כאן אנו מפרטים פרוטוקול אופטימלי להזרקת וריד זנב רוחבי של עכבר לניהול מערכתי של וירוס הקשור לאדנו (AAV) בעכברים בוגרים. בנוסף, אנו מתארים פרוטוקולים של בדיקות נפוצות להערכת התמרה AAV.
הפרעות רבות משפיעות על איברים מרובים או מערבות אזורים שונים בגוף, ולכן קריטי לספק טיפולים באופן מערכתי כדי להתמקד בתאים הפגועים הממוקמים באתרים שונים. הזרקה תוך ורידית היא נתיב אספקה מערכתי נפוץ במחקרים פרה-קליניים המעריכים טיפולים המיועדים למתן בכל הגוף. בעכברים בוגרים, זה כרוך ניהול תוך ורידי של סוכן טיפולי לתוך ורידים זנב לרוחב של העכבר. כאשר שולטים בהן, זריקות ורידים בזנב הן בטוחות ומהירות, ודורשות רק כלים פשוטים וזמינים בדרך כלל. עם זאת, זריקות ורידים זנב הן מאתגרות מבחינה טכנית ודורשות הכשרה מקיפה ותרגול מתמשך כדי להבטיח את המסירה המדויקת של המינון המיועד.
כאן אנו מתארים פרוטוקול הזרקה מפורט, אופטימלי ורוחבי של ורידים בזנב שפיתחנו בהתבסס על הניסיון שלנו ועל המלצות שדווחו בעבר על ידי קבוצות אחרות. מלבד ריסוני עכברים ומזרקי אינסולין, פרוטוקול זה דורש רק ריאגנטים וציוד הזמינים ברוב המעבדות. מצאנו כי ביצוע פרוטוקול זה מביא להעברה מוצלחת באופן עקבי תוך ורידי של וירוס הקשור באדנו (AAV) לתוך ורידי הזנב של עכברים לא מורדמים בני 7-9 שבועות. בנוסף, אנו מתארים את הפרוטוקולים הממוטבים לזיהוי היסטולוגי של חלבוני כתב פלואורסצנטיים וגנום וקטורי לכימות גנום דיפלואידי (vg/dg) המשמשים להערכת התמרה והפצה ביולוגית של AAV. מטרת פרוטוקול זה היא לסייע לנסיינים לבצע בקלות זריקות ורידים בזנב בהצלחה ובעקביות, מה שיכול להפחית את זמן התרגול הדרוש כדי לשלוט בטכניקה.
הפרעות מונוגניות מהוות 80% מהמחלות הנדירות, אשר משפיעות באופן קולקטיבי על 300 מיליון אנשים ברחבי העולם 1,2. כיום אין טיפולים מרפאים מאושרים לרוב ההפרעות הנדירות המתישות הללו 1,2,3. עם זאת, הפרעות מונוגניות הן מועמדות אידיאליות לטיפולים גנטיים שיכולים להחליף, להשלים, לתקן או להשתיק גנים לא מתפקדים 4,5. כיום, וקטורים מרובים מפותחים ומשמשים להעברת טיפולים גנטיים לסוגי תאים ספציפיים 4,6. אחד מאותם וקטורים הוא וירוס הקשור לאדנו (AAV). AAV הוא נגיף פרוו לא פתוגני המשמש יותר ויותר כווקטור ריפוי גנטי7. בהשוואה לווקטורים נגיפיים אחרים, ל-AAV יש אימונוגניות נמוכה יותר, פוטנציאל נמוך יותר להשתלב בגנום המארח, ויכולת להתמיר ביעילות תאים מתחלקים ולא מתחלקים ברקמות שונות 7,8. בנוסף, פותחו גישות רבות כדי להנדס ולזהות AAVs עם מאפיינים רצויים כגון טרופיזם רקמות ספציפי או אימונוגניות מופחתת נוספת, אשר משפר מאוד את הרבגוניות של AAV כווקטור ויראלי עבור אינדיקציות שונות9. גורמים אלה הפכו את AAV לווקטור ריפוי גנטי שנחקר באופן נרחב והובילו לפיתוח טיפולים גנטיים מבוססי AAV10 שאושרו על ידי ה- FDA.
מודלים של עכברים משמשים בדרך כלל כדי לבחון טיפולים גנטיים פוטנציאליים in vivo ולהבין טוב יותר את הפתומנגנונים של הפרעות מונוגניות. הסיבה לכך היא שחזור הפתולוגיות של מודלים עכבריים של מצבים שונים, הדמיון של הגנום שלהם לגנום האנושי, והקלות היחסית של טיפול, תחזוקה ודור 11,12,13 של עכברים. בדיקת In vivo חשובה במיוחד כאשר חוקרים הפרעות המשפיעות על מערכות או אזורים מרובים בגוף, כגון ניוון שרירים. עבור הפרעות אלה, בדיקות חוץ גופיות עשויות שלא להספיק כדי להעריך באופן מקיף את הבטיחות, היעילות, הפרמקוקינטיקה והפרמקודינמיקה של טיפולים המיועדים להגיע לאזורי גוף שונים לאחר מתן מערכתי14.
ניתן להשתמש בנתיבי ניהול מערכתיים שונים כדי לספק תרופות. לכל מסלול יש יתרונות, חסרונות ומידת התאמה למודל החייתי ולתרופה הנחקרת15. הזרקה תוך ורידית (IV) לרוחב וריד הזנב היא דרך נפוצה להעברה מערכתית של AAV בעכברים16. הזרקות רוחביות לווריד הזנב מאפשרות ניהול מהיר וישיר של ההזרקה לזרם הדם של העכבר ומבטיחות זמינות ביולוגית גבוהה של התרופה במחזור הדם המערכתי17. הם גם דורשים כלים פשוטים יחסית וזמינים בדרך כלל כדי להתבצע. עם זאת, בעיקר בשל קוטר וריד הזנב הקטן והקושי באיתור הווריד, זריקות רוחביות של וריד הזנב הן מאתגרות מבחינה טכנית ודורשות רמה גבוהה של מיומנות ותרגול מתמיד כדי להימנע מניסיונות הזרקה כושלים או מתן מינון לא שלם 16,17,18,19. אלה יכולים לגרום לאובדן ריאגנטים יקרים או תוצאות לא מדויקות, במיוחד אם הזריקה הלא שלמה אינה מזוהה בעת ביצוע ההזרקה. הניסיון שלנו המסוכם כאן מבוסס על פרוטוקולים שדווחו במאמרים מתועדים היטב שהתאמנו לשימושנו, תוך אופטימיזציה של שלבים שונים של הליך הזרקת וריד הזנב הצידי כדי להבטיח זריקות מוצלחות באופן עקבי20,21,22,23,24,25,26,27.
במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט זה של הזרקת ורידי זנב לרוחב כדי לספק AAV לעכברים לא מורדמים בני 7-9 שבועות באמצעות כלים פשוטים וזמינים בדרך כלל. בנוסף, אנו מספקים את הפרוטוקולים לשיטות המשמשות להערכת אספקת AAV והפצה ביולוגית. פרוטוקולים אלה מכסים איסוף רקמות לאחר הזרקה, קיבוע רקמות, מיצוי DNA וגנום וקטורי של תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית (dPCR) לכימות גנום דיפלואידי (vg/dg). פרוטוקול הזרקת העירוי והמצביעים המסופקים כאן נועדו לשפר את הקלות של ביצוע מוצלח של הזרקות לרוחב ורידי הזנב. זה עשוי לעזור להפחית את הזמן הדרוש כדי לשלוט במיומנויות ההזרקה ובו זמנית לשפר את הדיוק והעקביות של הזרקות.
כל הליכי הטיפול וההזרקה בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים ב- NINDS. כל ההליכים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות NINDS לטיפול ושימוש בבעלי חיים.
1. הכנה לפני הזרקה
2. הליך הזרקה
3. דיסקציה ואיסוף רקמות וקיבוע27
4. dPCR לכימות VG/DG
עכברים זכרים בני שבעה עד תשעה שבועות הוזרקו עם AAV באמצעות הזרקה צידית של וריד הזנב ב 1.5 × 1012 vg / עכבר שסופקו בנפח הזרקה של 150-200 μL. ה- ssDNA AAV המשמש כאן סיפק טרנסגן Cre recombinase המונע על ידי מקדם CMV. העכברים שהוזרקו היו הומוזיגוטיים לאלל Ai14 של כתב Cre. כאשר נחשפים ל-Cre recombinase, תאים המכילים אלל Ai14 מבטאים את החלבון הפלואורסצנטי tdTomato. מאחר שביטוי tdTomato נגרם על ידי רקומבינציה גנומית המושרה על ידי Cre, תאים המבטאים tdTomato מצביעים על תאים שהותמרו ישירות על ידי AAV או שהיו תאי צאצא של תאים מותמרים. הנתונים המוצגים כאן הם של עכברים שהוזרקו AAV9-CMV-Cre ב 1.5 × 1012 vg / עכבר נמסר ב 160 μL (5.8-5.9 × 1013 vg / kg). העכברים הוקרבו 28 יום לאחר ההזרקה, והרקמות נאספו כמתואר לעיל. כמה שרירי שלד ואונות כבד עוכלו, והתאים שלהם נאספו באמצעות FACS. כמה אונות כבד הוקפאו מיד באמצעות מתילבוטאן מראש למיצוי חומצות גרעין. כמה שרירי שלד ואונות כבד תוקנו-הוקפאו לצורך הדמיה היסטולוגית של tdTomato פלואורסצנטי. tdTomato התבטא באופן מפוזר ברחבי הכבד (איור 2A) והארבע ראשי (איור 2C), מה שמצביע על כך ש-AAV9 הגיע באופן נרחב לאזורים שונים בשתי הרקמות.
DNA שהופק מכבד קפוא טרי ותאים ממוינים FAC שימש לכימות vg/dg באמצעות dPCR. ניתן להשתמש בכימות Vg/dg כדי להעריך את עקביות ההזרקה ואת יעילות ההמרה של AAV במדגם המנותח. פיזור טיפות 1D מדגימת רקמת כבד טרייה קפואה ותאים ממוינים FAC שימשו כדי להבטיח את תקפות הבדיקה (איור 3A,C). תרשים הפיזור הראה נוכחות של מחיצות חיוביות ושליליות, הפרדה ברורה בין המחיצות החיוביות והשליליות המאפשרת קביעה מדויקת של סף הזיהוי, ונוכחות של טיפות בודדות בין המחיצות החיוביות והשליליות, מה שיכול להפחית את הדיוק של בדיקת dPCR. עמידה בכל הקריטריונים הללו הצביעה על כך שתוצאות בדיקת dPCR היו תקפות. מספר עותקי הגן Polr2a בכל דגימה כומת כדי לקבוע את מספר הגנומים הדיפלואידיים של עכברים (2 עותקי גן Polr2a/גנום דיפלואידי עכבר), ונעשה שימוש בפריימרים/בדיקה כנגד רצף הטרנסגנים Cre recombinase כדי לכמת את הגנום הנגיפי (עותק טרנסגני אחד/גנום נגיפי, טבלה 1). ערך vg/dg כומת עבור דגימת רקמת כבד טרייה קפואה ותאים ממוינים FACS, והראה נוכחות של 187.7 vg/dg ו-4.7 vg/dg בכל דגימה, בהתאמה (איור 3B,D). דגימות מעכברים שהוזרקו באמצעות PBS ובקרות שאינן מכילות חומצות גרעין שימשו כבקרות שליליות.
איור 1: סקירה כללית של תחנת הזרקה תוך ורידית. (A) כלים הדרושים לביצוע הזרקה בעירוי. מוצג כאן הטיימר (1), (2) מרסן צינור עכבר, (3) לא חתוך ו (4) קונוסים מרסנים פלסטיים חתוכים, (5) ספוגית אלכוהול, (6) קופסת טיפים פיפטה ריקה המשמשת כפלטפורמה להרמת ריסון צינור העכבר, (7) רפידות סופגות חד פעמיות, (8) צינור חרוטי 15 מ"ל עם מים חמים, (9) מחזיק צינור 15 מ"ל, (10) גזה, ו (11) מזרק אינסולין. (B) העכבר ממוקם תחילה בתוך משנן הצינור. לאחר מכן, חרוט הריסון החתוך מוכנס כדי ליצור שרוול מרסן סביב העכבר, אם העכבר קטן מכדי להיות מרוסן על ידי משנן הצינור בלבד. ודא כי נשימתו של העכבר אינה מופרעת על ידי מרסנים. משנן הצינור ממוקם על גבי הפלטפורמה המוגבהת כדי לאפשר את מיקום זנב העכבר במים חמים. (C) מיקום זנב העכבר וזווית אחיזת המחט מיד לפני ביצוע ההזרקה. משוך לאחור את הזנב כך שהזנב נמתח, ואתר ההזרקה אופקי לחלוטין. המחט מקבילה לזנב ולווריד, והשיפוע פונה כלפי מעלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: זיהוי חלבון פלואורסצנטי לאחר הזרקת IV. עכברים זכרים בני שבעה עד תשעה שבועות המכילים את האלל Ai14 של כתב Cre הוזרקו עם AAV9-CMV-Cre בעוצמה של 1.5 × 10,12 vg/mouse שנמסרו ב-160 μL (5.8-5.9 × 10,13 vg/kg) או PBS. תמונות פלואורסצנטיות מייצגות של עכבר (A) כבד או (C) חלקים ארבע ראשיים לאחר AAV9 מתן הזרקת Cre IV. (B) מקטעי כבד או (D) ארבע ראשי מעכברים שהזריקו PBS צולמו כדי לשמש כבקרות שליליות. הרקמות נאספו והוקפאו 28 יום לאחר הזרקת העירוי. לאחר חשיפה ל-Cre, חלבון tdTomato פלואורסצנטי מתבטא בתאים מותמרים ובתאי צאצאים של תאים מותמרים. חתכים בעובי 10 מיקרומטר צולמו בהגדלה של פי 10. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: כימות גנום וקטורי לכל גנום דיפלואידי (vg/dg). פיזור 1D של כימות גנום וקטורי dPCR ברקמת כבד (A) או (C) תאים ממוינים FACS שנאספו מעכברים שהוזרקו עם AAV9-CMV-Cre או PBS. תרשימי הפיזור מציגים את מחיצות dPCR החיוביות והשליליות, כמו גם את סף הזיהוי המצוין על ידי הקו האופקי על פני הדגימות. (B,D) כימות vg/dg לאחר כימות הגנום הדיפלואידי של העכבר והגנום הווקטורי ברקמת הכבד (B) או (D) דגימות תאים ממוינות FACS. התוצאות המוצגות כאן הן מעכבר מוזרק AAV9 יחיד ועכבר מוזרק PBS יחיד עם שכפול dPCR טכני עבור כל עכבר. קווי שגיאה מציינים רווח בר-סמך של 95% עבור כל דגימה. קיצורים: NTC= פקד שאינו תבנית; dPCR = PCR דיגיטלי; FACS = מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
תחל | רצף |
פריימר Cre קדימה | CTGACGGTGGGAGAATGTTAAT |
פריימר הפוך Cre | CATCGCTCGACCAGTTTAGTT |
בדיקת Cre | /56-FAM/CGCAGGTGT/ZEN/AGAGAAGGCACTTAGC/3IABkFQ/ |
פריימר קדמי Polr2a | GACTCCTTCACTCACTGTCTTC |
פריימר הפוך Polr2a | TCTTGCTAGGCAGTCCATTATC |
בדיקת Polr2a | /5HEX/ACGAGATGC/ZEN/TGAAAGAGCCAAGGT/3IABkFQ/ |
טבלה 1: רצפים של פריימרים וגשושיות המשמשים לכימות vg/dg. פריימרים של Cre ובדיקה שימשו לכימות הגנום הווקטורי. פריימרים ובדיקה Polr2a שימשו לכימות הגנום הדיפלואידי של העכבר.
טיפולים מבוססי AAV טומנים בחובם פוטנציאל גדול להפרעות מונוגניות בשל הרבגוניות של AAV כווקטור ריפוי גנטי, המאפשר להתאים אישית AAVs כדי לענות על צרכי המסירה השונים של הפרעות שונות 4,5,7,9. AAVs ניתנים בדרך כלל באמצעות הזרקת IV במודלים פרה-קליניים של עכברים כדי לבדוק את הבטיחות והיעילות של טיפולים פוטנציאליים16. מכיוון שמינונים שונים של AAV מוזרקים יכולים לגרום להבדלים ניכרים בתוצאות הניסוי, זה קריטי עבור הנסיינים להיות מסוגלים להזריק באופן עקבי את מינון ה- AAV המיועד כדי להבטיח את התוקף והחוסן של נתוני ה- in vivo שנוצרו28. זריקות IV נמצאות בשימוש נרחב, אך הן מאתגרות מבחינה טכנית ודורשות הכשרה מקיפה ותרגול מתמשך כדי לפתח ולשמור על רמת מיומנות המבטיחה זריקות מוצלחות באופן עקבי 16,17,18,19. בנוסף להזרקה נכונה של AAV, בדרך כלל רצוי להשתמש בבדיקות כדי להעריך את יעילות ההפצה הביולוגית והאספקה של AAV המוזרק לרקמות היעד או לתאים29,30.
פרוטוקול זה נועד לסייע לנסיינים לבצע בקלות זריקות IV בהצלחה ובעקביות על ידי תיאור יסודי של הפרטים של פרוטוקול הזרקת IV אופטימלי למתן AAV בעכברים בני 7-9 שבועות, ללא הרדמה. חשוב לציין כי עכברים קטנים או גדולים משמעותית מעכברי בר בטווח הגילאים המשמש כאן עשויים להוות אתגר גדול יותר בשל ראות מופחתת של הוורידים או חוסר התאמה עם המעצורים המשמשים בשיטה זו. בעבר דווח כי זריקות IV זנב אינן מתאימות למתן ריאגנטים תוך ורידי בעכברים מתחת לגיל 6 שבועות בשל גודל כלי הדם הקטן31. למרות שניתן, ייתכן שיהיה קשה להזריק באופן עקבי עכברים במשקל של פחות מ-22.0 גרם בהצלחה. חוקרים המשתמשים בעכברים בגודל לא טיפוסי עשויים להזדקק לבצע התאמות להליך. פרוטוקול זה גם מתאר מספר בדיקות שניתן להשתמש בהן כדי להעריך את יעילות ההפצה הביולוגית והטרנסדוקציה של AAV.
יש לזכור כמה נקודות קריטיות בעת ביצוע פרוטוקול זה. במהלך ההזרקה, מחטי 29 G מספקות התנגדות גדולה יותר אם המחט אינה בתוך הווריד. פעולה זו מפחיתה את הנפח שאבד מהזרקה פריווסקולרית בשוגג של התמיסה במהלך ניסיונות הזרקה כושלים. מזרקי אינסולין הם בעלי נפחים מתים קטנים יותר מאשר מזרקים רגילים. אם משתמשים במזרק ו/או מחט שונים מאלה המפורטים כאן, ייתכן שיהיה צורך להכין נפח הזרקה נוסף בשלבי פרוטוקול 1.1.3.3 כדי לקחת בחשבון נפח שטח מת גדול יותר (למשל, להוסיף 30 μL למינון המיועד במקום 15 μL).
אם נוצרות בועות אוויר עדינות הנובעות משאיפה בדפנות המזרק תוך כדי שאיפת מנת AAV לתוך המזרק, משכו לאט את ההזרקה הלאה במעלה המזרק. פעולה זו תסיר את רוב בועות האוויר הקטנות. טען לפחות 10-15 μL נוספים של AAV לנפח המיועד להזרקה. נפח נוסף זה אמור לקחת בחשבון כל נפח שעלול ללכת לאיבוד במהלך סילוק בועות אוויר או ניסיונות הזרקה כושלים פוטנציאליים. (למשל, אם נפח היעד להזרקה הוא 150 μL, טען 165 μL לתוך המזרק (באמצע הדרך בין 160 μL ו 170 μL סימנים על סולם מזרק). אם המחט ממוקמת כראוי בתוך הווריד, והנפח במזרק הוא ב 165 μL מיד לפני ניסיון ההזרקה המוצלח, לספק את מגיב עד 15 μL נשארים מזרק (באמצע הדרך בין 10 μL ו 20 μL סימנים), ובכך לספק 150 μL (165 μL - 150 μL = 15 μL)). יישור לומן משופע (משופע הפונה כלפי מעלה) עם סולם המזרק מאפשר מעקב אחר הנפח המועבר במהלך ההזרקה.
חלק מהנסיינים יעדיפו למקם את העכבר על צדו כך שאחד הוורידים שלו יהיה ישר ונגיש בקלות בהשוואה לעכבר על רגליו. עם זאת, זנב העכבר על צדו יהיה משופע בזוויות שונות בהתאם לגודל העכבר הדורש התאמת זווית הזרקה בעת הזרקת עכברים בגדלים שונים. הדבר עלול להשפיע לרעה על עקביות הצלחת ההליך. במהלך ניסיונות תרגול ראשוניים, הנסיינים יכולים לנסות את שני כיווני ריסון העכבר כדי לקבוע את הגישה המועדפת עליהם. עמידת העכבר על רגליו מאפשרת גישה מהירה וקלה לשני ורידי הזנב הרוחביים. זה מקטין את זמן הריסון כאשר יש צורך בגישה לשני הוורידים במקרה של ניסיונות הזרקה כושלים מרובים.
אם מזריקים את הווריד הצידי קרוב לבסיס הזנב (קרוב יותר לגוף העכבר) (במיוחד עבור עכברים במשקל >30 גרם), יש להתאים את זווית ההזרקה מהמקביל לווריד ל-5°-10° לווריד מכיוון שהוריד בבסיס הזנב מעט עמוק יותר מאשר הוא דיסטלי.
פרוטוקולי בדיקת העיכול והזיהום של RNase המפורטים כאן אומתו על דגימות DNA שבודדו מרקמות כבד קפואות טריות המכילות סך של 175-700 ננוגרם של חומצות גרעין ב-20 מיקרוליטר. פרוטוקול העיכול של RNase נבדק גם על דגימות DNA שבודדו מרקמות כבד קפואות טריות ותאים ממוינים ב-FACS כדי לאשר את נוכחות הגנום הווקטורי והגנום של העכבר לאחר עיכול RNase. התוצאות הודגמו באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז של הגברת PCR בנקודת הקצה של מגברי המטרה.
ביצוע המתודולוגיה המתוארת יכול להפחית את זמן האימון והתרגול הדרוש כדי לשלוט בזריקות IV ולגרום לשיעור הזרקות מוצלח גבוה יותר, אשר יחסוך ריאגנטים. פרוטוקול זה משתמש בכלים פשוטים ונפוצים ללא צורך בציוד מתקדם או הגדרות שייתכן שלא יהיו זמינות. יתר על כן, שלבי ההזרקה בעירוי המפורטים כאן יכולים להיות מיושמים על מגוון רחב של זריקות שיש לתת תוך ורידי, כגון אוליגונוקלאוטידים אנטיסנס (ASOs), עם השינויים המתאימים שבוצעו בשלבי הכנת ההזרקה בהתאם להזרקה.
למחברים אין גילויים רלוונטיים לעבודה שפורסמה במאמר זה.
המחברים רוצים להודות לצוות מתקן הטיפול בבעלי חיים NINDS על תמיכתם. עבודה זו נתמכה על ידי האגף למחקר אינטרמורלי של NIH, NINDS (דוח שנתי מספר 1ZIANS003129). התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22 µm syringe filter | Millipore | SLGVM33RS | |
0.3 mL insulin syringes with 29G needle | BD Biosciences | 324702 | |
1.7 mL microcentrifuge tube | Crystalgen | 23-2051 | |
10 mL syringe | BD Biosciences | 302995 | |
100% EtOH | The Warner Graham Company | 201096 | |
10x phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 46-013-CM | Used to prepare 1x PBS for tissue fixation |
15 mL conical tube | Corning | 430766 | |
15 mL conical tube holder | Multiple sources | N/A | |
190 proof ethyl alcohol | The Warner Graham Company | 6810-01-113-7320 | Used to prepare 70% ethanol |
1x sterile PBS | Gibco | 10010023 | |
2 mL microcentrifuge tissue storage tubes | Eppendorf | 022363344 | |
4% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | |
Adeno-associated virus (AAV) | Charles River | N/A | Single-stranded DNA (ssDNA) AAV was packaged to deliver Cre recombinase as the transgene driven by CMV promoter |
Alcohol swab | BD Biosciences | 326895 | |
Bead lysis tube | Next Advance | GREENE5 | |
BsuRI (HaeIII) restriction enzyme | Thermo Fisher Scientific | ER0151 | |
Bullet blender | Next Advance | BBX24B | |
Ai14-derived mice from JAX 007914 strain (genetic background: C57BL/6J) | N/A | N/A | Mice containing Ai14 Cre-reporter allele were purchased from JAX (catalog number: 007914) |
Disposable absorbent pads | Fisherbrand | 1420662 | |
Dissection forceps | Fine Science Tools (F.S.T) | 11251-35 | |
Dissection scissors | Fine Science Tools (F.S.T) | 14085-08 | |
DNA degradation reagent (DNAZap) | Invitrogen | AM9890 | |
DNA-Extraction RNase A | Qiagen | 19101 | For RNA digestion during nucleic acid extraction |
DNase-free RNase for DNA cleanup | F. Hoffmann-La Roche | 11119915001 | For RNA digestion after nucleic acid extraction |
dPCR Probe PCR Kit | Qiagen | 250102 | |
dPCR software | Qiagen | N/A | QIAcuity Software Suite |
Elevated platform | Multiple sources | N/A | An empty pipette tips box was used to elevate the mouse restrainer during tail warming up |
Fluorescence microscope | Multiple sources | N/A | Model used here: Nikon Eclipse Ti |
Fluorescence microscope software | Multiple sources | N/A | Software used here: NIS-Elements |
Gauze | Covidien | 9022 | |
Heat block | Eppendorf | Thermomixer 5350 | |
High-speed centrifuge | Eppendorf | 22620689 | |
Metal container | Vollrath | 80125 | |
Methylbutane | J.T. Baker | Q223-08 | |
Molecular grade water | Quality Biological | 351-029-131 | |
Mouse tube restrainer | Braintree Scientific | TV-RED-150-STD | |
Myfuge mini centrifuge | Benchmark Scientific | C1012 | |
Polymerase chain reaction thermal cycler | Bio-Rad Laboratories | 1851148 | Model: C1000 Touch |
Precision wipes | Kimberly-Clark Professional | 7552 | |
Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
QIAcuity dPCR Nanoplate 26k 24-well | Qiagen | 250001 | |
QIAcuity One dPCR system | Qiagen | 911020 | |
Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | Used for DNA extraction from tissues |
Qiagen QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | Used for cleanup of genomic DNA, and the isolation of DNA from small volumes of blood prtocotol was used for DNA extraction from FACS-sorted cells |
Rodent restrainer cone | Braintree Scientific | MDC-200 | |
Scale | Ohaus | 72212663 | |
Styrofoam box | Multiple sources | N/A | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-1kg | |
Surface cleaner and disinfectant | Peroxigard | 29101 | |
Timer | Multiple sources | N/A | |
Transfer forceps | Fine Science Tools (F.S.T) | 91113-10 | |
Vortex | Daigger & Company | 22220A | Model: Daigger Vortex Genie 2 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved