ניטור הצטברות ננו-תרופות בגרורות סרטן השד בעכברים

Summary

כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול לאספקה in vivo של ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל מגנטיים הנושאים אוליגומרים של RNA לסרטן שד גרורתי במודלים של בעלי חיים, ומספקים גישה בת קיימא מבחינה קלינית להשתקה טיפולית של חומצות גרעין אונקוגניות.

Abstract

סרטן שד גרורתי הוא מחלה הרסנית עם אפשרויות טיפוליות מוגבלות מאוד, מה שדורש אסטרטגיות טיפוליות חדשות. הוכח כי miRNAs אונקוגניים קשורים לפוטנציאל הגרורתי של סרטן השד ומעורבים בנדידת תאי הגידול, פלישה וכדאיות. עם זאת, זה יכול להיות קשה להעביר מולקולת RNA מעכבת לרקמה המבוקשת. כדי להתגבר על אתגר זה ולספק אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס פעילים לגידולים, השתמשנו בננו-חלקיקי תחמוצת ברזל מגנטית כפלטפורמת אספקה. ננו-חלקיקים אלה מכוונים לרקמות עם חדירות מוגברת של כלי הדם, כגון אתרי דלקת או סרטן. ניתן לנטר את מסירת הננו-חלקיקים הללו in vivo על ידי הדמיית תהודה מגנטית (MRI) בשל תכונותיהם המגנטיות. תרגום הגישה הטיפולית הזו לקליניקה יהיה נגיש יותר בגלל התאמתה לשיטת הדמיה רלוונטית זו. ניתן גם לתייג אותם עם מדווחי הדמיה אחרים כגון צבע אופטי קרוב לאינפרא אדום Cy5.5 להדמיה אופטית מתאמת ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. כאן, אנו מדגימים כי ננו-חלקיקים המסומנים ב-Cy5.5 ומצומדים לאוליגומרים טיפוליים המכוונים ל-miRNA-10b אונקוגני (המכונה MN-anti-miR10b, או "ננו-תרופה") הניתנים תוך ורידי מצטברים באתרים גרורתיים, ופותחים אפשרות להתערבות טיפולית בסרטן שד גרורתי.

Introduction

למרות התקדמות רבה בטיפול בסרטן השד, האפשרויות הקליניות למחלה גרורתית נותרו מוגבלות. חולים מקבלים בדרך כלל טיפולים ממוקדים נגד מניעים שזוהו בגידול הראשוני, כגון אסטרוגן או HER2, אך מניעים אלה לא תמיד נשמרים בגרורות, מה שהופך את הטיפול ללא יעיל¹. טיפולים מערכתיים אחרים, כגון כימותרפיה, אינם ספציפיים וידועים בתופעות הלוואי שלהם. כדי לפתח אפשרויות יעילות לטיפול בסרטן שד גרורתי, חשוב לקחת בחשבון את המניעים הביולוגיים המאפשרים לתאי סרטן להתפשט ולהתיישב באתרים מרוחקים. אחד המניעים הללו הוא miR-10b, מיקרו-RNA אונקוגני, המעורב בכדאיות, פלישה ונדידה של תאי סרטן השד, אשר הוכח כמספיק כדי להעניק פוטנציאל גרורתי בתאי סרטן שד שאינם גרורתיים ^2,3. חשוב לציין, miR-10b מתבטא גם ברמות גבוהות יותר בגרורות בהשוואה לגידולים ראשוניים תואמים⁴, מה שהופך אותו ליעד מבטיח לטיפול בגרורות קיימות.

למרות של-miRNA כגון miR-10b יש פוטנציאל גדול כמטרות טיפוליות למחלות גרורתיות, תכנון שיטות ברות קיימא מבחינה טיפולית להשתקת miRNA מציב אתגרים ייחודיים. אוליגונוקלאוטידים אנטיסנס (ASOs) הקושרים את רצף ה-miRNA המשלים שלהם מועברים בדרך כלל לתאים במבחנה באמצעות ליפופקציה אך אינם יכולים להגיע בקלות לתאי גידול in vivo עקב חוסר יציבות מובנה, סיכון להרס על ידי נוקלאזות, זמן מחצית חיים קצר בדם וחוסר יכולת להיכנס לתאים עקב דחיית מטען-מטען⁵. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, פיתחנו נשא ישים קלינית לביומולקולות באמצעות ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל מגנטית מצופים דקסטרן (MNP)⁶. קבוצות אמינים על הננו-חלקיק מאפשרות צימוד של אוליגונוקלאוטידים, צבעים פלואורסצנטיים (למשל, Cy5.5), וחלקיקי מטרה. בנוסף, ליבת תחמוצת הברזל מאפשרת ניטור in vivo של מסירת הרכב באמצעות הדמיית תהודה מגנטית (MRI). צימדנו את חומצת הגרעין הנעילה נגד miR-10b ASO ו-Cy5.5 ל-MNP כדי ליצור "ננו-תרופה" המכונה MN-anti-miR10b, המתוארת באיור 1⁷.

במחקרים הקודמים שלנו, הראינו כי הננו-תרופה גורמת ביעילות לוויסות נמוך של miR-10b ומעכבת את הנדידה והפלישה של תאי סרטן שד טריפל נגטיב במבחנה⁷. במודלים של עכברים של סרטן שד גרורתי, אספקה תוך ורידית של הננו-תרופה מנעה התפתחות של גרורות בבלוטות הלימפה, או, אם ניתנה לאחר היווצרות גרורות בבלוטות הלימפה, עצרה^את צמיחתן. יש לציין כי הננו-תרופה נצפתה מצטברת בקלות ברקמות סרטניות. בעוד שהננו-תרופה לא חיסלה גרורות בעצמה, במחקרים עוקבים הראינו שטיפול משולב עם דוקסורוביצין אדג'ובנטי היה מרפא הן במודלים של עכברים מדוכאי חיסון והן במודלים של עכברים בעלי יכולת חיסונית ^3,8. ההשפעות של עיכוב miR-10b על ידי הננו-תרופה נצפו גם בקרצינומה של חלב חתולי⁹.

כדי לטפל ביעילות בסרטן השד, חובה להוכיח שהתרופה מצטברת ברקמות מעניינות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדגמת הצטברות של נשא הננו-חלקיקים המגנטי המשמש להעברת ASOs טיפוליים נגד miR-10b לרקמות סרטניות באמצעות שיטות מרובות במודלים של עכברים של סרטן שד גרורתי.

Protocol

הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מישיגן סטייט (IACUC) אישרה את כל ההליכים הקשורים לנבדקים בבעלי חיים. ערכי החישובים מסוכמים בטבלה 1.

1. שלבים עיקריים של סינתזת MN-anti-miR10b

הערה: פרטים על סינתזת MN-anti-miR10b תוארו בעבר ^9,10,11.

1. הכן את ליבת הננו-חלקיקים המגנטיים (MN) בשיטת משקעים משותפים.
2. קישור ואמינט של הננו-חלקיקים המוכנים באמצעות נתרן הידרוקסיד, אפיכלורוהידרין ואמוניום הידרוקסיד.
3. להצמיד אסטר Cy5.5-NHS ל-MN באמצעות הקישור הצולב ההטרובי-פונקציונלי N-succinimidyl 3-[2-pyridyldithio]-propionate (SPDP) כדי להשיג MN-Cy5.5 כדי לאפשר הדמיה פלואורסצנטית ומיקרוסקופיה.
4. הפעל חומצת גרעין נעולה anti-miR-10b עם 3% tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) ומצומד ל-MN-Cy5.5 כדי להניב את ה-MN-anti-miR10b.
5. לבצע אפיון של המצומד לקביעת תכולת הברזל (על ידי בדיקת ברזל), מספר מולקולות Cy5.5 לננו-חלקיק (על ידי ספקטרופוטומטריה) וכמות ה-LNA המצומד (על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז).

2. לרכוש חיות מחקר

1. תארו מראש את המחקר כדי לתכנן את קבוצות הניסוי ואת מספר בעלי החיים בכל קבוצה. מאכלסים עד 5 עכברים לכלוב. אם משתמשים במספר כלובים של 5 עכברים במהלך הטיפול, הקפד להחזיק עכברי ביקורת וניסוי בתוך כל כלוב כדי להסיר את הכלוב כמשתנה מבלבל.
2. השג עכברים בגיל 6-7 שבועות. אפשר לפחות שבוע אחד של הסתגלות לתנאי הדיור לפני השראת גידולים אורתוטופיים.
   הערה: נהלים המשתמשים במודל MDA-MB-231 (קו תאים שמקורו באדם) של גרורות ספונטניות בסרטן השד מתוארים להלן. עבור דגם זה, עכברים עירומים אתימיים (Foxn1^nu/Foxn1^nu) נמצאים בשימוש נפוץ. ניתן להשתמש בזני עכברים מדוכאי חיסון תואמים אחרים, וההליכים ישימים גם למודלים של אלוגרפט בעכברים בעלי יכולת חיסונית (למשל, תאי סרטן שד 4T1 בעכברי BALB/c).

3. תאי תרבות

1. הוסיפו את מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (מדיום גידול מלא) לגידול תאי MDA-MB-231 המבטאים לוציפראז (למשל, MDA-MB-231-luc-D3H2LN). לגדל את התאים בתנאים אספטיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%_CO2 ו-95% לחות, בדרך כלל בבקבוק T75. אם קפואים, יש להפשיר תאים ומעבר לפחות פעם אחת לפני השתלת הגידול. רשום את מספר המעבר על הבקבוק.
   הערה: במחקר זה, בקבוקון שהוקפא בעבר של 1 ×-^10-6 תאים הופשר והועבר פעמיים לפני השימוש.
   1. כדי לעבור, יש למרוח 0.25% טריפסין למשך 3 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לנסח תאים במפגש של <80%. הוסף פי 4 נפח של מצע גידול מלא כדי לנטרל את הטריפסין.
   2. צנטריפוגה את המתלה בטמפרטורה של 200 × גרם למשך 5 דקות בצינור חרוטי. השעו מחדש את כדור התא ב-5 מ"ל של מצע גידול מלא לאחר סילוק הסופרנטנט. בחר חלק מהתאים לבקבוק חדש והוסף מצע גידול שלם נוסף על סמך נפח הבקבוק החדש. עדכן את מספר המעבר על הבקבוק החדש.
2. להפשיר תאים חדשים לאחר 10 מעברים כדי למזער את הסחיפה הגנטית בין מחקרים.

4. הכנת תאים לאינדוקציה של גידולים אורתוטופיים

1. יש להניח את המטריג'ל הקפוא (תמצית מטריצת קרום הבסיס) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפני ההכנה כדי לאפשר לתמצית המטריצה להתנזל.
2. קבע את הריכוז והנפח של התאים הדרושים למחקר. השתל את העכברים עם 1 × 10⁶ תאים לעכבר בנפח של 50 מיקרוליטר, המורכב מחלק אחד של PBS צונן וחלק אחד מתמצית המטריצה.
3. גלולה את התאים הטריפסינים כמתואר בשלב 3.1.2. השעו מחדש את גלולת התא בלפחות 10 מ"ל של PBS כדי לשטוף את התאים, ואז צנטריפוגה פעם נוספת בטמפרטורה של 200 × גרם למשך 5 דקות. השעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של PBS מקורר (מלאי תאים).
4. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. מכיוון שהתאים יהיו בריכוז גבוה, יש לדלל כמות קטנה (למשל, 10 מיקרוליטר) לפי הצורך, תוך מעקב אחר גורם הדילול עד שניתן יהיה לבצע מדידות מדויקות.
5. יש לדלל את מספר התאים הכולל הנדרש ל-40 ×-10⁶ תאים/מ"ל, ולאחר מכן להוסיף נפח שווה של תמצית המטריצה המצוננת כדי להשיג ריכוז סופי של 1 ×-10-6 תאים לכל 50 מיקרוליטר.
   הערה: ריכוזי התאים מסוכמים בטבלה 1.

5. אינדוקציה של גידולים אורתוטופיים

1. להרדים עכבר באמצעות איזופלורן 2% ולאחר מכן להעביר אותו לקונוס אף, תוך שמירה על מישור ההרדמה הכירורגי באמצעות 0-3% איזופלורן על כרית חימום. אשר את מישור ההרדמה הכירורגי על ידי היעדר רפלקס בקרנית ו/או תגובת צביטה בבוהן. הגן מפני ייבוש הקרנית על ידי מריחת משחת עיניים על העיניים.
2. נקו את העור ליד מקום ההזרקה עם מגבון 70% אלכוהול והניחו מספר שניות לייבוש האלכוהול. לגרום בבלוטת החלב #4 כדי להפחית את הסיכון לחפיפה של אותות הדמיה ביולומינסנציה בין הגידול הראשוני לאתרים הנפוצים ביותר של גרורות (בלוטת לימפה ריאתית ובית השחי).
   הערה: מספור בלוטות החלב תואר בעבר¹². בקצרה, לעכבר במצב שכיבה עם ראש מופנה כלפי מעלה יהיו בלוטות 1 עד 5 בצד ימין של המזרק (שמאל העכבר) החל מהקרוב ביותר לראש (צוואר הרחם - בלוטה 1) ויורד לזנב ביותר (מפשעתי - בלוטה 5). בלוטות 6 עד 10 מכוונות באופן דומה בצד הנגדי של החיה.
3. העבר את מלאי התאים למעלה ולמטה כדי להשעות מחדש את התאים. משוך 50 מיקרוליטר מתרחיף התאים הקרים כקרח למזרק אינסולין עם מחט 29 גרם והזריק את התאים מיד. שמור את המזרק על קרח אם אינך מסוגל להזריק מיד.
   הערה: צנרת למעלה ולמטה בין כל משיכת תאים כדי למנוע מהתאים להתייצב.
4. הכנס את השיפוע ישירות מתחת לפטמה של בלוטת החלב הרצויה במקביל לגוף העכבר באותו מיקום והזריק את התאים בקצב קבוע ואיטי. יש להשאיר את המחט בתוך העור למשך 5 שניות לפחות לאחר סיום ההזרקה כדי לאפשר למטריג'ל להתמצק ולמנוע דליפה.
5. העבר את העכבר לכלוב נקי על כרית חימום להתאוששות והשגיח עד שהוא אמבולטורי לחלוטין ומסוגל לשמור על שכיבה עצם החזה. אל תשאיר את העכבר ללא השגחה. החזירו את העכבר לכלוב שלו עם עכברים אחרים רק לאחר שהתאושש.

6. מעקב אחר צמיחת גידול והתפתחות גרורות באמצעות הדמיה ביולומינסנציה (BLI)

הערה: מכיוון שתאי MDA-MB-231 המשמשים כאן מבטאים לוציפראז, הזרקת מצע לוציפרין לעכברים תייצר אות אופטי שזוהה על ידי סורק מערכת ההדמיה. במודל זה, ניתן לצפות לגרורות 5-7 שבועות לאחר השראת הגידול. מומלץ לדמות עכברים 1-3 פעמים בשבוע, תלוי בחשיבות זיהוי הרגע המדויק בו נראים גרורות.

1. להרדים את העכברים באמצעות איזופלורן 2% כדי למזער את הסיכון לפגיעה בעכבר בעת מתן לוציפרין. הגן מפני ייבוש הקרנית על ידי מריחת משחת עיניים על העיניים.
2. להזריק 150 מ"ג/ק"ג משקל גוף של לוציפרין תוך צפקית לכל עכבר ולהחזיר את העכברים לכלוב שלהם על משטח חימום כדי לאפשר לעכברים להתעורר ולחילוף חומרים של לוציפרין. יש להשגיח ואל תשאיר עכברים ללא השגחה עד שהם אמבולטוריים לחלוטין ומסוגלים לשמור על שכיבה על עצם החזה.
   הערה: הערכים המשמשים לחישובי מינון מסוכמים בטבלה 1.
3. דמו את העכברים באמצעות סורק מערכת ההדמיה החל מ-10 דקות לאחר ההזרקה עם לוציפרין, והרדימו מחדש את העכברים בעת הצורך כדי לאפשר זמן להעברה ל-IVIS.
   1. צלמו עד 5 עכברים יחד במצב שכיבה, תוך הקפדה על כך שכל גופם כלול בסימוני ההנחיה של שדה הראייה ומכוון ישר ככל האפשר. השתמש בסרט שקוף כדי לאבטח את זרועותיהם להדמיה טובה יותר של בלוטות הלימפה בבית השחי. אם אתה מצלם כמה עכברים בבת אחת, השתמש במפרידי סעפת כדי להפריד בין העכברים כדי למנוע מהאותות להקרין על עכברים אחרים. אם אין חוצצים זמינים, השתמש ברצועות נייר סופגות אור במקומם (למשל, קרטון שחור עבה).
      הערה: שיעורי חילוף החומרים של לוציפרין משתנים בין דגמי עכבר וקו תאים, ורכישת תמונה החל מ-10 דקות לאחר ההזרקה עשויה שלא להניב את האות החזק ביותר. מומלץ, בתחילת מחקר חדש, לבצע רכישות בנקודות זמן שונות כדי לקבוע את התזמון לשיא עוצמת האות.
   2. הכן את תוכנת מערכת ההדמיה לקליטת תמונות עם ההגדרות הבאות עבור BLI: חשיפה = אוטומטי, Binning = בינוני, FStop = 1, עירור = בלוק, פליטה = פתוח, FOV = D, גובה = 1.50.
   3. בדרך כלל, אותות גידול ראשוניים יפיקו אות חזק יחסית בשל מיקומם השטחי באמצעות ההגדרה חשיפה = אוטומטי. אם ניטור אחר גרורות, השתמש בסרט חשמלי שחור כדי לכסות בזהירות את הגידול הראשוני והגדר ידנית חשיפה = 300 שניות (או יותר) כדי להשיג אותות חלשים אם קיימים.
      הערה: במודל זה, אות נפרד מהגידול הראשוני הנראה לאורך מספר מפגשי הדמיה כאשר הסף התחתון מוגדר כקרינה של 5 × 10³ נחשב למעיד על גרורות.

7. כריתה של גידולים ראשוניים

הערה: כריתה של גידולים ראשוניים חשובה למחקרים אורכיים (למשל, טיפוליים) בגרורות; אחרת, עכברים עלולים להיכנע לתחלואה הקשורה לצמיחה ראשונית בלתי מוגבלת של הגידול. קחו בחשבון את גודל הגידול הראשוני (סיכון לאובדן דם בכריתה) וכיב (סיכון לזיהום) בעת קביעת זמן הכריתה.

1. אם שוקלים היעדר אות BLI לבדיקת כריתה ראשונית מוצלחת של הגידול, בצע הדמיה לפני הניתוח כמתואר בסעיף 6 וודא שאין אות לאחר הניתוח. יש לאשר כריתה מוצלחת תוך 1-2 ימים באמצעות לוציפרין טרי.
   הערה: מתן חוזר מיידי של לוציפרין אינו מומלץ כדי למנוע לחץ מיותר על בעל החיים. לוציפרין המוזרק לפני כריתה ראשונית של הגידול אמור להספיק כדי לזהות את האות אם הכריתה לא הושלמה.
2. להרדים את העכבר באמצעות איזופלורן 2% ולאחר מכן להעביר אותו לקונוס אף, תוך שמירה על מישור ההרדמה הכירורגי באמצעות 0-3% איזופלורן על כרית חימום. אשר את מישור ההרדמה הכירורגי על ידי היעדר רפלקס בקרנית ו/או תגובת צביטה בבוהן.
3. הגן מפני התייבשות הקרנית על ידי מריחת משחת עיניים על העיניים
4. יש להזריק 5 מ"ג/ק"ג קטופרופן תת עורי כמשכך כאבים להליך.
   הערה: הערכים המשמשים לחישובי מינון מסוכמים בטבלה 1.
5. הכן את אזור הניתוח על ידי קרצוף לסירוגין של 70% אלכוהול ובטדין 3x. הניחו לפילינג הבטדין הסופי להתייבש לפני שתמשיכו.
6. השתמש במספריים כירורגיים סטריליים כדי לפתוח את העור מעל הגידול הראשוני בצורה אנכית (רוסטרל-זנב). במקרה של עור כיב, התחל להיפתח לצד הכיב כדי למנוע השארת הגידול הראשוני מאחור וכדי להסיר לחלוטין את העור הכיבי.
7. המשך להשתמש במספריים ובמלקחיים כדי לנתח בזהירות את רקמת החיבור סביב הגידול העטוף כדי להסיר לחלוטין את המסה מהעור, כמו גם את רקמות הגוף הבסיסיות מכיוון שכל גידול שנותר עלול לצמוח מחדש.
8. אם קיים, שלוט בדימום על ידי הפעלת לחץ עם אפליקטור עם קצה כותנה.
9. סגור את פתח הניתוח עם תפר ויקריל 5-0.
   הערה: תפירה מופרעת עלולה לגרום לסבלנות טובה יותר של הפצע מכיוון שעכברים נוטים להטריד את אתר הניתוח.
10. אפשר לבעל החיים להתאושש בכלוב נקי על כרית חימום עד לכניסה אמבולטורית מלאה. הניחו מזון לח בתחתית הכלוב הביתי בעת החזרת החיה לכלוב.
11. יש להזריק 5 מ"ג/ק"ג קטופרופן תת עורי פעם ביום למשך יומיים לפחות לאחר הניתוח. בדוק את בריאות הפצע בזמנים אלה.

8. אספקת ננו-תרופה

1. שקלו את העכברים שכן מינון הננו-תרופות מבוסס על משקל הגוף.
2. להרדים את העכבר באמצעות איזופלורן 2% ולאחר מכן להעביר אותו לקונוס אף, תוך שמירה על מישור ההרדמה הכירורגי באמצעות 0-3% איזופלורן על כרית חימום. אשר את מישור ההרדמה הכירורגי על ידי היעדר רפלקס בקרנית ו/או תגובת צביטה בבוהן.
   הערה: לחלופין, ניתן לתת את הננו-תרופה לעכבר ער מרוסן. כל השלבים הבאים יהיו זהים.
3. הכן מזרק אינסולין עם מחט 29 גרם עם 10 מ"ג ננו-תרופות Fe/ק"ג משקל גוף עכבר.
4. טבלו את זנב החיה במים חמים (30-35 מעלות צלזיוס) למשך 30 שניות כדי להרחיב את ורידי הזנב.
5. נגב עודפי מים מהזנב ונקה את מקום ההזרקה עם מגבון אלכוהול 70%.
6. הכנס את שיפוע המחט לווריד הזנב הצדדי בערך באמצע הזנב ומשוך מעט את הבוכנה לאחור כדי לאשר את המיקום עם פלאשבק של דם לתוך המחט. במידת הצורך, הזיזו את המחט מעט קדימה או לעומק שטחי יותר כדי להשיג מיקום מוצלח.
7. לאחר החדרה מוצלחת, יש להזריק את הננו-תרופה בהתמדה בקצב איטי של כ-5-10 שניות להזרקה של 40 מיקרוליטר. ודא הזרקה מוצלחת על ידי היעדר איגום תמיסה מתחת לעור הזנב ליד מקום ההזרקה ועל ידי כהות הווריד (מתמיסת הננו-חלקיקים הכהים).
   הערה: הערכים המשמשים לחישובי מינון מסוכמים בטבלה 1. ניסוחים של ננו-חלקיקים גושים עשויים להצטבר לריאה. אם נצפתה מצוקה נשימתית זמן קצר לאחר ההזרקה, בצע בעדינות לחיצות חזה על העכבר. פעולה מיידית תמיד מביאה להחלמה מוצלחת של החיה מבעיה אפשרית זו.
8. החזק לחץ על מקום ההזרקה עם גזה והסר את המחט, תוך שמירה על לחץ למשך כ-30 שניות עד להפסקת הדימום.
9. אפשר לבעל החיים להתאושש בכלוב נקי על כרית חימום עד לכניסה אמבולטורית מלאה.

9. איסוף גרורות לניתוח

1. דמיינו את העכברים על ידי BLI כמתואר בסעיף 6.
   הערה: במחקר זה, 5 × 10³ זוהר נחשב כאינדיקציה לגרורות ונצפה בדרך כלל לאחר 5-7 שבועות. יש לצפות לשונות קלה בזמן עד לגרורות בין עכברים.
2. מיד לאחר ההדמיה, הקריבו את העכברים על ידי פריקת צוואר הרחם תחת איזופלורן כבד (5%). לפני הדיסקציה, אשר את המוות על ידי היעדר רפלקס בקרנית ו/או תגובת צביטה בבוהן.
3. אסוף בזהירות את הגרורות. גרורות בבלוטות הלימפה מופיעות כמסה מוגדלת ועטופה. גרורות ריאה יתפזרו בדרך כלל בכל פרנכימת הריאה; לפיכך, אסוף את כל הריאה.
4. הניחו את הרקמות שנאספו בצלחת פטרי ודמו באמצעות מערכת ההדמיה כדי לאשר ביולומינסנציה (המצביעה על נוכחות של תאים סרטניים המבטאים לוציפראז) ופלואורסצנטיות (המצביעה על הצטברות ננו-תרופות). השתמש באותן הגדרות רכישת BLI כמתואר בשלב 6.3.2. הגדרות רכישת FLI הן חשיפה = אוטומטי, Binning = בינוני, FStop = 1, עירור = 675 ופליטה = 720 (תוכנית ברירת מחדל עבור צבע Cy5.5), רמת מנורה = גבוהה, FOV = D, גובה 1.50. דמיין את פגר העכבר כדי לקבוע אם נותרה רקמה סרטנית שכדאי לאסוף.
5. שטפו את רקמות הסרטן ב-PBS.
6. לאיסוף רקמות למיקרוסקופיה או qRT-PCR, יש להטמיע ב-OCT ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד שמוכן לעיבוד.
7. כדי לאסוף רקמות לספקטרוסקופיה של פליטה אופטית של פלזמה בצימוד אינדוקטיבי (ICP-OES), יש למשוך משקל באמצעות צינור ריק של 1.7 מ"ל, להניח את הרקמה בצינור ולרשום את משקלה. מקפיאים את הרקמה ומאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד שהיא מוכנה לעיבוד.

10. אימות אספקת ננו-תרופות על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית

1. חתך בהקפאה את הדגימות הקפואות הטריות המוטמעות ב-OCT על מיקרוסקופיה בעובי של 10 מיקרומטר. התאם את טמפרטורות החדר ומחזיק הדגימה בהתאם לסוג הרקמה. הגדרות בין -20 מעלות צלזיוס ל-15 מעלות צלזיוס מתאימות הן לרקמת הריאה והן לרקמת הלימפה.
2. קבע את חלקי הרקמה על שקופיות על ידי טבילת החלקים או השקופיות השלמות בתמיסת פרפורמלדהיד 4% למשך 15 דקות. יש לשטוף בזהירות עם PBS.
3. הרכיבו כיסויים על המגלשות. השתמש במדיום עם 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) להדמיה של ארכיטקטורת רקמות.
4. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבחון קטעים עבור Cy5.5 (עירור 683 ננומטר/פליטה 703 ננומטר), המעידים על העברת ננו-תרופות. ודא שהאות אינו רקע באמצעות דגימת בקרה שלילית (רקמה מבעל חיים שלא הוזרק).

11. אימות אספקת ננו-תרופות על ידי ספקטרוסקופיה של פליטה אופטית של פלזמה בצימוד אינדוקטיבי (ICP-OES)

1. מעבירים את הדגימות המאוחסנות ב-80 מעלות צלזיוס לצינור חרוטי של 15 מ"ל ומדגרים אותו בתנור כשהמכסה מוסר ב-37 מעלות צלזיוס לייבוש.
   הערה: תהליך זה ארך 24 שעות עבור דגימות גרורות MDA-MB-231 אך עשוי להימשך מספר ימים בהתאם לגודל ותכולת הלחות של הדגימה.
2. רשום את המשקל היבש באמצעות איזון.
3. הוסף 2 מ"ל של 70% עקבות HNO₃ לכלי ולעכל את הדגימה במיקרוגל. הפרמטרים המשמשים במחקר זה הם כדלקמן: הספק = 1030 - 1800 וואט, זמן רמפה = 20:00 - 25:00, זמן החזקה = 15:00, טמפרטורה = 200 מעלות צלזיוס, קירור = 30 דקות.
   זהירות: היזהר בעבודה עם חומצה חנקתית מכיוון שהיא והאדים הנוצרים בעת חימום שלה הם קורוזיביים מאוד. יש להשלים את העבודה בחלל מאוורר היטב עם ציוד מגן אישי מלא, כגון מעיל מעבדה, משקפי מגן/מגן פנים וכפפות התואמות לעבודת חומצה. הנפחים הקטנים והקירור הממושך המשמש כאן ממזערים מעט את הסיכון, אך תמיד יש לנקוט בזהירות.
4. מעבירים את הדגימות המעוכלות לצינורות חרוטיים נטולי מתכת; לאחר מכן, העבירו 300 מיקרוליטר לצינור חדש. יש לדלל ל-10 מ"ל באמצעות 9.7 מ"ל של מים טהורים במיוחד, וכתוצאה מכך ריכוז HNO₃ של 3% (v/v).
5. הכן תקני Fe של אלמנט בודד בריכוזים של 1000, 100, 10, 1, 0.1 ו-0 מיקרוגרם Fe/mL ב-3% HNO₃ (v/v) ומים טהורים במיוחד. הכן תקן פנימי של אלמנט Y בודד בריכוז של 1 מיקרוגרם/מ"ל ב-3% HNO₃ (v/v) במים טהורים במיוחד.
6. לנתח דגימות באמצעות ICP-OES. למצבים ציריים ורדיאליים, בחרו בקווי הפליטה הבאים לניתוח תכולת הברזל. Fe (234.350 ננומטר), Fe (238.204 ננומטר), Fe (259.940 ננומטר) ו-Y (371.029 ננומטר) המשמשים לסטנדרטיזציה פנימית.
7. נרמל את התוצאות לכמות הדגימה המשמשת לקלט לחישוב מיקרוגרם של Fe/g של רקמה.

תוצאות

במחקרים הטיפוליים הקודמים שלנו, טיפלנו בעכברים במינון אחד של ננו-תרופה (10 מ"ג ננו-תרופה Fe לק"ג משקל גוף עכבר) מדי שבוע במשך מספר שבועות ^3,7,8. לצורך הדגמה זו, ביקשנו לקבוע אם ניתן להבחין בהצטברות של ננו-תרופה בגרורות ריא...

Discussion

לננו-חלקיקים יש פוטנציאל גדול לטיפול בסרטן. כאן, הראינו שנשא MNP מצומד Cy5.5 יכול להגיע לרקמות סרטניות כדי לספק אוליגונוקלאוטידים טיפוליים במודל עכברי של סרטן שד גרורתי. היכולת לתת את הננו-תרופה באופן מערכתי תוך השגת הצטברות ניכרת ברקמות סרטניות מציעה יתרונות עצומים על פני ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 5800 ICP-OES	Agilent	5800 ICP-OES	For ICP-OES
Ammonium hydroxide	Thermo Fisher Scientific Inc	458680025	For nanodrug synthesis
Athymic nude "J:NU" mice	Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:007850	Immunocompromised mouse model
Betadine Surgical Scrub	Purdue	6761815101	For tumor resection
Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991	For tumor resection
Crile Hemostats - Straight	F.S.T.	13004-14	For tumor resection
Cy5.5-NHS ester	Abcam	ab146455	For nanodrug synthesis
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	For cell culture of MDA-MB-231
Eclipse 50i Clinical Microscope	Nikon	50i-B	For imaging of cryosections
Epichlorohydrin	Thermo Fisher Scientific Inc	117780250	For nanodrug synthesis
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T.	11150-10	For tumor resection and metastasis dissection
Fe standard	Inorganic Ventures	CGFE1-500ML	For ICP-OES
Fetal bovine serum	Corning	35-010-CV	For cell culture of MDA-MB-231
Fine Scissors - Sharp 10.5cm	F.S.T.	14060-10	For tumor resection and metastasis dissection
Flask (T-75)	Corning	430641U	For cell culture of MDA-MB-231
HNO3 nitric acid (70%, trace metal grade)	Fisher Chemical	A509P212	For ICP-OES
Insulin syringe 1 CC 29 G x 1/2"	Becton, Dickinson	324704	For tumor implant
Isoflurane	Covetrus	11695067772	For mouse anesthetization
Isoflurane vaporizer	SOMNI Scientific	VS6002	For mouse anesthetization
Isopropyl alcohol (70%) wipe	Cardinal	MW-APL	For tumor resection
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System	PerkinElmer/Revvity	128201	For bioluminescence imaging
IVISbrite D-Luciferin Potassium Salt	PerkinElmer/Revvity	122799-100MG	For bioluminescence imaging
Ketofen (ketoprofen)	Zoetis	10004031	For tumor resection
Leica CM1950	Leica	CM1950	For cryosectioning of OCT-embedded samples
MARS 6 microwave digestion system	CEM	MARS 6	For ICP-OES
Matrigel, growth factor-reduced	Corning	354230	For tumor implant of MDA-MB-231
MDA-MB-231-luc-D3H2LN	PerkinElmer/Revvity	119369	For mouse model of spontaneous metastasis
Metal-free polypropylene 15 mL conical tubes	Labcon	31343450019	For ICP-OES
Microcentrifuge tube (1.7 mL)	DOT Scientific	RN1700-GMT	For metastasis sample collection
N-succinimidyl 3-[2-pyridyldithio]-propionate (SPDP)	Thermo Fisher Scientific Inc	21857	For nanodrug synthesis
PBS	Gibco	14190-144	For cell culture and tumor implant of MDA-MB-231
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122	For cell culture of MDA-MB-231
Puralube vet ointment	MWI Veterinary	27505	For tumor resection
Sodium hydroxide	Thermo Fisher Scientific Inc	3728-70	For nanodrug synthesis
Tissue-Tek Cryomold Intermediate 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566	For metastasis sample collection
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	For metastasis sample collection
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Thermo Fisher Scientific Inc	T2556	For nanodrug synthesis
Trypsin, 0.25%	Gibco	25200-056	For cell culture of MDA-MB-231
Vicryl PLUS (Antibacterial) violet 27" RB-1 taper	Ethicon	VCP303H	For tumor resection