In This Article

Summary

כאן, מתוארת שיטת כרומטוגרפיה נוזלית בשלב רגיל, בעלת ביצועים גבוהים כדי לזהות ולכמת רטינואידים קריטיים המעורבים בהקלה על תפקוד הראייה ברקמה עינית וסיסטמית כאחד, בהקשר של אספקת ויטמין A מערכתית ליצירת כרומופור רודופסין 11-cis-retinal רגיש לאור חיוני.

Abstract

קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) הם משפחת סופר-על של חלבונים טרנסממברנליים היוזמים מפל איתות באמצעות הפעלת חלבון G שלו עם הקשר עם הליגנד שלו. בכל ראיית יונקים, רודופסין הוא GPCR האחראי על התחלת מפל הפוטוטרנסדוקציה. בתוך פוטורצפטורים, רודופסין קשור לכרומופור 11-cis-retinal שלו ומופעל באמצעות איזומריזציה רגישה לאור של 11-cis-retinal ל-all-trans-retinal, אשר מפעילה את חלבון G המתמר, וכתוצאה מכך מפל הפוטוטרנסדוקציה.

בעוד phototransduction מובן היטב, התהליכים המעורבים באספקת מבשרי ויטמין A תזונתיים עבור 11-cis-retinal דור בעין, כמו גם מחלות וכתוצאה מכך שיבוש של אספקה זו, עדיין לא מובן במלואו. ברגע שמבשרי ויטמין A נספגים במעי, הם מאוחסנים בכבד כאסטרי רטיניל ומשוחררים לזרם הדם כטרנס-רטינול הקשור לחלבון קושר רטינול 4 (RBP4). רטינול RBP4-רטינול זה ייספג על ידי איברים מערכתיים, כגון הכבד, הריאות, הכליות והעין. לפיכך, שיטה לכימות המטבוליטים השונים של ויטמין A בעין ובאיברים מערכתיים היא קריטית לחקר תפקוד תקין של רודופסין GPCR.

בשיטה זו אנו מציגים מיצוי מקיף ושיטה אנליטית לניתוח ויטמין A ברקמת מורין. באמצעות ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית בשלב רגיל ובעל ביצועים גבוהים, ניתן לזהות בו זמנית את כל האיזומרים הרלוונטיים של רטינאלדהידים, רטינולים ואסטרי רטיניל באמצעות ריצה אחת, המאפשרת שימוש יעיל בדגימות ניסיוניות ומגבירה את האמינות הפנימית בין מטבוליטים שונים של ויטמין A באותה דגימה. בעזרת שיטה מקיפה זו, החוקרים יוכלו להעריך טוב יותר את אספקת ויטמין A המערכתית בתפקוד רודופסין GPCR.

Introduction

קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) הם אחת ממשפחות החלבונים הנחקרות והמאופיינות ביותר הידועות. בתפקידם הידוע ביותר, GPCRs משמשים כקולטן פני התא בהעברת אותות, ומאתחלים תגובות תוך-תאיות בעת קשירה עם ליגנד מסוים. GPCRs מאופיינים בשבעה תחומים סליליים טרנסממברנליים (TM) ובשישה תחומי לולאה כוללת. מתוך שש הלולאות, שלוש לולאות מכוונות חוץ-תאיות כדי להקל על קשירת ליגנדים, בעוד ששלוש הלולאות התוך-תאיות האחרות מצומדות לחלבון G הטרוטרימרי המורכב מתת-היחידותGα, Gβ ו-Gγ 1,2.

GPCRs מסווגים למספר סוגים, כולל Class A דמוי רודופסין, משפחת קולטני Class B Secretin, Class C גלוטמט, קולטני פרומון הזדווגות פטרייתיים Class D, קולטני AMP מחזוריים Class E, ו- Class F מקורזל/מוחלק 3,4. כפי ששמה מרמז, תת-מחלקה מסוג A דמוית רודופסין GPCR כוללת רודופסין, ה-GPCR הקריטי האחראי על פוטוטרנסדוקציה ותפקוד חזותי. רודופסין מכיל את כל מאפייני המפתח הרלוונטיים והאלמנטים המבניים הנמצאים במודל הקנוני של GPCRs, כולל שבעת התחומים הסליליים של המדיטציה הטרנסנדנטלית שהוזכרו קודם לכן, שש הלולאות החוץ-תאיות והתוך-תאיות, והקשר עם חלבון G הטרוטרימרי, הידוע גם בשם טרנסדוקין (Gt) בפוטורצפטורים 1,5,6,7. בתוך כיס הקישור של רודופסין, 11-cis-retinal, ליגנד הכרומופורים הרגיש לאור, נקשר לרודופסין על ליזין 296 דרך קישור בסיס קוולנטי של שיף, וכך נוצר 11-cis-retinylidene 1,8. עם ספיגת פוטון, 11-cis-retinylidene photoisomerize לתוך all-trans-retinylidene, גרימת שינוי קונפורמציה בתוך רודופסין. לכן, ליגנד הרשתית 11-cis-retinal הוא קריטי לתפקוד של rhodopsin GPCR, ואספקה חזקה ויעילה של 11-cis-retinal חייבת להישמר ברציפות כדי להתגבר על קצב התחלופה הגבוה בתוך photoreceptors.

רטינאלדהידים כגון 11-cis-retinal שייכים לקבוצת מולקולות הנקראות רטינואידים, ורטינואידים רלוונטיים ביולוגית מכונים באופן נרחב יותר ויטמין A. רטינואידים מאופיינים בקבוצת קצה מחזורית המחוברת לשרשרת פוליאן מצומדת, עם קבוצת קצה קוטבית בקצה השני. רטינאלדהידים והוויטמינים הקשורים לוויטמין A אינם יוצאים מן הכלל לאפיון זה, המכילים את טבעת β-יונון כקבוצת הקצה המחזורית, שרשרת פוליאן דיטרפן, וקבוצת קצה קוטבית שונה בהתאם לוויטמר, כלומר, קבוצת אלדהיד עבור רטינלדהידים, קבוצת הידרוקסיל עבור רטינולים, קבוצת קרבוקסיל עבור חומצות רטינואיות, קשר אסטר עבור אסטרי רטיניל, וכו' (איור 1)9,10.

יונקים לא יכולים לסנתז ויטמין A דה נובו, אבל צמחים יכולים; לכן, כל הרטינואידים במערכות יונקים חייבים לנבוע מהתזונה של יצרנים צמחיים לצרכנים בשרשרת המזון. במודל הקנוני של מטבוליזם של ויטמין A, β-קרוטן, הצמח הארכיטיפי פרוביטמין A, נספג לתוך אנטרוציט המעי דרך קולטן נבלות סוג B, חבר 1 (SCARB1), נבקע לשתי מולקולות של all-trans-retinal על ידי β-carotene oxygenase 1 (BCO1/BCMO1), אשר נקשר לחלבון קושר רטינאלדהיד 2 (RBP2) ומופחת ל- all-trans-רטינול על ידי רטינול דהידרוגנאזות (RDH), מומר לאסטרי רטיניל על ידי לציטין רטינול אצילטרנספראז (LRAT), ולאחר מכן נשלח לזרם הדם בכילומיקרונים 11,12,13,14. אסטרי רטיניל, כגון רטיניל פלמיטט, לעומת זאת, משמשים כפרוביטמין A הדומיננטי ממקורות מן החי. רטיניל פלמיטט מלומן המעי עובר הידרוליזה לכל-טרנס-רטינול על ידי קרבוקסילאסטראז 1 (CES1) ומתפזר לתוך אנטרוציט המעי15. הכבד הוא האיבר ההומאוסטטי והאחסון העיקרי של ויטמין A הומיאוסטזיס, אשר סופג את אסטרי הרטיניל בתוך כילומיקרונים אלה, אשר עוברים הידרוליזה לכל-טרנס-רטינול הקשור לחלבון קושר רטינול תאי 1 (CRBP1) על ידי הידרולזות רטיניל אסטר, נכנס לתאי סטלט בכבד ומומר חזרה לאסטרי רטיניל על ידי LRAT לאחסון 13,16, 17. כדי לשמור על רמה הומיאוסטטית של ויטמין A באורגניזם, הכבד משחרר ויטמין A בצורה של כל טרנס-רטינול הקשור לקומפלקס הובלת סרום, המורכב מחלבון קושר רטינול 4 (RBP4) וטרנסתירטין (TTR)15,18,19. קומפלקס זה ייקרא holo-RBP4 בכתב יד זה.

כדי להשתמש באספקה מערכתית זו של ויטמין A בדם, רקמות מערכתיות, כולל רקמת העין שבה נשמר מקור איתן של ויטמין A, חייבות להיות בעלות שיטה לספוג הולו-RBP4 ברקמות. בתוך הרשתית העשירה בפוטורצפטורים ברקמת העין, קולטן הממברנה המגורה על ידי חומצה רטינואית 6 (STRA6) הוא הטרנספורטר המעורב בפונקציה זו. במחקרים מכניסטיים, הוכח כי STRA6 מסוגל להקל על צריכת כל טרנס-רטינול חוץ-תאי מ-holo-RBP4 לתוך RPE20. כל טרנס-רטינול מיובא זה ייכנס לאחר מכן למחזור הראייה, שהוא התהליך שבו כל טרנס-רטינול מומר ל-11-cis-retinal בתוך RPE והקטע החיצוני של קולטני האור, ובכך מקל על תפקוד הראייה כאשר הוא קשור לרודופסין 9,21.

ברגע ש-all-trans-retinol מ-circulatory holo-RBP4 חוצה את מחסום הדם-רשתית לתוך RPE בתוך רקמת העין דרך STRA6, all-trans-retinol ב-RPE עובר תחילה אסטרי רטיניל על ידי LRAT, ולאחר מכן עובר הידרוליזה ל-11-cis-retinol על ידי חלבון אפיתל פיגמנט ברשתית ספציפי ל-65 kDa (RPE65). 11-cis-retinol מומר לאחר מכן ל-11-cis-retinal על ידי retinol dehydrogenase 5. רשתית 11-cis-retinal זו נישאת לתוך המקטע החיצוני של הפוטורצפטור (OS) על ידי החלבון קושר הרטינואידים הבין-פוטורצפטור (IRBP)9,21. בתוך הרשתית האנדופלסמית המקיפה את גרעין הפוטורצפטור בתוך השכבה הגרעינית החיצונית (ONL), GPCRs אופסין מסונתזים ומועברים על פני הציליום המחבר (CC). החלבונים המוטוריים המעורבים בהובלה זו ברחבי CC שנויים במחלוקת, אך ההשערות הנוכחיות מרמזות על קינזין והובלה תוך-פלגלרית מבוססת דינאין (IFT) או הובלה מבוססת מיוזין כמסייעים אפשריים לתהליך זה 14,22,23,24,25,26. ברגע ששני רכיבים אלה נפגשים בתוך הדיסקים הממברניים בתוך מערכת ההפעלה, 11-cis-retinal ואופסין יוצרים 11-cis-retinylidene באמצעות קישור קוולנטי של בסיס Schiff בליזין 196 על רודופסין, מוכן לפוטוטרנסדוקציה8.

בעוד שהביטוי של STRA6 בתוך RPE של הרשתית מסייע להקל על צריכת all-trans-retinol מ- holo-RBP4, STRA6 לא נמצא מתבטא בכבד, למרות תפקידו כאיבר ההומיאוסטטי העיקרי לוויטמין A והפגין יכולות בצריכת all-trans-retinol מ- holo-RBP4 15,19,27,28, 29,30,31. בסופו של דבר, התגלה קולטן מקביל הנקרא חלבון קושר רטינול 4 קולטן 2 (RBPR2), המציג את היכולת לצרוך את כל טרנס-רטינול מ- Holo-RBP4, בדומה ל- STRA6, אך מתבטא ברקמת הכבד32.

לכן, הבנה מלאה של תפקיד הרודופסין בתפקוד הראייה מחייבת הבנה של התהליכים הביולוגיים ששיאם בהתחדשות הפיגמנט הראייתי. זה, בתורו, קשור קשר הדוק לתהליכים שתוארו לעיל, כולל חילוף החומרים של מבשרי פרוביטמין A, אחסון בתוך הכבד, שחרור של holo-RBP4 על ידי הכבד, ובסופו של דבר ספיגה של קולטני ממברנה holo-RBP4 דרך STRA6 ו- RBPR2. כאמור, מודלים של בעלי חיים כגון עכברים נותרו אחד המודלים המובילים בחקר תהליכים כאלה. לפיכך, ברצוננו להציג שיטת מיצוי עבור רטינואידים ברקמת מורין, כמו גם שיטת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בשלב רגיל (HPLC) שיכולה לזהות ולכמת רטינואידים אלה. באמצעות שיטות אלה, ניתן לנתח את הרטינואידים החשובים שתוארו לעיל, כגון ליגנד רודופסין ברשתית 11-cis-retinal או הרטינואיד הראשי המוביל all-trans-retinol, באיברים עיניים, כבדיים וסיסטמיים. על ידי הערכת אספקת רטינואידים ברקמת מורין, הבנתנו את מצבי המחלה והפתולוגיות הקשורות לאספקה הלוגיסטית של רטינואידים יכולה להיות מתקדמת עוד יותר.

מלבד תפקודם ככרומופור בתפקוד הראייה באמצעות קשר עם GPCRs אופסין, רטינואידים גם ממלאים תפקיד מרכזי באיתות תאי יונקים באמצעות איתות חומצה רטינואית, המתאפשר על ידי שתי משפחות של קולטנים גרעיניים, קולטני חומצה רטינואית (RARs) וקולטני X רטינואידים (RXR), הנקשרים ישירות לדנ"א ושעתוק גנים מוסדר33. שתי משפחות או קולטנים אלה משתמשים שניהם ברטינואידים בצורה של חומצות רטינואיות כמו ליגנד. נדירים הוכחו כבעלי זיקה הן לחומצה טרנס-רטינואית והן לחומצה רטינואית 9-cis-retinoic, בעוד ש-RXR מבטאים זיקה רק לחומצה 9-cis-retinoic 34,35. חומצות רטינואיות בכמויות בלתי מבוקרות הן טרטוגניות, ואיתות חומצה רטינואית חייב להיות מבוקר באופן הדוק ביותר36. ייצור חומצות רטינואיות לאיתות חייב להתרחש באופן מקומי ובנקודות זמן ספציפיות מאוד להתפתחות תקינה של רקמות, כגון בהתפתחות המוח האחורי והגפיים, אך אינספור דוגמאות אחרות משתמשות באיתות חומצה רטינואית37,38. בתוך תאים המשתתפים באיתות חומצה רטינואית, חומצות רטינואיות מסונתזות על ידי שתי קבוצות של אנזימים, אלכוהול/רטינול דהידרוגנאזות (ADHs/RDHs) המאפשרים חמצון של רטינולים הנלקחים על ידי STRA6 או RBPR2 לרטינאלדהידים, ורטינאלדהיד דהידרוגנאזות (RALDHs) המאפשרים חמצון של רטינאלדהידים לחומצות רטינואיות39. בעוד שהן אינן משתתפות באיתות GPCR כשלעצמו, חומצות רטינואיות בכל זאת נוכחות כרטינואיד חיוני המתפקד גם כליגנד לקולטני איתות.

אמנם לא מתואר בפירוט כאן, אך ברצוננו להכיר בשיטות שנקבעו בעבר לזיהוי רטינואידים באמצעות HPLC בהקשרים שונים, כגון במחקר מזון ובחקר רודופסין מיקרוביאלי. שיטות אלה משתמשות במטרות ובגישות שונות לזיהוי רטינואידים, כולל שימוש בטכניקות של פאזה הפוכה הדורשות שלבים ניידים פחות נדיפים ומסוכנים 40,41,42, זיהוי חומצות רטינואיות והאיזומרים הקשורים אליהן 40,41, וטיהור ומיצוי ממקורות ביולוגיים שונים43. השיטה שלנו מתמקדת באופן ספציפי בזיהוי של איזומרים של רטיניל פלמיטט, רטינאלדהיד ורטינול מרקמת יונקים. יש לשקול פרוטוקולים שונים אם מקרה השימוש המיועד שונה מיישום ספציפי זה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת מינסוטה (פרוטוקול # 2312-41637A) ובוצעו בהתאם להצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה. בצעו את כל החילוצים בחושך, תחת אור אדום עמום להארה. שימו לב לשאריות האור הנפלטות מתצוגות המכשירים ונורות ה-LED של האביזרים.

1. יצירת תקן רטינואיד ספקטרופוטומטרי ויצירת עקומה סטנדרטית חיצונית

הערה: הכן מיכל קרח יבש לאחסון זמני של רטינואידים לפני ניתוח עם HPLC.

  1. לשקול כמות שרירותית אך מתאימה של רטינואידים ולהמיס אותם בממס מתאים לכימות באמצעות ספקטרופוטומטריה.
    הערה: הממס המועדף במחקר זה הוא אתנול, וערכי הספיגה המולרית של רטינואידים המומסים באתנול מפורטים בטבלה 1. אתנול נטול מים, ברמת HPLC חייב לשמש להמסת תקנים ודגימות. אתנול מטוהר אך ורק באמצעות זיקוק יוצר תערובת אזאוטרופית עם מים, המכילה כ -4% מים בנפח. מים אינם ניתנים לערבוב עם הפאזה ההקסנואית הניידת ויגרמו להידרציה של השלב הנייח של הסיליקה, מה שיוביל בסופו של דבר להתכלות של העמודה.
  2. תוך שימוש בחוק באר-למברט ובספיגה המולרית של הרטינואיד הרלוונטי, מכמתים את ריכוז התקן שנוצר (טבלה 1).
    ספיגה = ספיגה מולרית (ε) × ריכוז מולארי × אורך נתיב
  3. בצע דילולים סדרתיים כדי ליצור ריכוזים שיכולים ליצור עקומה סטנדרטית בטווח הכימות של הרקמה הרצויה.
    הערה: היו מודעים למגבלות היסוד של חוק באר-למברט, כגון חוסר תוקפו עם ריכוזים גבוהים של אנליטים. כדי להימנע מבעיה זו, תקני הרטינואידים המדוללים צריכים להימנע מיצירת ערכי ספיגה גדולים מ-1. עבור היישומים שלנו בכימות רטינול ורטינאלדהיד באיברי מורין, מצאנו שעקומת כיול עם טווח של 1-10 ננוגרם הצליחה לכסות את הכמויות האופייניות שנמצאו. עבור כימות רטיניל פלמיטט מכבד מורין, מצאנו כי עקומת כיול עם טווח של 20-80 מיקרוגרם הצליחה לכסות את הכמויות האופייניות שנמצאו.
  4. על ידי שינוי הדרגתי של נפח ההזרקה מתמיסת המלאי שנוצרה בעבר, ובכך לשנות בהדרגה את כמות הרטינואיד המוזרקת, לשלב את הפסגות כדי ליצור עקומה סטנדרטית חיצונית המתאימה לכימות רטינואיד שבו שילוב השיא עומד ביחס ישר לכמות הרטינואיד המוזרקת.

2. קציר רקמות ואיסוף דגימות

הערה: הכינו מיכל קרח יבש לאחסון זמני של רקמה לפני הומוגניזציה של רקמות ומיצוי רטינואידים. כמויות קציר הרקמה המומלצות מפורטות בטבלה 2. כדי להסביר שינויים ברטינואידים עקב שינויים בתכולת הדם עבור כל רקמה, מיצוי רקמות צריך להיעשות על עכברים מחוררים לחלוטין, ומיצוי דם צריך להסתיים על עכברים נפרדים.

  1. יש להרדים את העכברים בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) (חנק CO2 כאן).
  2. דם: מיד לאחר המתת חסד, ערפו את ראשיהם של העכברים עם זוג מספריים, ונקזו את הדם מהגזע הראשי של העכברים לתוך צינור של 1.5 מ"ל.
  3. עין: בעזרת זוג מלקחיים, הסירו את העיניים מהראש הערוף.
  4. מוח: בעזרת זוג מספריים קטנים, חותכים לתוך הראש הערוף ומוציאים את המוח באמצעות זוג מלקחיים.
  5. כליות, כבד, טחול, לב וריאות: באמצעות זוג מספריים קטנים, לבצע חתך לתוך הבטן, לחתוך בכיוון העליון לאורך קו האמצע, לחתוך דרך עצם החזה ואת כלוב הצלעות. הסר את הרקמה החשופה באמצעות זוג מלקחיים.

3. הומוגניזציה של רקמות

הערה: אם יש צורך בניתוח של מחיצות קטנות יותר של איברים, כגון באיברים גדולים יותר (למשל, רקמת כבד או ריאה), האיבר כולו צריך להיות הומוגני כדי למנוע הבדלים בתכולת רטינואיד בחלקים שונים של הרקמה. במקום זאת, לחלק את הומוגנט אם כמויות קטנות יותר של רקמה רצויים. סכמה לפרוטוקול מפורטת באיור 2. פרוטוקול שונה זה הותאם מקיין ונאפולי44.

  1. הניחו את הרקמה בצינור מטחנת הרקמות, יחד עם 50% מלוחים קרים כקרח (0.9%) ו-50% מתנול. ראה טבלה 2 עבור הנפח המשמש עבור כל סוג רקמה.
  2. מניחים את המזיק לתוך צינור המטחנה, לאט ובעדינות לבצע חמישה סיבובים מלאים עם pestle כדי לקבל הומוגנאט.
  3. העברת דגימות לתוך צינורות 15 מ"ל מיד לאחר הומוגניזציה.
  4. מוסיפים 2 מ"ל מתנול ומניחים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: אם יש צורך בניתוח של נגזרות רטינאלדהיד אוקסים, יש להוסיף 1 מ"ל של הידרוקסילאמין הידרוכלוריד 0.1 M ב-0.1 M HEPES (pH 6.5) (איור 1).

4. מיצוי רטינואידים

זהירות: הקסאן דליק מאוד, נדיף מאוד ורעיל מאוד. יש להשתמש במכונות הנשמה מאושרות על ידי המכון הלאומי לבטיחות ובריאות תעסוקתית (NIOSH), הגנה על העיניים, כפפות בוטיל ומכסה מנוע מנדף בעת הטיפול בהקסאן. בעת אידוי הקסאן מדגימות, מומלץ להשתמש בצורה כלשהי של מנגנון זרימת אוויר משופר כדי למנוע הצטברות אדי ממס, למשל, מנגנון יניקה של שנורקל.

  1. הוסף 10 מ"ל של הקסאן להומוגנט ומערבל את הצינור אופקית במשך 10 שניות לפחות.
    הערה: קריטי שהשלבים יתערבבו במלואם.
  2. צנטריפוגו את תערובת ההומוגנאט/הקסאן למשך 3 דקות ב-1,000 × גרם כדי להקל על הפרדת פאזות.
  3. בצע את המיצוי 2x כדי להבטיח מיצוי מלא של רטינואידים מן homogenate. חזור על שלבים 4.1 ו- 4.2.
  4. מוציאים את שכבת ההקסאן באמצעות פיפטה ומניחים את שכבת ההקסאן בסט נפרד של שפופרות זכוכית 15 מ"ל לאידוי ואקום.
    הערה: לאידוי, השתמש בצינורות זכוכית 15 מ"ל כדי למנוע הידבקות של רטינואידים לדפנות הצינור.
  5. באמצעות צנטריפוגת ואקום, לאדות לחלוטין את הקסאן.

5. ניתוח השעיה ו-HPLC

הערה: מכיוון שמערכת HPLC ששימשה בכתב יד זה הייתה מערכת משאבה בינארית, הפאזה הניידת בת ארבעת הרכיבים עורבבה מראש בבקבוק יחיד לפני הפעולה.

זהירות: כל ארבעת הממיסים האורגניים המשמשים בשיטה זו הם דליקים מאוד, נדיפים מאוד ורעילים מאוד. 1,4-דיוקסן רגיש להיווצרות חמצן נפיץ בחשיפה לחמצן. יש לשמור את כל הכלים המכילים 1,4-דיוקסן סגורים כאשר אינם בשימוש. בעת הטיפול בממסים אלה יש להשתמש במכונות הנשמה מאושרות על ידי המכון הלאומי לבטיחות ובריאות תעסוקתית (NIOSH), להגנה על העיניים, לכפפות בוטיל ולמכסה אדים. בעת הפעלת ממסים אלה ב- HPLC, מומלצת צורה כלשהי של מנגנון זרימת אוויר משופר כדי למנוע הצטברות אדי ממס, למשל, מנגנון יניקה של שנורקל.

  1. להשעות את צינור 15 מ"ל מיובש עם 100 μL של הקסאן; מערבלים היטב כדי לוודא שכל הרטינואידים מומסים.
  2. פיפטה את כל 100 μL של הקסאן לתוך תוספת זכוכית אחת עבור ניתוח HPLC.
  3. הגדר את ריצת HPLC (הותאמה מ- Landers ו- Olson45): שלב נייד: 85.4% הקסאן (v/v), 11.2% אתיל אצטט (v/v), 2% דיוקסן (v/v), 1.4% 1-אוקטאנול (v/v); עמודה: שתי עמודות ID, 4.6 מ"מ x 250 ננומטר, 5 מיקרומטר, מחוברות בסדרה; טמפרטורת תרמוסטט מרובת עמודות: 25 °C; נפח הזרקה: 100 μL; קצב זרימה: 1 מ"ל/דקה; זמן הפעלה: 40 דקות. השתמש בזיהוי ספיגת ספקטרום UV; השאר את האפשרות לרכישת ספקטרום UV מ 200 ננומטר עד 400 ננומטר.

6. שיא הזיהוי והאינטגרציה

  1. זהה שיאים באמצעות זמן שמירה וספקטרום UV של כל רטינואיד מעניין כפי שנצפה מניתוח תקני רטינואידים (איור 3, טבלה 3 וטבלה 4).
  2. באמצעות מערכת הנתונים הכרומטוגרפית של מערכת HPLC שנבחרה, שלב את הפסגות שזוהו. האינטגרציה, או השטח שמתחת לעקומה עומד ביחס ישר לכמות האנליט. הפנה לעקומת התקן החיצונית שנוצרה בשלב 1 כדי לכמת את האנליט.
    1. לניתוח כרומטוגרמות הנוצרות מרקמה ביולוגית, השתמש באינטגרציה ידנית על פני אינטגרציה אוטומטית המוצעת על ידי מערכות נתונים כרומטוגרפיות טיפוסיות, שכן שינויים בפרמטרים כגון זמן שמירה נצפים לעתים קרובות בדגימות כאלה.
    2. ודא שהכרומטוגרמות אינן מציגות אי סדרים שעשויים להצביע על בעיות במהלך הריצה, כגון קווי בסיס רועשים או פסגות שאינן גאוסיות. בעיות אלה מצביעות על מזהמים ב- HPLC או בלאי על עמודות ויש לתקן אותן לצורך ניתוח תקף.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

כאן, השתמשנו בשיטה שתוארה לעיל כדי לזהות ולכמת רטינואידים ברקמה עינית וסיסטמית מורין ויצרנו כרומטוגרמות מייצגות. בנוסף, אנו נותנים סיכום של רטינואידים טיפוסיים שניתן לזהות ברקמות אלה.

בגיל 6 חודשים, עכברים הומתו באמצעות חנק CO2 . כדי לשמור על תכולת רטינואיד עיני, עכברים...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בשיטה זו, HPLC בשלב רגיל משמש לזיהוי וכימות רטינואידים רלוונטיים, כולל אסטרי רטיניל, רטינאלדהידים ורטינולים. בהתחשב בחשיבות של 11-cis-retinal ככרומופור קריטי בהפעלת rhodopsin GPCR, שיטה שיכולה לזהות את המטבוליטים הקשורים לייצור של 11-cis-retinal היא קריטית לחקר תפקוד הראייה הכולל. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH-NEI (EY030889 ו- 3R01EY030889-03S1) ובחלקה על ידי קרנות הזנק של אוניברסיטת מינסוטה ל- G.P.L. ברצוננו גם להודות למכון העיניים הלאומי על שסיפק לנו את תקן הרשתית 11-cis-retinal המשמש בכתב יד זה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent
1-Octanol, suitable for HPLC, ≥99.5%Sigma-Aldrich, Millipore Sigma203-917-6
1,4-Dioxane, suitable for HPLC, ≥99.5%Sigma-Aldrich, Millipore Sigma204-661-8
11-cis-retinalNational Eye InstituteN/A
11-cis-RetinolToronto Research ChemicalsTRC-R252105
13-cis-retinalToronto Research ChemicalsTRC-R239900
13-cis-retinolToronto Research ChemicalsTRC-R252110
All-trans-RetinalToronto Research ChemicalsTRC-R240000
All-trans-RetinolToronto Research ChemicalsTRC-R252002
Ethyl Acetate, suitable for HPLC, ≥99.7%Sigma-Aldrich, Millipore Sigma205-500-4
Hexane, HPLC GradeFisher Scientific, Spectrum Chemical18-610-808
Methanol (HPLC)Fisher ScienctificA452SK-4
Retinyl PalmitateToronto Research ChemicalsTRC-R275450
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)Fisher ScientificS271-500
Instruments
1260 Infinity II Analytical Fraction CollectorAgilentG1364F
1260 Infinity II Binary PumpAgilentG7112B
1260 Infinity II Diode Array DetectorAgilentG7115A
1260 Infinity II Multicolumn ThermostatAgilentG7116A
1260 Infinity II VialsamplerAgilentG7129A
ST40R Refrigerated CentrifugeThermo ScientificTSST40R
Vacufuge Plus Centrifuge ConcentratorEppendorf22820168
Consumables
2 mL Amber Screw Top VialsAgilent5188-6535
Crimp Cap with PTFE/red rubber septa, 11 mmAgilent5183-4498
Disposable Glass Conical Centrifuge TubesMillipore SigmaCLS9950215
Screw cap tube, 15 mLSarstedt62.554.502
Vial insert, 150 µL, glass with polymer feetAgilent5183-2088

References

  1. Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), 739-745 (2000).
  2. Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G. F., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459 (7245), 356-363 (2009).
  3. Alhosaini, K., Azhar, A., Alonazi, A., Al-Zoghaibi, F. GPCRs: The most promiscuous druggable receptor of the mankind. Saudi Pharm J. 29 (6), 539-551 (2021).
  4. Hu, G. -M., Mai, T. -L., Chen, C. -M. Visualizing the GPCR network: Classification and evolution. Sci Rep. 7 (1), 15495(2017).
  5. Lerea, C. L., Somers, D. E., Hurley, J. B., Klock, I. B., Bunt-Milam, A. H. Identification of specific transducin α subunits in retinal rod and cone photoreceptors. Science. 234 (4772), 77-80 (1986).
  6. Gao, Y., Hu, H., Ramachandran, S., Erickson, J. W., Cerione, R. A., Skiniotis, G. Structures of the rhodopsin-transducin complex: Insights into G protein activation. Mol Cell. 75 (4), 781-790.e3 (2019).
  7. Zhou, X. E., Melcher, K., Xu, H. E. Structure and activation of rhodopsin. Acta Pharmacol Sin. 33 (3), 291-299 (2012).
  8. Robinson, P. R., Cohen, G. B., Zhukovsky, E. A., Oprian, D. D. Constitutively active mutants of rhodopsin. Neuron. 9 (4), 719-725 (1992).
  9. Kiser, P. D., Golczak, M., Palczewski, K. Chemistry of the retinoid (visual) cycle. Chem Rev. 114 (1), 194-232 (2014).
  10. Sani, B. P., Hill, D. L. [3] Structural characteristics of synthetic retinoids. Methods Enzymol. 189, 43-50 (1990).
  11. Lobo, G. P., Amengual, J., Palczewski, G., Babino, D., von Lintig, J. Carotenoid-oxygenases: Key players for carotenoid function and homeostasis in mammalian biology. Biochim Biophys Acta. 1821 (1), 78-87 (2012).
  12. Amengual, J., et al. Two carotenoid oxygenases contribute to mammalian provitamin A metabolism. J Biol Chem. 288 (47), 34081-34096 (2013).
  13. Harrison, E. H. Mechanisms involved in the intestinal absorption of dietary vitamin A and provitamin A carotenoids. Biochim Biophys Acta. 1821 (1), 70-77 (2012).
  14. Leung, M., et al. The logistical backbone of photoreceptor cell function: Complementary mechanisms of dietary vitamin A receptors and rhodopsin transporters. Int J Mol Sci. 25 (8), 4278(2024).
  15. Martin Ask, N., Leung, M., Radhakrishnan, R., Lobo, G. P. Vitamin A transporters in visual function: A mini review on membrane receptors for dietary vitamin A uptake, storage, and transport to the eye. Nutrients. 13 (11), 3987(2021).
  16. Harrison, E. H. Carotenoids, β-apocarotenoids, and retinoids: The long and the short of it. Nutrients. 14 (7), 1411(2022).
  17. Li, Y., Wongsiriroj, N., Blaner, W. S. The multifaceted nature of retinoid transport and metabolism. Hepatobiliary Surg Nutr. 3 (3), 126-139 (2014).
  18. D'Ambrosio, D. N., Clugston, R. D., Blaner, W. S. Vitamin A metabolism: An update. Nutrients. 3 (1), 63-103 (2011).
  19. Yamamoto, Y., et al. Interactions of transthyretin (TTR) and retinol-binding protein (RBP) in the uptake of retinol by primary rat hepatocytes. Exp Cell Res. 234 (2), 373-378 (1997).
  20. Kawaguchi, R., et al. A membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315 (5813), 820-825 (2007).
  21. Kiser, P. D., Golczak, M., Maeda, A., Palczewski, K. Key enzymes of the retinoid (visual) cycle in vertebrate retina. Biochim Biophys Acta. 1821 (1), 137-151 (2012).
  22. Radhakrishnan, R., et al. The role of motor proteins in photoreceptor protein transport and visual function. Ophthalmic Genet. 43 (3), 285-300 (2022).
  23. Solanki, A. K., et al. Loss of motor protein MYO1C causes rhodopsin mislocalization and results in impaired visual function. Cells. 10 (6), 1322(2021).
  24. Liu, X., Udovichenko, I. P., Brown, S. D. M., Steel, K. P., Williams, D. S. Myosin VIIa participates in opsin transport through the photoreceptor cilium. J Neurosci. 19 (15), 6267-6274 (1999).
  25. Insinna, C., Besharse, J. C. Intraflagellar transport and the sensory outer segment of vertebrate photoreceptors. Dev Dyn. 237 (8), 1982-1992 (2008).
  26. Krock, B. L., Mills-Henry, I., Perkins, B. D. Retrograde intraflagellar transport by cytoplasmic dynein-2 is required for outer segment extension in vertebrate photoreceptors but not arrestin translocation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (11), 5463-5471 (2009).
  27. Blaner, W. S. STRA6, a cell-surface receptor for retinol-binding protein: The plot thickens. Cell Metab. 5 (3), 164-166 (2007).
  28. Bouillet, P., et al. Developmental expression pattern of Stra6, a retinoic acid-responsive gene encoding a new type of membrane protein. Mech Dev. 63 (2), 173-186 (1997).
  29. Blomhoff, R., Norum, K. R., Berg, T. Hepatic uptake of [3H]retinol bound to the serum retinol binding protein involves both parenchymal and perisinusoidal stellate cells. J Biol Chem. 260 (25), 13571-13575 (1985).
  30. Kelly, M., von Lintig, J. STRA6: role in cellular retinol uptake and efflux. Hepatobiliary Surg Nutr. 4 (4), 229-242 (2015).
  31. Quadro, L., et al. The role of extrahepatic retinol binding protein in the mobilization of retinoid stores. J. Lipid Res. 45 (11), 1975-1982 (2004).
  32. Alapatt, P., et al. Liver retinol transporter and receptor for serum retinol-binding protein (RBP4). J Biol Chem. 288 (2), 1250-1265 (2013).
  33. Chawla, A., Repa, J. J., Evans, R. M., Mangelsdorf, D. J. Nuclear receptors and lipid physiology: Opening the X-files. Science. 294 (5548), 1866-1870 (2001).
  34. Heyman, R. A., et al. 9-cis retinoic acid is a high affinity ligand for the retinoid X receptor. Cell. 68 (2), 397-406 (1992).
  35. Allenby, G., et al. Retinoic acid receptors and retinoid X receptors: interactions with endogenous retinoic acids. Proc Natl Acad Sci USA. 90 (1), 30-34 (1993).
  36. Das, B. C., et al. Retinoic acid signaling pathways in development and diseases. Bioorg Med Chem. 22 (2), 673-683 (2014).
  37. Hernandez, R. E., Putzke, A. P., Myers, J. P., Margaretha, L., Moens, C. B. Cyp26 enzymes generate the retinoic acid response pattern necessary for hindbrain development. Development. 134 (1), 177-187 (2007).
  38. Yashiro, K., et al. Regulation of retinoic acid distribution is required for proximodistal patterning and outgrowth of the developing mouse limb. Dev Cell. 6 (3), 411-422 (2004).
  39. Duester, G. Families of retinoid dehydrogenases regulating vitamin A function. Eur J Biochem. 267 (14), 4315-4324 (2000).
  40. Tatum, V., Chow, C. K. Rapid measurement of retinol, retinal, 13-cis-retinoic acid and all-trans-retinoic acid by high performance liquid chromatography. J Food Drug Anal. 13 (3), (2020).
  41. Teerlink, T., Copper, M. P., Klaassen, I., Braakhuis, B. J. M. Simultaneous analysis of retinol, all-trans- and 13-cis-retinoic acid and 13-cis-4-oxoretinoic acid in plasma by liquid chromatography using on-column concentration after single-phase fluid extraction. J Chromatogr B. Biomed Sci App. 694 (1), 83-92 (1997).
  42. Egberg, D. C., Heroff, J. C., Potter, R. H. Determination of all-trans and 13-cis vitamin A in food products by high-pressure liquid chromatography. J Agric Food Chem. 25 (5), 1127-1132 (1977).
  43. Sudo, Y., et al. A microbial rhodopsin with a unique retinal composition shows both sensory rhodopsin II and bacteriorhodopsin-like properties. J Biol Chem. 286 (8), 5967-5976 (2011).
  44. Kane, M. A., Napoli, J. L. Quantification of endogenous retinoids. Methods Mol Biol. 652, 1-54 (2010).
  45. Landers, G. M., Olson, J. A. Rapid, simultaneous determination of isomers of retinal, retinal oxime and retinol by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A. 438, 383-392 (1988).
  46. Hubbard, R., Brown, P. K., Bownds, D. [243] Methodology of vitamin A and visual pigments. Methods Enzymol. 18, 615-653 (1971).
  47. Robeson, C. D., et al. Chemistry of vitamin A. XXIV. The synthesis of geometric isomers of vitamin A via methyl β-methylglutaconate1. J Am Chem Soc. 77 (15), 4111-4119 (1955).
  48. Robeson, C. D., Blum, W. P., Dieterle, J. M., Cawley, J. D., Baxter, J. G. Chemistry of vitamin A. XXV. Geometrical isomers of vitamin A aldehyde and an isomer of its α-ionone analog1. J Am Chem Soc. 77 (15), 4120-4125 (1955).
  49. Hubinger, J. C. Determination of retinol, retinyl palmitate, and retinoic acid in consumer cosmetic products. J Cosmet Sci. 60 (5), 485-500 (2009).
  50. Bhat, P. V., Co, H. T., Lacroix, A. Effect of 2-alkanols on the separation of geometric isomers of retinol in non-aqueous high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A. 260, 129-136 (1983).
  51. Stancher, B., Zonta, F. Quantitative high-performance liquid chromatographic method for determining the isomer distribution of retinol (vitamin A1) and 3-dehydroretinol (vitamin A2) in fish oils. J Chromatogr. 312, 423-434 (1984).
  52. Zonta, F., Stancher, B. High-performance liquid chromatography of retinals, retinols (vitamin A1) and their dehydro homologues (vitamin A2): improvements in resolution and spectroscopic characterization of the stereoisomers. J Chromatogr A. 301, 65-75 (1984).
  53. van Kuijk, F. J., Handelman, G. J., Dratz, E. A. Rapid analysis of the major classes of retinoids by step gradient reversed-phase high-performance liquid chromatography using retinal (O-ethyl) oxime derivatives. J Chromatogr. 348 (1), 241-251 (1985).
  54. Kane, M. A., Folias, A. E., Napoli, J. L. HPLC/UV quantitation of retinal, retinol, and retinyl esters in serum and tissues. Anal Biochem. 378 (1), 71-79 (2008).
  55. Widjaja-Adhi, M. A. K., Ramkumar, S., von Lintig, J. Protective role of carotenoids in the visual cycle. FASEB J. 32 (11), 6305-6315 (2018).
  56. Ramkumar, S., Jastrzebska, B., Montenegro, D., Sparrow, J. R., von Lintig, J. Unraveling the mystery of ocular retinoid turnover: Insights from albino mice and the role of STRA6. J Biol Chem. 300 (3), 105781(2024).
  57. de Grip, W. J., Lugtenburg, J. Isorhodopsin: An undervalued visual pigment analog. Colorants. 1 (3), 256-279 (2022).
  58. Fan, J., Rohrer, B., Moiseyev, G., Ma, J., Crouch, R. K. Isorhodopsin rather than rhodopsin mediates rod function in RPE65 knock-out mice. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (23), 13662-13667 (2003).
  59. Sparrow, J. R. Bisretinoids of RPE lipofuscin: Trigger for complement activation in age-related macular degeneration. Adv Exp Med Biol. 703, 63-74 (2010).
  60. Różanowska, M., Handzel, K., Boulton, M. E., Różanowski, B. Cytotoxicity of all-trans-retinal increases upon photodegradation. Photochem Photobiol. 88 (6), 1362-1372 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

AGPCRA4A