ניתוח כמותי של מטבוליטים תזונתיים של ויטמין A ברקמות עיניות ולא עיניות באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים

Summary

כאן, מתוארת שיטת כרומטוגרפיה נוזלית בשלב רגיל, בעלת ביצועים גבוהים כדי לזהות ולכמת רטינואידים קריטיים המעורבים בהקלה על תפקוד הראייה ברקמה עינית וסיסטמית כאחד, בהקשר של אספקת ויטמין A מערכתית ליצירת כרומופור רודופסין 11-cis-retinal רגיש לאור חיוני.

Abstract

קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) הם משפחת סופר-על של חלבונים טרנסממברנליים היוזמים מפל איתות באמצעות הפעלת חלבון G שלו עם הקשר עם הליגנד שלו. בכל ראיית יונקים, רודופסין הוא GPCR האחראי על התחלת מפל הפוטוטרנסדוקציה. בתוך פוטורצפטורים, רודופסין קשור לכרומופור 11-cis-retinal שלו ומופעל באמצעות איזומריזציה רגישה לאור של 11-cis-retinal ל-all-trans-retinal, אשר מפעילה את חלבון G המתמר, וכתוצאה מכך מפל הפוטוטרנסדוקציה.

בעוד phototransduction מובן היטב, התהליכים המעורבים באספקת מבשרי ויטמין A תזונתיים עבור 11-cis-retinal דור בעין, כמו גם מחלות וכתוצאה מכך שיבוש של אספקה זו, עדיין לא מובן במלואו. ברגע שמבשרי ויטמין A נספגים במעי, הם מאוחסנים בכבד כאסטרי רטיניל ומשוחררים לזרם הדם כטרנס-רטינול הקשור לחלבון קושר רטינול 4 (RBP4). רטינול RBP4-רטינול זה ייספג על ידי איברים מערכתיים, כגון הכבד, הריאות, הכליות והעין. לפיכך, שיטה לכימות המטבוליטים השונים של ויטמין A בעין ובאיברים מערכתיים היא קריטית לחקר תפקוד תקין של רודופסין GPCR.

בשיטה זו אנו מציגים מיצוי מקיף ושיטה אנליטית לניתוח ויטמין A ברקמת מורין. באמצעות ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית בשלב רגיל ובעל ביצועים גבוהים, ניתן לזהות בו זמנית את כל האיזומרים הרלוונטיים של רטינאלדהידים, רטינולים ואסטרי רטיניל באמצעות ריצה אחת, המאפשרת שימוש יעיל בדגימות ניסיוניות ומגבירה את האמינות הפנימית בין מטבוליטים שונים של ויטמין A באותה דגימה. בעזרת שיטה מקיפה זו, החוקרים יוכלו להעריך טוב יותר את אספקת ויטמין A המערכתית בתפקוד רודופסין GPCR.

Introduction

קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) הם אחת ממשפחות החלבונים הנחקרות והמאופיינות ביותר הידועות. בתפקידם הידוע ביותר, GPCRs משמשים כקולטן פני התא בהעברת אותות, ומאתחלים תגובות תוך-תאיות בעת קשירה עם ליגנד מסוים. GPCRs מאופיינים בשבעה תחומים סליליים טרנסממברנליים (TM) ובשישה תחומי לולאה כוללת. מתוך שש הלולאות, שלוש לולאות מכוונות חוץ-תאיות כדי להקל על קשירת ליגנדים, בעוד ששלוש הלולאות התוך-תאיות האחרות מצומדות לחלבון G הטרוטרימרי המורכב מתת-היחידות^Gα, Gβ ו-Gγ ^1,2.

GPCRs מסווגים למספר סוגים, כולל Class A דמוי רודופסין, משפחת קולטני Class B Secretin, Class ....

Protocol

הערה: כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת מינסוטה (פרוטוקול # 2312-41637A) ובוצעו בהתאם להצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה. בצעו את כל החילוצים בחושך, תחת אור אדום עמום להארה. שימו לב לשאריות האור הנפלטות מתצוגות המכשירים ונורות ה-LED של האביזרים.

1. יצירת תקן רטינואיד ספקטרופוטומטרי ויצירת עקומה סטנדרטית חיצונית

הערה: הכן מיכל קרח יבש לאחסון זמני של רטינואידים לפני ניתוח עם HPLC.

1. לשקול כמות שרירותית אך מתאימה של רטינואידים ולהמיס אותם בממס מתאים לכימות באמצעות ספקטרופוטומטריה.....

תוצאות

כאן, השתמשנו בשיטה שתוארה לעיל כדי לזהות ולכמת רטינואידים ברקמה עינית וסיסטמית מורין ויצרנו כרומטוגרמות מייצגות. בנוסף, אנו נותנים סיכום של רטינואידים טיפוסיים שניתן לזהות ברקמות אלה.

בגיל 6 חודשים, עכברים הומתו באמצעות חנק CO₂ . כדי לשמור על תכולת רט?.......

Discussion

בשיטה זו, HPLC בשלב רגיל משמש לזיהוי וכימות רטינואידים רלוונטיים, כולל אסטרי רטיניל, רטינאלדהידים ורטינולים. בהתחשב בחשיבות של 11-cis-retinal ככרומופור קריטי בהפעלת rhodopsin GPCR, שיטה שיכולה לזהות את המטבוליטים הקשורים לייצור של 11-cis-retinal היא קריטית לחקר תפקוד הראייה הכולל. .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
1-Octanol, suitable for HPLC, ≥99.5%	Sigma-Aldrich, Millipore Sigma	203-917-6
1,4-Dioxane, suitable for HPLC, ≥99.5%	Sigma-Aldrich, Millipore Sigma	204-661-8
11-cis-retinal	National Eye Institute	N/A
11-cis-Retinol	Toronto Research Chemicals	TRC-R252105
13-cis-retinal	Toronto Research Chemicals	TRC-R239900
13-cis-retinol	Toronto Research Chemicals	TRC-R252110
All-trans-Retinal	Toronto Research Chemicals	TRC-R240000
All-trans-Retinol	Toronto Research Chemicals	TRC-R252002
Ethyl Acetate, suitable for HPLC, ≥99.7%	Sigma-Aldrich, Millipore Sigma	205-500-4
Hexane, HPLC Grade	Fisher Scientific, Spectrum Chemical	18-610-808
Methanol (HPLC)	Fisher Scienctific	A452SK-4
Retinyl Palmitate	Toronto Research Chemicals	TRC-R275450
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Scientific	S271-500
Instruments
1260 Infinity II Analytical Fraction Collector	Agilent	G1364F
1260 Infinity II Binary Pump	Agilent	G7112B
1260 Infinity II Diode Array Detector	Agilent	G7115A
1260 Infinity II Multicolumn Thermostat	Agilent	G7116A
1260 Infinity II Vialsampler	Agilent	G7129A
ST40R Refrigerated Centrifuge	Thermo Scientific	TSST40R
Vacufuge Plus Centrifuge Concentrator	Eppendorf	22820168
Consumables
2 mL Amber Screw Top Vials	Agilent	5188-6535
Crimp Cap with PTFE/red rubber septa, 11 mm	Agilent	5183-4498
Disposable Glass Conical Centrifuge Tubes	Millipore Sigma	CLS9950215
Screw cap tube, 15 mL	Sarstedt	62.554.502
Vial insert, 150 µL, glass with polymer feet	Agilent	5183-2088