חקירת אנגיוגנזה ברמה תפקודית ומולקולרית על ידי מינוף בדיקת נדידת פצע השריטה ובדיקת הנבטת הספרואיד

Summary

מחקר זה מציג את בדיקת נדידת פצעי השריטה הדו-ממדית (2D) ואת בדיקת הנבטת הספרואידים התלת-ממדית (3D), יחד עם שיטות הניתוח שלהם במורד הזרם, כולל מיצוי RNA ואימונוציטוכימיה, כבדיקות מתאימות לחקר אנגיוגנזה במבחנה.

Abstract

אנגיוגנזה ממלאת תפקיד מכריע בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים בגוף, כולל צמיחת הגידול או מחלת עיניים ניאו-וסקולרית. הבנה מפורטת של המנגנונים המולקולריים הבסיסיים ומודלי סינון אמינים חיוניים למיקוד יעיל של מחלות ולפיתוח אפשרויות טיפוליות חדשות. מספר בדיקות במבחנה פותחו כדי למדל אנגיוגנזה, תוך ניצול ההזדמנויות שסביבה מבוקרת מספקת כדי להבהיר מניעים אנגיוגניים ברמה המולקולרית ולסנן מטרות טיפוליות.

מחקר זה מציג תהליכי עבודה לחקר אנגיוגנזה במבחנה באמצעות תאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs). אנו מפרטים בדיקת נדידת פצעי שריטה באמצעות מערכת הדמיה של תאים חיים המודדת נדידת תאי אנדותל בסביבה דו-ממדית ובדיקת הנבטת ספרואיד המעריכה הנבטת תאי אנדותל בסביבה תלת-ממדית המסופקת על ידי מטריצת קולגן. בנוסף, אנו מתווים אסטרטגיות להכנת דגימות כדי לאפשר ניתוחים מולקולריים נוספים כגון תעתוק, במיוחד בסביבה התלת-ממדית, כולל מיצוי RNA וכן אימונוציטוכימיה. בסך הכל, מסגרת זו מציעה למדענים ערכת כלים אמינה ורב-תכליתית כדי להמשיך את החקירות המדעיות שלהם בבדיקות אנגיוגנזה חוץ גופית .

Introduction

אנגיוגנזה, המתייחסת להיווצרות כלי דם חדשים מכלי דם קיימים¹, היא תהליך מכריע במהלך התפתחות פיזיולוגית ומצבים פתולוגיים. זה הכרחי למתן אנרגיה לרקמות פעילות מטבולית מאוד כגון הרשתית² או מערכת העצבים המרכזית המתפתחת³ ובמהלך הריפוי של רקמה פגומה⁴. אנגיוגנזה חריגה, לעומת זאת, היא הבסיס למחלות רבות. גידולים מוצקים, כגון סרטן המעי הגס או סרטן ריאות תאים שאינם קטנים, להקל על הצמיחה שלהם ואת אספקת האנרגיה הדרושה על ידי קידום אנגיוגנזה⁵. מלבד סרטן, מחלות ניאו-וסקולריות של העין כמו רטינופתיה סוכרתית או ניוון מקולרי הקשור לגיל, המייצגות גורמים מובילים לעיוורון בעולם המפותח, נובעות מצמיחת כלי דם חריגה ^6,7. הבנה מפורטת של המנגנון הבסיסי היא חיונית כדי להבין כיצד ניתן לשפר אנגיוגנזה פיזיולוגית, למשל, בריפוי פצעים תוך שליטה טובה יותר במצבים פתולוגיים כגון מחלות עיניים vasoproliferative.

ברמה התאית, תאי אנדותל וסקולריים מופעלים על ידי מולקולות איתות שונות באנגיוגנזה, מה שגורם להתרבות תאים ונדידתם⁸. התאים מתארגנים לאחר מכן בהיררכיה, כאשר תאי קצה שאינם מתרבים יוצרים פילופודיה בקצה המוביל של ענף כלי הדם המתפתח⁸. לצידם, תאי גבעול המתרבים במהירות נגררים אחר תאי הקצה, ותורמים להיווצרות הכלי המגיח. לאחר מכן, סוגי תאים אחרים, כגון פריציטים או תאי שריר חלק, מגויסים כדי לייצב עוד יותר את ענף⁹ המתהווה.

כדי לחקור תהליכים מולקולריים ברמת תאי האנדותל של כלי הדם, פותחו פרוטוקולים רבים במבחנה ונסקרו לאחרונה¹⁰. בדיקות אלה מתחלקות בדרך כלל לשתי קטגוריות: גישות דו-ממדיות פשטניות יותר אך ניתנות להרחבה ופרוטוקולים תלת-ממדיים מורכבים יותר. בפרויקט שנערך לאחרונה, ערכנו ניתוח השוואתי מקיף בין בדיקת נדידת פצעי שריטה דו-ממדית לבין בדיקת הנבטת ספרואיד תלת-ממדית¹¹ כדי להעריך את מידת ההבדלים ביניהם ואת יכולתם למדל היבטים שונים של אנגיוגנזה¹².

בעוד ששניהם מציעים את היתרונות של היותם אמינים וקלים ליישום, ברמה המולקולרית, בדיקת הנבטת הספרואידים התלת-ממדית הייתה חיובית בטיפול בהיבטים מרכזיים של אנגיוגנזה בהשוואה לנתונים in vivo, כגון מתגים מטבוליים או אינטראקציות בין מטריצת תאים. מכיוון שמבחני אנגיוגנזה חוץ גופית משמשים להערכת הפוטנציאל האנגיומודולטורי של מסלולי איתות¹³ ולסינון סוכנים טיפוליים, יכולת העברה של תוצאות במבחנה להגדרות in vivo היא חיונית. יתר על כן, ההזדמנות לניתוחים מבוססי אומיקס על רמות הרנ"א והחלבון לאפיין את השינויים המולקולריים בתגובה לאפנון ממוקד של תהליכים אנגיוגניים בתנאים מבוקרים נותרה יתרון חשוב בהשוואה להגדרות in vivo ^14,15.

בפרסום זה, אנו מציגים מבחני מפתח לחקר שאלות הקשורות לאנגיוגנזה באמצעות שימוש בבדיקת נדידת הדמיה של תאים חיים ובדיקת הנבטת ספרואידים, כולל ניתוחים מולקולריים עוקבים כמו ריצוף RNA לניתוח שעתוק ואימונוהיסטוכימיה ברמת החלבון.

Protocol

1. תרבית תאי HUVEC

הערה: בצע את כל השלבים הבאים בתנאי עבודה סטריליים (ספסל עבודה סטרילי).

1. הרחבת HUVECs
   1. עבור שתי בדיקות אנגיוגנזה, השתמש בתאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs) או בתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים אנושיים (HMVECs).
   2. טפחו את התאים עד שהם מגיעים למפגש של 90% בבקבוק T75 לא מצופה עם מדיום גידול תאי אנדותל (EGM) לפני ביצוע פיצול. בצע שינוי בינוני 3 פעמים בשבוע.
      הערה: כדי לזרז את הצמיחה, ניתן לשנות את המדיום מדי יום. אין להשתמש ב-HUVECs מעבר למעבר למעבר השישי. המחקר קיבל את התוצאות העקביות ביותר כאשר הריץ את כל הניסויים עם HUVECs של אותו מעבר.
2. פיצול HUVECs
   1. כאשר HUVECs מגיעים למפגש הרצוי בצלוחית T75, שטפו אותם פעם אחת עם 5 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS), ולאחר מכן דגרו את התאים עם 0.5% טריפסין במשך 2 דקות באינקובטור.
      הערה: חשיפה ממושכת לטריפסין עלולה לפגוע בתפקוד HUVEC.
   2. נתק בעדינות את התאים על ידי הקשה על הצלוחית. אשר ניתוק מוצלח תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכה.
   3. מוסיפים 8 מ"ל של EGM, מעבירים את התמיסה לצינור, ומטילים את התאים בצנטריפוגה ב 250 x גרם למשך 3 דקות.
   4. אם יש צורך בספירת תאים, השהה מחדש את התאים ב -5 מ"ל של EGM והשתמש בתא נויבאואר. אחרת, הוסיפו 40 מ"ל של EGM והפיצו אותו על 4 צלוחיות תרבית תאי T75 טריות.

2. בדיקת נדידת פצע שריטה

הערה: בדיקת נדידת פצע השריטה דורשת משך זמן של 3 ימים להשלמתה (איור 1). בצע את כל השלבים הבאים בתנאי עבודה סטריליים (ספסל עבודה סטרילי).

1. ציפוי והרעבת תאים (יום 1)
   1. באמצעות צלחת מיוחדת של 96 בארות להדמיית תאים חיים, זרעו 20,000 HUVECs ב-100 מיקרוליטר של EGM לכל באר. מאפשרים לתאים להסתפק 6 שעות באינקובטור.
      הערה: מומלץ למטב את מספרי התאים בהתחשב במהירות המשתנה של צמיחת תאי אנדותל כלי דם בין ספקים ומעבדות. המטרה היא להשיג מונושכבה מושלמת למחרת לפני תחילת השריטה. בארות מאוכלסות יתר על המידה יכולות לשנות את התנהגות תאי האנדותל, למשל, על ידי עיכוב מגע¹⁶, בעוד מונושכבה לא שלמה מעכבת את הניתוח באופן דרסטי.
   2. הרעיבו את כל הבארות למשך הלילה עם 100 μL של EBM לכל באר בתוספת 2% FBS.
      הערה: היזהר שלא לפגוע בחד-שכבה של התא, במיוחד בעת שימוש בפיפט רב-ערוצי.
2. הכנת פתרונות גירוי (יום 2)
   1. לדלל את החומרים הרצויים ולבקרות במדיום הבסיסי של צמיחת תאי אנדותל (EBM) בתוספת FBS של 2%. עבור כל באר, להשתמש 100 μL של פתרון.
      הערה: EBM בתוספת FBS של 2% משמש כבקרה שלילית, בעוד שגורם גדילה רקומביננטי של אנדותל כלי הדם האנושי (VEGF) ב -25 ננוגרם/מ"ל יכול לשמש כבקרה חיובית. באמצעות לוחות 96 בארות, מומלץ לתכנן את הניסויים עם מינימום של העתקים טכניים (4 בארות עם תנאים זהים), אם כי מוצע כי 8 ישמשו לתוצאות אופטימליות. שאפו למזער אפקטים פוטנציאליים של קצה או פינה בעת תכנון הפריסה.
3. יצירת השריטה (יום 2)
   1. בדוק תאים תחת מיקרוסקופ כדי לאמת חד-שכבה של תאים ויכולת קיום של תאים. מקם את צלחת 96 הבארות בכלי לייצור פצעים 96 בארות וצור את השריטה על ידי לחיצה על הידית של המכשיר. יש להסיר בזהירות את מכסה הכלי ליצירת פצעים לפני שחרור הידית למניעת שריטות כפולות.
   2. לשטוף את כל הבארות פעמיים באמצעות 200 μL של EBM לכל באר בתוספת 2% FBS. אשרו תחת מיקרוסקופ שהפסולת הוסרה בהצלחה.
4. גירוי תאים (יום 2)
   1. הוסף 100 μL של פתרונות גירוי או בקרה מוכנים לכל באר.
5. הדמיה (ימים 2-3)
   1. קבל תמונות פעם בשעה לתקופה של עד 24 שעות באמצעות לוח זמנים אוטומטי המסופק על ידי מיקרוסקופ הדמיה של תאים חיים.
      הערה: כדי להבטיח איכות תמונה טובה, סרוק כל באר מיד לאחר העברתה לאינקובטור המאכלס את מערכת ההדמיה של תאים חיים. זמן התאקלמות של 30 דקות באינקובטור עוזר לקבל איכות תמונה טובה יותר. תוכנת המיקרוסקופ מתוכנתת לקבל תמונה אחת בשעה לכל באר בקו האמצע של השריטה המוגדרת.
6. בהיעדר כלי ליצירת פצעים ומכשיר לצילום תאים חיים, בצע את השלבים המתוארים להלן.
   1. השתמשו בקצה פיפטה בצלחת של 24 בארות כדי לגרום לשריטה. צלם תמונות עם מיקרוסקופ תרבית תאים קלאסי במרווחי זמן ספציפיים. לשם כך יש להשתמש במיקרוסקופ ממונע המצויד ביכולות מעקב מדויקות של x ו-y. הדבר מאפשר מיקום אוטומטי, ומבטיח לכידת תמונה עקבית במיקומים מוגדרים מראש.
      הערה: כאשר יש צורך בהדמיה ידנית, זוהי אפשרות מעשית לצלם רק T0 וכן נקודת זמן אחת 'x' שעות לאחר הטיפול. בפרוטוקול המתואר באמצעות HUVECs, נקודת הזמן T12 (12 שעות לאחר הגירוי) הייתה נקודת זמן אטרקטיבית עם הפרדה ברורה בין שליטה חיובית שלילית לבין שליטה חיובית מגורה VEGF. עם זאת, מומלץ לבצע ניסויי קורס זמן ראשוניים עם הדמיה כל שעתיים או שעה כדי לקבוע את נקודת הזמן האופטימלית עבור הגדרות הניסוי הספציפיות בכל מעבדה.
7. ניתוח (יום 3)
   1. תוכנת מיקרוסקופ הדמיה של תאים חיים עשויה לאפשר ניתוח ישיר של התמונות שנרכשו. הגדירו מסכות התוחמות את מדשאות התא, השריטה הראשונית ואזורי צפיפות הפצע היחסית. קבע גבולות תא בהתבסס על הבדלי ניגודיות.
      הערה: התאמת סגמנטציה של 1.6, קובץ חור של 500 מיקרומטר², גודל מותאם של 1 פיקסל, שטח >500 מיקרומטר ואקסצנטריות >0.6 שימשו לניסויים שנערכו עם HUVECs. בדיקה חזותית יסודית של פרמטרי זיהוי התא ביחס לתמונות בפועל היא חיונית. עם תצורות ממוטבות, התוכנה מחשבת צפיפות פצע יחסית (RWD) לאורך זמן באופן אוטומטי ומייצרת גרפים זמניים תואמים עם סטיית התקן (SD) של העותקים הטכניים. לאחר מכן ניתן להשתמש בנתונים אלה לניתוח סטטיסטי.

3. מיצוי RNA עם תאים מתורבתים דו-ממדיים

הערה: בצע את כל השלבים הבאים עד לשלב 3.3 בתנאי עבודה סטריליים (ספסל עבודה סטרילי).

1. ציפוי תאים (יום 1)
   1. נתק HUVECs לפי שלב 1.2 של פרוטוקול תרבית התאים HUVEC.
   2. זרעו 50,000 תאים לבאר בצלחת של 12 בארות עם 2 מ"ל של EGM לכל באר.
   3. שנה את התווך לאחר 6 שעות ל- EBM המכיל 2% FBS (מדיה מורעבת) לרעב בן לילה.
2. טיפול בתאים (יום 2)
   1. סוכני עניין מדוללים ב- EBM בתוספת FBS של 2%. מחליפים את המדיה הרעבה בדילול המוכן ודוגרים על תאים לזמן הרצוי באינקובטור.
3. מיצוי RNA (יום 2-3)
   1. לפרוס את התאים עם 750 μL של Trizol לכל באר לדגור במשך 10 דקות על שייקר מסלולי.
   2. להשעות את הדגימות עם פיפטה 1000 μL כמה פעמים ולאחר מכן לאחסן אותם צינורות RNA ספציפיים קישור נמוך (נפח 1.5 מ"ל). יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C.

4. אימונוציטוכימיה עם תאים מתורבתים דו-ממדיים

הערה: בצע את כל השלבים הבאים עד לשלב 4.4 בתנאי עבודה סטריליים (ספסל עבודה סטרילי).

1. הכנת כיסויים
   1. יש לדגור על 100 כיסויים בקוטר של 12 מ"מ ב-5% אשלגן הידרוקסיד במתנול בצינור של 50 מ"ל למשך 30 דקות תוך כדי ניעור התמיסה המרוחנת.
      הערה: זהו צעד חשוב מאוד בפירוק פני השטח של החלקות הכיסוי ושיפור תנאי הציפוי והתרבות. בשלב זה, מומלץ מאוד לוודא שהכיסויים מפוזרים היטב בתוך המדיום ולא מתייבשים ומודבקים זה לזה.
   2. שטפו את הכיסויים במשך 30 דקות 4 פעמים במים נטולי מינרלים.
   3. לאחר הכביסה, להעביר אותם לתוך פתרון איזופרופיל 70% לאחסון.
2. ציפוי של כיסויים
   1. השענו את הכיסויים בנפרד על דופן צלחת פטרי מרובעת כדי לאפשר אידוי של איזופרופיל אלכוהול.
   2. לאחר 5 דקות מעבירים את הכיסויים לצלחת של 24 בארות (מכסה אחד לכל באר). יש למרוח 1 מ"ל של תמיסה של 10 מ"ג/מ"ל קולגן I ב-PBS על כל באר ולדגור במשך 60 דקות ב-37°C.
   3. לאחר מכן, שטפו את הכיסויים 4-5 פעמים במשך 5 דקות עם PBS.
3. טיפוח תאים
   1. נתק HUVECs בהתאם לנהלים המתוארים בשלב 1.2 של פרוטוקול תרבית התאים HUVEC.
   2. זרעו 50,000 תאים לבאר בצלחת של 24 בארות עם 2 מ"ל של EGM לכל באר.
   3. לאחר 6 שעות, שנו את המדיום ל-EBM המכיל 2% FBS כדי לאפשר לתאים להיצמד לבאר ולהרעיב את התאים למשך הלילה.
   4. למחרת, סוכני עניין מדוללים ב- EBM השלימו 2% FBS. להחליף את תמיסת הרעב בבארות בדילול המוכן ולדגור על תאים לזמן הרצוי באינקובטור.
4. קיבוע וחסימה
   1. לטפח את התאים במשך הזמן הרצוי, ולאחר מכן לשטוף את התאים עם PBS במשך 5 דקות.
   2. תקן את התאים עם 2% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   3. יש לשטוף עם PBS 3-4 פעמים במשך 5 דקות.
   4. דגימות דגירה עם חיץ חוסם המכיל 5% סרום עיזים רגיל (NGS), 0.1% Triton-X-100 ב- PBS למשך שעה אחת ב- RT.
      הערה: בשלב זה, חשוב לשטוף את הדגימות כדי להבטיח ש- PFA יוסר לחלוטין. בחר את המינים של הסרום מבוסס על מקור הנוגדן המשני.
5. צביעה
   1. יש לדגור על הדגימות למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במאגר החוסם עם הנוגדן הראשוני.
   2. למחרת, כדי להסיר כל נוגדן ראשוני לא קשור, לשטוף את הדגימות 3-4 פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד.
   3. לאחר מכן, לדגור על הדגימות במשך שעה אחת ב- RT עם הנוגדן המשני המתאים ו- Phalloidin-FITC, מדוללים יחד במאגר החסימה.
   4. יש לשטוף 3-4 פעמים נוספות.
   5. הפכו את הכיסויים על מגלשות בעזרת טיפה קטנה של אמצעי הרכבה המכילים DAPI, הניחו לייבוש בחושך ואטמו עם לק. יש לאחסן דגימות בחושך בטמפרטורה של 4°C.

5. בדיקת הנבטה ספרואידית

הערה: בדיקת הנבטת הספרואיד דורשת 3 ימים להשלמתה (איור 2). בצע את כל השלבים הבאים עד לשלב 5.7 בתנאי עבודה סטריליים (ספסל עבודה סטרילי).

1. יצירת ספרואידים בטיפות תלויות (יום 1)
   1. נתק HUVECs בהתאם לנהלים המתוארים בשלב 1.2 של פרוטוקול תרבית התאים HUVEC.
   2. שלבו 200,000 תאים עם 8 מ"ל EGM ו-2 מ"ל של תמיסת מלאי מתוקל, מה שמבטיח ערבוב יסודי. יש לעיין בקובץ משלים 1 לקבלת הוראות להכנת תמיסת מלאי המתוקל.
   3. יש לפזר 25 μL טיפות של התמיסה על פני השטח הפנימיים ההפוכים של צלחת פטרי גדולה בריבוע. סובבו בעדינות את המכסה ב-180° ומקמו אותו בתחתית כלי תרבית התא כך שהטיפות תלויות. הניחו את הכלי באינקובטור תרבית תאים למשך הלילה.
2. הכינו את ג'ל הקולגן (יום 2)
   1. יש לערבב היטב 2.3 מ"ל של קולגן זנב חולדה מסוג I עם 0.280 מ"ל של 10x Medium 199 עד לקבלת גוון צהוב אחיד באופן עקבי. שמרו את התערובת על קרח לאורך כל התהליך.
3. טיטרט את ג'ל הקולגן (יום 2)
   1. טיטרט את התערובת כדי להשיג pH פיזיולוגי, מסומן על ידי צבע כתום, באמצעות NaOH (2 N).
   2. הוסף 50 μL של חיץ HEPES למוצר הסופי.
      הערה: כדי להבטיח טווח דינמי אופטימלי לבדיקה, חובה להתקרב ככל האפשר ל- pH פיזיולוגי. אצוות שונות של קולגן עשויות לדרוש כמויות שונות של NaOH. שמרו את התערובת אך ורק על קרח לאורך כל התהליך וערבבו אותה בצורה הומוגנית כל הזמן.
4. קצירת ספרואידים (יום 2)
   1. יש לשטוף טיפות תלויות ממכסי תרביות תאים עם 20 מ"ל PBS.
   2. צנטריפוגה את הפתרון במשך 7 דקות ב 250 x גרם. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הספרואידים ב-0.1 מ"ל של FBS ו-0.4 מ"ל של EGM על ידי הקשה עדינה על הצינור.
   3. מוסיפים 2 מ"ל של תמיסת ציר מתוקל ומערבבים היטב. השתמש פיפטה עם קיבולת מינימלית של 5 מ"ל כדי למנוע נזק spheroids.
5. הוספת ספרואידים למטריצת הקולגן התלת-ממדית (יום 2)
   1. הוסיפו 2 מ"ל מתערובת הקולגן המוכנה לכדורים המרחפים וערבבו היטב.
   2. מוציאים 0.5 מ"ל מהתערובת המתקבלת לבארות של צלחת 24 בארות ודגרים באינקובטור תאים למשך 30 דקות.
6. גירוי ספרואידים במטריצת קולגן תלת-ממדית (יום 2)
   1. הכינו דילול של החומרים הרצויים ב-EBM. עבור כל באר, להשתמש 100 μL של פתרון.
      הערה: EBM משמש כבקרה שלילית, בעוד גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF) ב 25 ng/mL (ריכוז סופי ב 500 μL של מטריצת קולגן ו 100 μL EBM שכבה) יכול לשמש כבקרה חיובית.
   2. לדגור על הזמן הרצוי.
      הערה: בבדיקה סטנדרטית, מומלץ 18-24 שעות, אך יש למטב את התזמון בזהירות בכל מעבדה.
7. הדמיה ספרואידים (יום 3)
   1. השתמש במיקרוסקופ הפוך ובפלטפורמת הדמיה כדי לצלם תמונות של כל הספרואידים שאינם באים במגע עם שפת הבאר, זה עם זה, או מראים סימני נזק. שמור על הגדרות עקביות ורמות זום בכל התנאים.
8. ניתוח (יום 3)
   1. השתמש בכלי המדידה ב- ImageJ Fiji כדי לוודא את אורך כל הנבטים מכל ספרואיד בכל תמונה.
      הערה: השתמש בתוסף המסופק בקובץ משלים 2, שהופך את הניתוח ליעיל יותר ומייצר קובץ .txt פלט.
   2. יבא את הנתונים לגיליון אלקטרוני, R או כל תוכנה מועדפת אחרת, והשתמש באורך המצטבר הממוצע של כל הנבטים לכל ספרואיד כקריאה עבור כל תנאי.
      הערה: לא ניתן לשלב תוצאות מג'לים שונים בצורה של אורכי הנבטה מוחלטים. יש לנרמל נתונים מכל קבוצת טיפול לקבוצת הבקרה EBM או VEGF (אורך הנבטה יחסי) לפני שניתן יהיה למזג נתונים.

6. מיצוי RNA עם תאים מתורבתים 3D

1. בדיקת הנבטה ספרואידית
   1. בצע את בדיקת הנבטת הספרואיד כמתואר בסעיף 5.
2. ליזה של ג'ל קולגן
   1. לשטוף ג'ל spheroid עם PBS חם במשך 5 דקות.
   2. חותכים את ג'ל הספרואיד לרבעים ומעבירים את כל 4 הרבעים לתוך צינור 50 מ"ל. השתמש אזמל עבור דיסקציה מכנית של הג'לים.
   3. יש לטפל בדגימות ג'ל בתמיסת ליזה (המכילה 2 מ"ג/מ"ל Collagenase D ב-PBS) ולדגור במשך 45 דקות ב-37°C על שייקר.
   4. יש לשטוף ג'לים בעדינות עם PBS בתוספת 2 mM EDTA כדי לעצור את התגובה של מאגר הליזיס.
3. מיצוי RNA
   1. יש להשהות מחדש את הג'לים הליזים ב-750 מיקרוליטר של טריזול ולדגור למשך 10 דקות כדי להבטיח מיצוי RNA מספק כמתואר בשלב 3.3.
   2. השהה מחדש את הדגימות עם פיפטה של 1000 μL מספר פעמים והעבר דגימות לצינורות RNA ספציפיים בעלי קישור נמוך (נפח 1.5 מ"ל). יש לאחסן דוגמאות בטמפרטורה של -80°C.

7. אימונוציטוכימיה של ספרואידים במטריצת קולגן תלת ממדית

1. בדיקת הנבטה ספרואידית
   1. בצע את בדיקת הנבטת הספרואיד כמתואר בסעיף 5.
2. קיבוע וחסימה
   1. תקן את הג'לים עם 4% PFA ב- PBS למשך שעה אחת.
      הערה: כדי להבטיח קיבוע טוב של התאים בג'ל, יש לנתק בזהירות את הג'לים בצידי הבארות בעזרת אזמל ופינצטה לאחר שטיפה עם PBS.
   2. לשטוף ג'לים בעדינות 3-4 פעמים עם PBS ולאחר מכן לנתק אותם לחלוטין מפני השטח של הבארות ולהעביר אותם לתוך צלחות חדשות 24 בארות.
   3. דגרו ג'לים במשך שעה אחת ב-RT עם תמיסת החסימה (המכילה 5% NGS ו-0.1% Triton-X-100 ב-PBS) על שייקר מסלולי.
3. צביעה
   1. יש לדגור על הדגימות במשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על שייקר אורביטלי כאשר הנוגדן הראשוני מדולל בחיץ חוסם.
      הערה: סיבוב הג'לים במהלך דגירה זו לא שיפר את איכות הצביעה.
   2. למחרת, שטפו את הג'לים בעדינות 4-5 פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד.
   3. לדגור על הנוגדן המשני המתאים, מדולל עם Phalloidin-FITC בחסימת חיץ לילה ב 4 ° C על שייקר מסלולי.
   4. בצעו 4-5 שלבי כביסה נוספים עם PBS.
   5. העבירו את הג'לים לשקופיות מיקרוסקופ והרכיבו אותם בשתי טיפות של אמצעי הרכבה המכיל DAPI על גבי כיסוי המונח על כל ג'ל. הניחו לדגימות להתייבש לפני האיטום בלק ואחסנו אותן בחושך בטמפרטורה של 4°C.
4. מיקרוסקופ
   1. דמיינו את כל הדגימות במיקרוסקופ קונפוקלי. השתמש במטרה של פי 20 והתמקד באזור העניין. קבל תמונות כערימות Z, כמו גם תמונות בודדות של מישור מוקד.
      הערה: השגת תמונות מחסנית Z ומישור מוקד במקטעים מרובים לאורך הדגימה התלת-ממדית חיונית ללכידת הייצוג המלא, במיוחד עבור דגימות תלת-ממד עבות.

8. תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית האנושית (HRMVECs)

הערה: כל השלבים המתוארים יכולים להתבצע גם עם תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים, למשל, תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית האנושית (HRMVECs). במקרה כזה, יש להחליף את המדיום למדיום ספציפי של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים המכיל 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) לגידול, כמו גם שלבים ספציפיים בכל בדיקה. הבדלים ספציפיים ל- HRMVEC לפרוטוקולי הבדיקה מתוארים להלן:

1. בדיקת פצע שריטה
   1. לטפח תאים בתווך אנדותל מיקרו-וסקולרי 10% FBS במקום EGM.
   2. זרעו 20,000 תאים / באר.
   3. אין להרעיב את התאים בן לילה.
   4. לאחר ביצוע השריטה, שנה את המדיום למדיום תאי אנדותל בסיסיים המכיל 5% FBS במקום EBM עם 2% FBS.
2. אימונוציטוכימיה של HRMVECs מתורבתים דו-ממדיים
   1. טפחו את התאים בתווך של 10% תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במקום ב-EGM.
   2. אין להרעיב את התאים בן לילה.
   3. שנה את המדיום ממש לפני הטיפול ל- EBM + 5% FBS במקום EBM + 2% FBS.
3. בדיקת הנבטה ספרואידית
   1. זרעו את התאים כטיפות תלויות עם תווך תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים המכילים 10% FBS במקום EGM.
4. אימונוציטוכימיה של ספרואידים במטריצת קולגן תלת ממדית
   1. זרעו את התאים כטיפות תלויות עם תווך תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים המכילים 10% FBS במקום EGM.

תוצאות

עבור בדיקת הנדידה, חיוני לבחון ביסודיות את התמונות שצולמו בנקודת הזמן t = 0 h כדי להבטיח שהמערכת תזהה במדויק את נוכחותה של שכבה מונו-שכבתית של תאים במבנה מלא (איור 1B). נוסף על כך, יש לאשר את הבהירות והישירות של גבול הגירוד (איור 1B). האזור נטול התאים צריך להיות ברו...

Discussion

בדו"ח זה, הצגנו ספקטרום של טכניקות עם קריאות פונקציונליות ומולקולריות לחקר אנגיוגנזה במבחנה.

בדיקת ההגירה מייצגת טכניקה מבוססת היטב המשמשת בכל תחומי עבודת המעבדה הרטובה. בחרנו בגישת ההדמיה המסחרית של תאים חיים כדי לנצל את פורמט 96 הבארות המתאים לניסויי סינון ותגובת מ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Medium 199	Sigma-Aldrich	M0650
Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure F(ab)‘2-Fragment	Jackson IR	115-606-072
Axio Vert. A1	Zeiss
CapturePro 2.10.0.1	JENOTIK Optical Systems
Collagen Type 1 rat tail	Corning	354236
Collagenase D	Roche	11088858001
Endothelial Cell Basal Medium	Lonza	CC-3156	EBM
Endothelial Cell Growth Medium	Lonza	CC-3162	EGM
Ethylenediaminetetraacetic acid	Serva	11290.02	EDTA
Fetal bovine serum	Bio&SELL	S 0615	FBS
Human Umbilical Vein Endothelial Cells, pooled	Lonza	C2519A	HUVEC
IncuCyte ImageLock 96-well plates	Sartorius	4379
Incucyte S3 Live-Cell Analysis System	Sartorius
Methocel	Sigma	m-0512
Microvascular Endothelial Cell Medium with 10% FBS	PB-MH-100-4090-GFP	PELOBiotech
NaOH	Carl Roth	P031.2
Phalloidin-Fluorescein Isothiocyanate Labeled (0.5 mg/mL Methanol)	Sigma-Aldrich	P5282-.1MG	Phalloidin-FITC
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientfic	14190-094	PBS
Primary Human Retinal Microvascular Endothelial Cells	Cell Systems	ACBRI 181
ProLong Glass Antifade Mountant with NucBlue	Invitrogen by ThermoFisher Scientific	2260939
QIAzol Lysis Reagent	QIAGEN	79306
recombinant human Vascular Endothelial Growth Factor	PeproTech	100-20	VEGF
Squared petri dish	Greiner	688102
Trizol	Qiagen	79306
Trypsin	PAN-Biotec	P10-024100
VEGF-R2 (monoclonal)	ThermoFisher Scientific Inc.	B.309.4
WoundMaker	Sartorius	4493