הבהרת #946;-1,3-גלוקנאז ופרוקסידז תכונות פיסיקוכימיות של מנגנון ההגנה על דופן תא החיטה מפני התפשטות Diuraphis noxia

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליכים המשמשים לחקר ואפיון אנזימים הקשורים לדופן התא, בעיקר β-1,3-גלוקנה ופרוקסידז, בצמחי חיטה. רמות הפעילות שלהם עולות במהלך אינטראקציה חיטה-RWA והם מעורבים בתגובת ההגנה של הצמח באמצעות חיזוק דופן התא, אשר מרתיע הזנת כנימות.

Abstract

צמחי חיטה שורצי כנימות חיטה רוסיות (RWA) גורמים לשרשרת של תגובות הגנה, כולל תגובות רגישות יתר (HR) ואינדוקציה של חלבונים הקשורים לפתוגנזה (PR), כגון β-1,3-גלוקנאז ופרוקסידז (POD). מחקר זה נועד לאפיין את התכונות הפיזיקוכימיות של POD ו- β-1,3-גלוקנאז הקשורים לדופן התא ולקבוע את הסינרגיזם שלהם על שינוי דופן התא במהלך אינטראקציה RWASA2-חיטה. זני Tugela-Dn1 הרגישים והעמידים Tugela-Dn5 העמידים הונבטו ונשתלו בתנאי חממה, הופרו 14 יום לאחר השתילה והושקו כל 3 ימים. הצמחים היו שורצים 20 פרטים פרתנוגנטיים של אותו שיבוט RWASA2 בשלב 3 העלים, והעלים נקטפו 1 עד 14 ימים לאחר ההתפשטות. נוזל השטיפה הבין-תאי (IWF) הופק באמצעות סינון ואקום ואוחסן בטמפרטורה של -20°C. שאריות העלים נמעכו לאבקה ושימשו לרכיבי דופן התא. פעילות ה-POD ואפיונו נקבעו באמצעות מצע גואיאקול 5 mM ו-H₂O₂, תוך ניטור השינוי בספיגה ב-470 ננומטר. פעילות β-1,3-גלוקנאז, pH ותנאים אופטימליים של טמפרטורה הודגמו על ידי מדידת סך כל הסוכרים המפזרים בהידרוליזה עם מגיב DNS באמצעות מצעים β-1,3-גלוקן ו-β-1,3-1,4-גלוקן, מדידת הספיגה ב-540 ננומטר ושימוש בעקומת תקן גלוקוז. ה- pH האופטימלי נקבע בין pH 4 ל -9, טמפרטורה אופטימלית בין 25 ל -50 ° C, ויציבות תרמית בין 30 ° C ל 70 ° C. ספציפיות מצע β-1,3-גלוקנה נקבעה ב 25 ° C ו 40 ° C באמצעות מצעי curdlan ושעורה β-1,3-1,4-גלוקן. בנוסף, אופן הפעולה β-1,3-גלוקנאז נקבע באמצעות למינריביוז ללמינריפנטאוז. תבניות המוצר של הידרוליזה אוליגוסכרידית נותחו באופן איכותי עם כרומטוגרפיה של שכבה דקה (TLC) ונותחו כמותית עם HPLC. השיטה המוצגת במחקר זה מדגימה גישה איתנה להשרצת חיטה עם RWA, מיצוי פרוקסידז ו- β-1,3-גלוקנאז מאזור דופן התא ואפיונם הביוכימי המקיף.

Introduction

כנימות חיטה רוסיות (RWA) שורצות חיטה ושעורה, וגורמות לאובדן יבול משמעותי או לירידה באיכות התבואה. חיטה מגיבה להתפשטות על ידי גרימת מספר תגובות הגנה, כולל העלאת רמות הפעילות של β-1,3-גלוקן ופרוקסידז בזנים העמידים, בעוד שזנים רגישים מפחיתים את הפעילות של אנזימים אלה בתקופת התפשטות מוקדמת 1,2,3,4. תפקידי המפתח של β-1,3-גלוקנאז ו-POD בצמח החיטה כללו ויסות הצטברות קלוזה בזני הזנים העמידים והחמצן הריאקטיבי (ROS) המרווה בדופן התא ובאזורים אפופלסטיים במהלך התפשטות RWA 1,3,5,6,7.

Protocol

המחקר נערך באישור ובאישור ועדת האתיקה למחקר סביבתי ובטיחותי של אוניברסיטת המדינה החופשית (UFS-ESD2022/0131/22). פרטי הריאגנטים והציוד כאן מפורטים בטבלת החומרים.

1. תנאי גידול הצמח

1. להנביט 250 זרעים של כל זן חיטה, כלומר, טוגלה רגיש, Tugela-Dn1 עמיד בינוני, ו Tugela-Dn5 עמיד, בצלחות פטרי נפרדות.
2. מוסיפים 5 מ"ל מים מזוקקים בכל צלחת פטרי, אוטמים בסרט פרפין ודגרים בתא הנביטה שנקבע על 25 מעלות צלזיוס למשך יומיים.
3. השתילו את הזרעים המובטים של כל זן בעציצים בקוטר 15 ס"מ המכילים אדמה 1:1 ואזוב כבול (15 צמחים לעציץ) בתנאי חממה מבוקרים.
4. הגדר את משטרי הטמפרטורה ב 1....

תוצאות

ארבעה העתקים ביולוגיים של זני חיטה (Tugela, Tugela-Dn1 ו-Tugela-Dn5) היו שורצים RWASA2 בשלב הגידול של 3 עלים. לאחר ההתפשטות, העלים נקטפו ב 1-, 2-, 3-, 7-, ו 14 dpi. טיפולי הבקרה לא היו שורצים RWASA2 כדי להפוך את תוצאות הניסוי לדומות לצמחי חיטה שלא נחשפו לעקה. הניסויים נערכו ברביעיות, והתוצאות הוצגו כערכים ממוצע?.......

Discussion

חיטה ושעורה הם גידולי דגנים שורצים לעתים קרובות על ידי מיני כנימות, כולל כנימות חיטה רוסיות (Diuraphis noxia)^7,24. צמחי חיטה עמידים גורמים להגברת הרגולציה של פעילויות POD ו- β-1,3-גלוקנאז כתגובות הגנה לאורך כל תקופת ההתפשטות לשינוי דופן התא על ידי ויסות הצטברות קלו?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 kDa Centrifuge concentrating membrane device	Sigma-Aldrich	R1NB84206	For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions.
2 g Laminaribiose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM2	High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3 g Laminaritriose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM3	High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3,5 Dinitro salicylic acid	Sigma-Aldrich	D0550	Used in colorimetric determination of reducing sugars
4 g Laminaritetraose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM4	High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
5 g Laminaripentaose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	O-LAM5	High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
95% Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	107017	Ethanol absolute for analysis
acetic acid	Sigma-Aldrich	B00063	Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid)
Azo-CM-Cellulose	Megazyme (Wicklow, Ireland)	S-ACMC	The polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues.
Beta glucan (barley)	Megazyme (Wicklow, Ireland)	G6513	A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity.
Bio-Rad Protein Assay Dye	Bio-Rad Laboratories, South africa	500-0006	Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II
Bovine serum albumin (BSA)	Gibco Europe	810-1018	For Laboratory use only
Citrate acid	Sigma-Aldrich	C0759	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
CM-curdlan	Megazyme (Wicklow, Ireland)	P-CMCUR	Powdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water.
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
Guaiacol	Sigma-Aldrich	G5502	Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity.
Hydrogen peroxide	BDH Laboratory Supplies, England	10366	Powerful oxidising agent.
Mikskaar Professional Substarte	Mikskaar (Estonia)	NI	Peat moss-based seedling substrate.
Multifeed fertiliser (5.2.4 (43))	Multifeed Classic	B1908248	A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development.
Naphthol	Merck, Germany	N2780	Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst.
Phenol	Sigma-Aldrich	33517	Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available
Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt)	Sigma-Aldrich	S2377	used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar.
Silica plate (TLC Silica gel 60 F254)	Sigma-Aldrich	60778-25EA	Silica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	For R&D use only. Not for drug, household, or other uses.
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	31448	Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions.
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S9390	Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant.
Sodium phosphate monobasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	71500	An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts.
Statistical analysis software	TIBCO Statistica	version 13.1
Sulfuric acid	Merck, Darmstadt, Germany	30743	Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent.
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	10812846001	Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures.
UV–Visible Spectrophotometer	GENESYS 120
NI = not identified.