופעים בקוטר 25 מיקרומטר. לצורך מדידות, מיקרואלקטרודת ה- pH מתקדמת ללומן של אורגנואיד (>200 מיקרומטר) התלוי במטריג'ל, בעוד אלקטרודת ייחוס מונחת שקועה בתווך שמסביב בלוח התרבית.

באמצעות מיקרואלקטרודות כאלה לפרופיל אורגנואידים שמקורם בגוף הקיבה האנושי, אנו מראים כי pH לומינלי עקבי יחסית בכל תרבית היטב ב~7.7 ± 0.037 וכי ניתן להשיג מדידות רציפות במשך מינימום של 15 דקות. בכמה אורגנואידים גדולים יותר, המדידות חשפו שיפוע pH בין משטח האפיתל לבין הלומן, מה שמרמז על כך שניתן להשיג מדידות pH באורגנואידים ברזולוציה מרחבית גבוהה. במחקר קודם, מיקרואלקטרודות שימשו בהצלחה למדידת ריכוזי חמצן לומינלי באורגנואידים, והדגימו את הרבגוניות של שיטה זו לניתוח אורגנואידים. לסיכום, פרוטוקול זה מתאר כלי חשוב לאפיון פונקציונלי של המרחב הלומינלי המורכב בתוך אורגנואידים תלת-ממדיים.

Introduction

אורגנואידים – מבנים רב-תאיים זעירים שמקורם בתאי גזע – חוללו מהפכה ביכולתנו לחקור את הפיזיולוגיה האנושית ומתחילים להחליף מודלים של בעלי חיים, אפילו במסגרות רגולטוריות1. מאז התיאור הראשוני של אורגנואידים במעיים על ידי Sato et al. בשנת 2009, טכנולוגיית אורגנואידים הפכה פופולרית מאוד2. מספר רב של מחקרים אפיינו את ההרכב והתפקוד התאי של מודלים אורגנואידים בפירוט רב 3,4,5,6. עם זאת, המרחב המואר של מבנים רב-תאיים תלת-ממדיים אלה נותר במידה רבה בלתי מוגדר 7,8

Protocol

פרוטוקול זה דורש אורגנואידים תלת-ממדיים בקוטר של לפחות 200 מיקרומטר, בעלי לומן מובחן ומוטמעים במטריצה חוץ-תאית מלאכותית (ECM, למשל, Matrigel). רקמות קיבה אנושיות לגזירת אורגנואידים התקבלו באישור מועצת הסקירה המוסדית של אוניברסיטת מונטנה סטייט והסכמה מדעת מחולים שעברו אנדוסקופיה עליונה ב- Bozeman Health (פרוטוקול # 2023-48-FCR, ל- D.B.) או כדגימות פטורות מכריתת קיבה שלמה או שרוול מהמחלף הלאומי לחקר מחלות (פרוטוקול #DB062615-EX). מידע על קווי האורגנואידים ומספרי המעבר ששימשו למחקר זה מופיע בטבלה 1, והרכב המדיה מופיע בטבלה 2. עיין בפרוטוקולים שפורסמו בעבר ליצירה ותחזוקה של קווי אורגנואידים במערכת העיכול....

תוצאות

הפרשת חומצה היא פונקציה מכרעת של הקיבה האנושית. עם זאת, עד כמה ניתן למדל הפרשת חומצה באורגנואידים היא עדיין נושא לוויכוח 6,32,33,34. לכן פיתחנו את הפרוטוקול המפורט לעיל כדי למדוד במדויק את ייצור החומצה באורגנואידים בקיבה. י?.......

Discussion

גישה מוגבלת למרחב הלומינלי של אורגנואידים הגבילה מאוד את הבנתנו את הדינמיקה הפיזיולוגית של מיקרו-סביבה זו. כלי אמין לניתוחים פונקציונליים של פיזיולוגיה לומינלית ירחיב את יכולתנו למנף אורגנואידים כמודלים חוץ גופיים לפיזיולוגיה, פרמקולוגיה וחקר מחלות. אורגנואידים הם מודלים רלוונטי?.......

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות לד"ר אלן לאושנור, ד"ר פיל סטיוארט ובנגיסו קיליק על עבודתם הקודמת ועל עזרתם במיקרו-חיישנים O2 ; אנדי סברל להכשרה בתרבית אורגנואידים ומיקרומניפולציה; לקסי בורצ'אם לסיוע בתרבות אורגנואידים, הכנת מדיה, רישום נתונים וארגון; וד"ר סוזי קוהוט לייעוץ כללי באלקטרופיזיולוגיה. ברצוננו להודות לד"ר היידי סמית על עזרתה בדימות ולהודות למרכז להנדסת ביופילם מתקן הדמיה ביולוגית באוניברסיטת מונטנה, הנתמך על ידי מימון מתוכנית MRI של הקרן הלאומית למדע (2018562), קרן הצדקה M.J. Murdock (202016116), משרד ההגנה האמריקאי (77369LSRIP &W911NF1910288), ומתקן הננוטכנולוגיה במונטנה (חבר NNCI הנתמך על ידי NSF Grant ECCS-2025391).

תודה מיוחד....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3 M KClUnisense
5 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, SterileCellTreat229091B
10 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, SterileCellTreat229092B
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, SterileCellTreat229412
24 Well Tissue Culture Plate, SterileCellTreat229124
25 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, SterileCellTreat229093B
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | UncoatedMatTekP35G-1.5-20-C
50 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, SterileCellTreat229422
70% EthanolBP82031GALBP82031GAL
70 μm Cell Strainer, Individually Wrapped, SterileCellTreat229483 
1,000 µL Extended Length Low Retention Pipette Tips, Racked, SterileCellTreat229037
Amphotericin B (Fungizone) SolutionHyClone Laboratories, IncSV30078.01
Biosafety CabinetNuaire NU-425-600Class II Type A/B3
Bovine Serum AlbuminFisher BioreagentsBP1605-100
Cell recovery solutionCorning354253Cell dissociation solution
DMEM/F-12 (Advanced DMEM)Gibco12-491-015
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM)Fisher Scientific15017CV
Fetal Bovine SerumHyClone Laboratories, IncSH30088
G418 SulfateCorning30-234-CR
Gentamycin sulfateIBI ScientificIB02030
HEPES, Free AcidCytivaSH30237.01
HP Pavillion 2-in-1 14" Laptop Intel Core i3HPM03840-001
Hydrochloric acidFisher ScientificA144C-212
IncubatorFisher Scientific11676604
iPhone 12 cameraApple
L-glutamineCytivaSH3003401
Large Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-PlyFisher Scientific34133
M 205 FA StereomicroscopeLeica
Matrigel Membrane Matrix 354234CorningCB-40234
MC-1 UniMotor ControllerUnisense
Methyl red
MM33 MicromanipulatorMarzhauser Wetzlar61-42-113-0000Right handed
MS-15 Motorized StageUnisense
Nanoject-IIDrummond3-000-204nanoliter autoinjector
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15-140-148
pH MicroelectrodesUnisense50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160SensorTrace software is not compatible with Apple computers
Reference ElectrodeUnisenseREF-RM-001652SensorTrace software is not compatible with Apple computers
SB 431542Tocris Bioscience16-141-0
Smartphone Camera AdapterGosky
Specifications Laboratory Stand LSUnisenseLS-009238
Trypsin-EDTA 0.025%, phenol redGibco25-200-056
UniAmpUnisense11632
United Biosystems Inc MINI CELL SCRAPERS 200/PKFisherMCS-200
Y-27632 dihydrochlorideTocris Bioscience12-541-0
µSensor Calibration KitUnisense/ Mettler Toledo51-305-070, 51-302-069pH 4.01 and 9.21, 20 mL packets

References

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE209Luminal PHMicromanipulatorPH Gradient

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved