הרכבת אורגנואידים ברשתית עם מיקרוגליה

Summary

תאי מיקרוגליה הם תאי חיסון ייחודיים השוכנים ברשתית, וממלאים תפקידים מכריעים במחלות ניווניות שונות ברשתית. יצירת מודל תרבית משותפת של אורגנואידים ברשתית עם מיקרוגליה יכולה להקל על הבנה טובה יותר של הפתוגנזה והתקדמות הפיתוח של מחלות רשתית.

Abstract

בשל הנגישות המוגבלת של הרשתית האנושית, אורגנואידים ברשתית (ROs) הם המודל הטוב ביותר לחקר מחלת רשתית אנושית, אשר יכול לחשוף את מנגנון התפתחות הרשתית ואת התרחשות מחלת הרשתית. מיקרוגליה (MG) הם מקרופאגים ייחודיים ברשתית ובמערכת העצבים המרכזית (CNS), המשרתים תפקודי חסינות חיוניים. עם זאת, אורגנואידים ברשתית חסרים מיקרוגליה מכיוון שמקור ההתמיינות שלהם הוא שק החלמון. הפתוגנזה הספציפית של תאי מיקרוגליה במחלות רשתית אלה נותרה לא ברורה; לכן, הקמת מודל אורגנואיד רשתית משולב מיקרוגליה מתברר כהכרחי. כאן, בנינו בהצלחה מודל בתרבית משותפת של אורגנואידים ברשתית עם מיקרוגליה שמקורם בתאי גזע אנושיים. במאמר זה הבחנו בין תאי מיקרוגליה ולאחר מכן תרבית משותפת לאורגנואידים ברשתית בשלב המוקדם. כשילוב של תאים חיסוניים, מודל זה מספק פלטפורמה אופטימלית למידול מחלות רשתית וסינון תרופות כדי להקל על מחקר מעמיק על הפתוגנזה והטיפול במחלות הקשורות לרשתית ולמערכת העצבים המרכזית.

Introduction

כמקור המוגבל של הרשתית האנושית, התמיינות תאי גזע אנושיים לאורגנואידים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) ברשתית מייצגת מודל מבטיח במבחנה להדמיית הרשתית¹. הוא מכיל סוגי תאים שונים ברשתית, כולל פוטורצפטורים, תאי גנגליון ברשתית, תאים דו-קוטביים, תאי מולר, תאים אופקיים ואסטרוציטים². מודל זה מאפשר אמולציה ולימוד הן של מנגנוני התפתחות הרשתית והן של הפתוגנזה של מחלות רשתית. עם זאת, בשל שיטת ההתמיינות הכיוונית, אורגנואידים ברשתית נגזרו מהנוירואקטודרם³, חסרים סוגי תאים רבים אחרים שמקורם בשכבות נבט שונות, כגון מיקרוגליה משק החלמון ותאים פריווסקולריים מהמזודרם ^4,5,6.

כיום, מחלות רשתית רבות, כגון רטיניטיס פיגמנטוזה⁷, גלאוקומה⁸ ורטינובלסטומה⁹, הוכחו כקשורות קשר הדוק למיקרוגליה בתוך הרשתית. עם זאת, בשל היעדר מודלים מחקריים מתאימים, מנגנונים ספציפיים הממחישים את הקשר בין מיקרוגליה למחלות אלה עדיין אינם ברורים. בעוד עכברים שימשו מודל חיובי לחקר מחלות רשתית, מחקרים אחרונים הדגישו הבדלים משמעותיים בין תאי מיקרוגליה בעכבר ובתאי מיקרוגליה אנושיים במונחים של תוחלת חיים, קצב התפשטות והיעדר גנים הומולוגיים אנושיים^10,11. ממצאים אלה הצביעו על כך שמסקנות שהוסקו ממודלים של עכברים עשויות להיות לא אמינות לחלוטין, והדגישו את החשיבות של בניית אורגנואידים ברשתית אנושית המכילים מיקרוגליה.

במהלך העשורים האחרונים פותחו שיטות שונות להתמיינות תלת ממדית של אורגנואידים ברשתית^12,13. כדי להקל על פעולת התרבית המשותפת של תאי מיקרוגליה בתוך אורגנואידים ברשתית, בחרנו שיטת בידול הכוללת מעבר מתרבית דבק לתרבית תרחיף. גישה זו מאפשרת לשלב תאי מיקרוגליה באורגנואידים ברשתית, ולשמור עליהם למשך 60 יום לפחות¹⁴.

Protocol

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית של בית החולים טונגרן בבייג'ינג, האוניברסיטה הרפואית קפיטל. קו תאי HESCs H9 היה ממכון המחקר WiCell. חממו מראש את מדיום תרבית התאים בטמפרטורת החדר (RT) במשך 30 דקות לפני הניסוי.

1. דור של מיקרוגליה אנושית

1. תרבית את תאי גזע עוברי גזע עובריים בתווך תאי גזע עד שצפיפות התאים מגיעה ל-80%-90%. זרעו לפחות 1 x 10⁶ תאים בכל באר.
2. שאפו את מדיום תאי הגזע ושטפו את התאים עם 1x DPBS (1 מ"ל / באר של 6 צלחת באר). השלב הבא דורש 2 x 10^7-1 x 10⁸ תאים. אם לא מספיק, לשלב תאים של 2-5 בארות לעשות את השלבים הבאים.
3. נתק את מושבות תאי הגזע באמצעות תמיסת EDTA של 0.5 mM למשך כ -5 דקות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס (1 מ"ל / באר של צלחת 6 באר).
4. בדוק מורפולוגיה של המושבה לאחר 5 דקות. כאשר קצוות המושבה מכורבלים מעט עם רווחים רופפים, התאים מוכנים להתמיין ולשאוף את ה- EDTA. אם לא, לדגור על תאים ב 37 ° C במשך 1-2 דקות נוספות. אין לדגור יותר מ-8 דקות.
5. שטפו בעדינות את התאים בכל באר באמצעות 6 מ"ל של Medium A (טבלה 1) עם 6 μL של 10 mM ROCK inhibitor Y-27632 solution. טפחו בעדינות על תחתית הכלי כדי לסייע בשטיפת התאים. הגדר את היום כיום 0.
   הערה: אין לקשט את התאים. תאים ייצרו גופים עובריים (EBs) למחרת.
6. לאחר 24 שעות, התבוננו בתאים מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר את היווצרות EB. אסוף את ה- EBs לתוך צינור צנטריפוגלי של 15 מ"ל עם צינור של 10 מ"ל והמתן עד שה- EBs ישקעו לתחתית תוך 5 דקות.
7. שאפו בזהירות את הסופרנאטנט והשעו מחדש את ה-EBs עם 6 מ"ל של מדיום A טרי והעבירו אותם לבאר חדשה בעלת הדבקה נמוכה של צלחת 6 בארות. תרבות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: מטרת העברת הבאר ביום הראשון היא להפחית את ההשפעה של מספר רב של תאים מתים במהלך תהליך היווצרות EB, אשר עשוי להשפיע על מצב צמיחת התאים.
8. רעננו את מדיום A הטרי מדי יום עד יום 4 (6 מ"ל/באר של צלחת 6 בארות).
9. ביום 4, מצפים צלחת 10 ס"מ עם 3 מ"ל של 0.1% תמיסת ג'לטין דגים לפחות 1 שעה באינקובטור 5% CO₂, 37 ° C.
   הערה: אם זמן הציפוי הוא פחות משעה אחת, קשה לבצע את השלבים הבאים.
10. בזהירות לאסוף את EBs לתוך צינור צנטריפוגלי 15 מ"ל עם צינור 10 מ"ל ולחכות EBs לשקוע לתחתית בתוך 5 דקות.
11. הסר את תמיסת הג'לטין 0.1% ושטוף את הכלי בגודל 10 ס"מ פעם אחת עם 5-6 מ"ל של DPBS 1x. הסר את DPBS.
12. השהה מחדש בעדינות את ה- EBs עם 15 מ"ל של Medium B (טבלה 1) בצינור הצנטריפוגלי של 15 מ"ל והעבר אותם לצלחת המצופה בקוטר 10 ס"מ. תרבות ב 37 °C, 5% CO₂ אינקובטור במשך שבוע אחד.
    הערה: בשבעת הימים הראשונים, אל תזיזו את המנה.
13. יש להתרענן עם מדיום B טרי פעם בשבוע עד ליום 49 (צלחת של 15 מ"ל/10 ס"מ), ולבחון את התאים תחת המיקרוסקופ פעם בשבוע.
    הערה: לאחר יום 49, ניתן למצוא מספר תאי הפרשה בסופרנאטנט בצלחת התרבית.
14. צנטריפוגה את התאים supernatant ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב RT.
15. בזהירות לשאוף את supernatant ו resuspend את התאים עם 2 מ"ל של מדיום B טרי ולהעביר לתוך באר חדשה הדבקה נמוכה של צלחת 6 בארות. דגירה באינקובטור 5% CO₂, 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: במהלך 7 הימים הבאים, אל תזיז את הצלחת. תאי המיקרוגליה יכלו להיצמד לתחתית באר ההדבקה הנמוכה.
16. ביום 56, יש להחליף במדיום C (טבלה 1) (2 מ"ל/באר של צלחת 6 בארות). תאי המיקרוגליה נצמדים לתחתית באר ההדבקה הנמוכה ונראים מסועפים מתחת למיקרוסקופ.
    הערה: על ידי החלפת Medium C כל 3 ימים (2 מ"ל / באר של צלחת 6 באר), מיקרוגליה יכול להיות מעובד בינוני C במשך כ 15 ימים.

2. יצירת ROs אנושיים ותרבות משותפת של ROs עם מיקרוגליה

1. תרבית את תאי גזע עובריים עובריים בתווך תאי גזע עד שצפיפות התאים מגיעה ל-80%-90%. זרעו לפחות 1 x 10⁶ תאים בכל באר.
2. מוסיפים דיספז (1 מ"ל/באר מתוך 6 פלטות) לתא התרבית. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות. שאפו את תמיסת הדיספאזה מהבאר.
3. מוסיפים לבאר מדיום D (טבלה 1) (1 מ"ל/באר של 6 פלטות). חותכים את התא לחתיכות קטנות עם פיפטה 10 μL.
4. לאסוף בעדינות את כל חלקי התא בינוני בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל.
5. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant.
6. בעדינות להשעות מחדש את התאים ב 200 μL של מטריצה קרה. העבירו את צינור המיקרוצנטריפוגה 1.5 לתוך אינקובטור למשך 20 דקות. פעלו מהר מכיוון שהמטריצה תתמצק בטמפרטורת החדר (RT). לאחר 20 דקות באינקובטור, המטריצה תתמצק.
7. מכינים צלחת בקוטר 10 ס"מ עם 15 מ"ל מדיום D. משעים מחדש את המטריצה עם Medium D ומנערים את צלחת הפטרי בעדינות.
8. לאחר מכן, לשים את המנה באינקובטור במשך 5 ימים. אין להזיז את הצלחת. הגדר את היום כיום 0 (ROs). התאים ידבקו תוך 3 ימים.
9. ביום 5 (ROs) וביום 10 (ROs), רענן את המדיום עם Medium D.
10. ביום ה-12 (ROs), מוציאים את המדיום ומוסיפים 3 מ"ל דיספז לכל מנה למשך 5 דקות.
11. שאפו את הדיספאזה והוסיפו 15 מ"ל של מדיום E (טבלה 1).
12. קציר מיקרוגליה: ביום ה-56 (MGs), שאפו בעדינות את ה-Medium C, הוסיפו Accutase (1 מ"ל/באר של צלחת בעלת 6 בארות) ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 3 דקות.
13. לאסוף את תאי מיקרוגליה לתוך צינור צנטריפוגלי 15 מ"ל עם pipet 5 מ"ל. תאי צנטריפוגה ב 200 x גרם ב RT במשך 5 דקות.
14. שאפו בעדינות את הסופרנאטנט והשהו את תאי המיקרוגליה עם 1 מ"ל של מדיום E. הוסיפו מיקרוגליה לתאי RO מעוכלים ביום ה-12.
    הערה: ביום ה-12 (ROs), התאים דביקים. ביום ה-13 (ROs), התאים נמצאים מרחפים במדיום E. אם המדיום משתנה בצהוב מהיום ה-12 (ROs) ליום ה-19 (ROs), רענן את המדיום עם Medium E.
15. ביום ה-19 (ROs), צוברים את האורגנואידים למרכז המנה על ידי ערבול עדין של הצלחת. שאפו בעדינות את Medium E ורעננו את המדיום עם Medium F.
16. מעבירים את האורגנואידים עם Medium F לצלחת תרחיף חדשה.
17. שנה את המדיום פעם בשבוע ובחר אורגנואידים לניסויים.

תוצאות

ההליך ליצירת אורגנואידים ברשתית מתואר במחקר הקודם שלנו¹⁵. כאן, אנו מראים את התוצאות המייצגות של מיקרוגליה ותאי מיקרוגליה ואורגנואידים ברשתית בתרבית משותפת.

כאן אנו מדגימים כל שלב של התמיינות מיקרוגליה (איור 1A). יום 0 מייצג את שלב תרבית תאי הגזע. ל...

Discussion

בשל הזמינות המוגבלת של הרשתית האנושית, ההבנה הנוכחית שלנו של תגובות דלקתיות ברשתית מגיעה כמעט ממודלים של בעלי חיים. כדי להתגבר על מגבלה זו, אורגנואידים ברשתית היו מובחנים. פיתוח מודלים של אורגנואידים ברשתית היה תחום מחקר פעיל, שמטרתו לשחזר את מורכבות הרשתית האנושית לצורך מידול מחלות ופית?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acctuase	Stemcell Technologies	07920
Advanced DMEM/F12	Thermo	12634-010
Anti-CRX(M02)	abnova	H00001406-M02	Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions
Anti-IBA1	Abcam	ab5076	Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions
B27	Life Technologies	17105-041
Dispase (1U/mL)	Stemcell Technologies	07923
DMEM basic	Gibco	10566-016
DMEM/F12	Gibco	10565-042
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
F12	Gibco	11765-054
FBS	Biological Industry	04-002-1A
Gelatin	Sigma	G7041-100G	Solid
Glutamax	Gibco	35050-061
H9 cell line	WiCell Research Institute
IL-3	RD Systems	203-IL-050
IL-34	PeproTech	200-34-50UG
KSR	Gibco	10828028
Matrix	Corning	356231
M-CSF	RD Systems	216-MC-500
MEM Non-essential Amino Acid Solution	Sigma	M7145
N2	Life Technologies	17502-048
Neurobasal	Gibco	21103-049
Pen/strep	Gibco	15140-122
Stem cell medium	Stemcell Technologies	5990
Taurine	Sigma	T-8691-25G
X-ViVO	LONZA	04-418Q
Y27632	Selleck	S1049
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023