בידוד מיטוכונדריאלי חזק מרקמת לב מכרסם

Summary

מחקרים ביואנרגטיים ומטבוליים על מיטוכונדריה חשפו את תפקידם הרב-גוני במחלות רבות, אך שיטות הבידוד של אברונים אלה משתנות. השיטה המפורטת כאן מסוגלת לטהר מיטוכונדריה באיכות גבוהה ממקורות רקמה מרובים. האיכות נקבעת על ידי יחסי בקרת נשימה ומדדים אחרים המוערכים עם רספירומטריה ברזולוציה גבוהה.

Abstract

בידוד מיטוכונדריאלי נהוג מזה עשרות שנים, בעקבות נהלים שנקבעו על ידי חלוצים בתחומי הביולוגיה המולקולרית והביוכימיה לחקר ליקויים מטבוליים ומחלות. איכות מיטוכונדריאלית עקבית נחוצה כדי לחקור כראוי פיזיולוגיה מיטוכונדריאלית וביו-אנרגטיקה; עם זאת, שיטות בידוד רבות ושונות שפורסמו זמינות לחוקרים. למרות שאסטרטגיות ניסוי שונות דורשות שיטות בידוד שונות, העקרונות והנהלים הבסיסיים דומים. פרוטוקול זה מפרט שיטה המסוגלת לחלץ מיטוכונדריה מצומדים היטב ממגוון מקורות רקמה, כולל בעלי חיים קטנים ותאים. השלבים המתוארים כוללים דיסקציה של איברים, טיהור מיטוכונדריה, כימות חלבונים ובדיקות בקרת איכות שונות. מדד בקרת האיכות העיקרי המשמש לזיהוי מיטוכונדריה באיכות גבוהה הוא יחס בקרת הנשימה (RCR). RCR הוא היחס בין קצב הנשימה במהלך זרחן חמצוני לקצב בהיעדר ADP. נדונים מדדים חלופיים. בעוד ערכי RCR גבוהים ביחס למקור הרקמה שלהם מתקבלים באמצעות פרוטוקול זה, מספר שלבים יכולים להיות אופטימליים כדי להתאים לצרכים האישיים של החוקרים. הליך זה חזק והביא באופן עקבי למיטוכונדריה מבודדים עם ערכי RCR מעל הממוצע במודלים של בעלי חיים ובמקורות רקמות.

Introduction

מיטוכונדריה הם אברונים תת-תאיים המבססים תנאים אנרגטיים ציטופלזמיים המותאמים לתפקודי תאים ספציפיים. בעוד שמחקרים ברמת התא, הרקמות והאורגניזמים יכולים לספק תובנות לגבי תפקוד המיטוכונדריה, בידוד האבונים מציע רמה של שליטה ניסיונית שאינה אפשרית אחרת. בידודים מיטוכונדריאליים מבוצעים מאז שנות ה-40 של המאה ה-20, ומאפשרים מחקרים מכניסטיים של חילוף חומרים ונשימה במגוון תאים ורקמות ^1,2. הרלוונטיות ההיסטורית של המיטוכונדריה מתועדת היטב^גם 3. בתור היצרנים העיקריים של ATP, מיטוכונדריה ממלאים תפקידי מפתח רבים החיוניים לתפקוד מיטבי של התאים והאיברים⁴. בתוך המטריצה המיטוכונדריאלית, הסובסטרטים מחומצנים על ידי מחזור TCA, ומייצרים מקבילות מחזרים ונושאי אלקטרונים ניידים כגון NADH ו- UQH₂ ^5,6. ציטוכרום C הוא נשא האלקטרונים הנייד השלישי ברשת התגובה הביוכימית המיטוכונדריאלית⁷. מולקולות אלה מחומצנות לאחר מכן על ידי קומפלקסים טרנסממברנליים של מערכת הובלת האלקטרונים (ETS) המשובצים בקרום המיטוכונדריאלי הפנימי⁸. תגובות חמצון-חיזור של ETS מצומדות לטרנסלוקציה של פרוטונים מהמטריצה למרחב הבין-ממברנלי. תהליכים אלה יוצרים שיפוע פרוטונים אלקטרוכימי המשמש לפוספורילט ADP עם Pi על ידי F₁F₀ ATP סינתאז לייצור ATP ^9,10. ניתן לחקור את התהליכים האינדיבידואליים המתרחשים בכל מתחם באמצעות ספירומטריה ברזולוציה גבוהה באמצעות אלקטרודות מסוג קלארק או מבחני צריכת חמצן של מיקרו-פלטות^11,12. בנוסף, מודלים של מחלות וטיפולים באמצעות מיטוכונדריה מבודדת יכולים לקבוע את ההשפעה או החשיבות של תפקוד המיטוכונדריה בהתקדמות של פתולוגיות מסוימות. זה הוכח פורה בתחום הקרדיולוגיה, שם שינויים באספקת דלק ומצע שימשו כדי להבהיר כיצד תפקוד לקוי של המיטוכונדריה משפיע על אי ספיקת לב 13,14,15,16. מיטוכונדריה ידועים גם כמשפיעים על התפתחות מצבי מחלה אחרים כגון סוכרת, סרטן, השמנת יתר, הפרעות נוירולוגיות ומיופתיות^17,18. לכן, השימוש במיטוכונדריה מבודדים או מטוהרים מאפשר חקירה מכניסטית של חילוף חומרים חמצוני וייצור ATP ברקמת המקור.

לא חסרים פרוטוקולים לבידוד מיטוכונדריאלי בשל חשיבותם במחקר הביו-אנרגטי. בנוסף, ניתן למצוא שיטות ספציפיות מאוד המותאמות לתת-אוכלוסיות של מיטוכונדריה בתוך רקמות ותאים^19,20. השלבים הפרוצדורליים הבסיסיים דומים בין שיטות בידוד, אך ניתן לבצע שינויים בהרכב החיץ, שלבי הומוגניזציה וסחרורי צנטריפוגות כדי לשפר את כמות ואיכות המיטוכונדריה. שינויים בהיבטים אלה מבוססים על הדרישה המטבולית של הרקמה, תפקוד איברים כללי, צפיפות מיטוכונדריה וגורמים אחרים. ברקמות כגון הכבד ושרירי השלד, הומוגנייזרים ידניים משמשים לשמירה על שלמות המיטוכונדריה ולהגבלת הנזק לקרומי המיטוכונדריה²¹. עם זאת, בעת בידוד מהכליות, פרוטוקולים מסוימים מציעים להשתמש בהומוגניזציה מונעת ידנית או ערכות מסחריות כדי להניב תוצאות טובות יותר²². למרות ששתי השיטות מניבות מיטוכונדריה פונקציונלית, איכות האברונים עלולה להיפגע בגלל הזמן הנוסף שלוקח להשלים בידודים באמצעות פרוטוקולים אלה. צנטריפוגה חיונית גם למיצוי חלבון מיטוכונדריאלי, שכן היא מפרידה רכיבים תאיים כגון גרעינים ואברונים אחרים מהמיטוכונדריה²³. בתהליך הבידוד מתלבטים האם יש ליישם צנטריפוגות דיפרנציאליות או מבוססות צפיפות כדי להשיג מבודדים טהורים יותר²⁴. בעוד שצנטריפוגת צפיפות יכולה להפריד מיטוכונדריה מאברונים בעלי כבידה סגולית דומה, כגון פרוקסיזומים, אין זה מבוסס היטב אם מיטוכונדריה משיטות אלה מייצגות טוב יותר את תפקוד אברוני האתר בהשוואה למיטוכונדריה שבודדו באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית. בתחום הפיזיולוגיה של המיטוכונדריה, צנטריפוגה מבוססת צפיפות היא מועדפת וניתן לשנות אותה בקלות כדי להגביר את טוהר הבידוד. יש לשקול לפני הניסויים אם משולבים שינויים בכוחות הג'י, משך הצנטריפוגות ומספר סיבובי הצנטריפוגות בשל השפעתם על טיהור המיטוכונדריה. יתר על כן, תרחיף מיטוכונדריאלי, ככל הנראה השלב המכריע ביותר במהלך בידוד, שונה מאוד בין מחקרים, עם שימוש בגירוד, ערבוב מבוסס מערבולת, או הומוגניזציה 23,25,26. השעיה מכנית מסוג זה עלולה להיות שוחקת מדי ולפגוע בשלמות הממברנה של המיטוכונדריה. מסיבה זו, יש לבצע כביסה עדינה כדי לתקן זאת. למרות שפע המודולציות והמתודולוגיות המוצעות, ישנם פחות פרוטוקולים מקיפים עם יכולת שחזור והתאמה גבוהה למודלים של מכרסמים.

השיטות המתוארות כאן מתארות פרוטוקול מפורט, חזק וניתן לשחזור שמניב מיטוכונדריה מטוהרת ומצומדת היטב מרקמת לב של בעלי חיים קטנים. כפי שהוכח, ניתן להתאים שיטה זו בקלות כדי להתאים לצרכים הספציפיים של כל ניסוי ו / או סביבת מעבדה לבידוד מיטוכונדריה מכליות, כבד ותאים בתרבית. ניתן לבצע שינויים נוספים כדי לבודד מיטוכונדריה מרקמות ובעלי חיים אחרים שאינם מפורטים כאן. מתכוני חיץ המשמשים לכל הבידודים מסופקים וניתן לשנות אותם במידת הצורך. בדומה לפרוטוקולים אחרים שפורסמו, הומוגניזציה ממונעת וצנטריפוגה דיפרנציאלית מיושמות; עם זאת, מתבצעות התאמות הן לזמן הגזירה והן לכוח שבו הדגימות עוברות צנטריפוגה כדי לספק באופן עקבי מבודדים מיטוכונדריאליים באיכות גבוהה, בהתאם למקור הבידוד. יש לציין כי פרוטוקול זה שונה מאחרים בכך שהוא משתמש בשטיפה עדינה באמצעות פיפטינג כדי להשהות מחדש מיטוכונדריה כדורית, מה שעוזר לשמור על שלמות קרום המיטוכונדריה ולשמור על הפונקציונליות הכוללת של האברונים. חלבון מיטוכונדריאלי מכומת על ידי קביעת חלבון כולל או על ידי מדידת פעילות סינתאז ציטראט. התועלת והישימות הרחבה של שיטת בידוד זו נתמכות גם על ידי ערכי יחסי הבקרה הנשימתית (RCR) המושגים על פני אורגניזמים ומקורות רקמות שונים.

Protocol

השימוש והטיפול בכל בעלי החוליות בוצעו בהתאם לפרוטוקולים מאושרים שנבדקו והתקבלו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת מישיגן. פרוטוקול זה תוכנן תוך שימוש בשרקנים לבקנים זכרים ונקבות כאחד של הארטלי וחולדות Sprague Dawley (SD). לצורך בידוד מיטוכונדריה לבבית משרקנים, הוקרבו בעלי חיים בגילאי 4-6 שבועות (300-450 גרם). מיטוכונדריה לבבית מחולדות SD משני המינים התקבלו בין הגילאים 10-13 שבועות (250-400 גרם). מתכונים למאגרים מתוארים בטבלה 1 ויש להכין אותם מראש. פרטים על הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנה ניסיונית

1. לפני תחילת הבידוד, תייגו שני צינורות צנטריפוגה של 50 מ"ל כ"ספינים 1 ו -2" ו"ספין 3".
2. מניחים צינורות, חיץ בידוד מופשר טרי (IB), מספריים טחונים חדים, בדיקת הומוגניזציה שהורכבה, וכוס 5 מ"ל או מיכל בגודל שווה ערך על קרח.
3. הניחו את חיץ הנשימה הטרי המופשר (RB) באינקובטור כדי להתחמם לקראת בדיקות הנשימה הבאות.
4. מצננים מראש צנטריפוגה בקירור ל-4°C.
5. ודא כי כל הציוד מסודר 20 μL של 7-15 U/mg פרוטאז מ Bacillus licheniformis נוסף לצינור שכותרתו "ספינים 1 ו 2".
6. הגדר מערכת לחץ תלוית כבידה לזילוח באמצעות קנולציה באמצעות חיץ Cardioplegia (CB, טבלה 1), צינורית זכוכית וצינורות פלסטיק עם שסתום סטופקוק מחובר.
7. סדרו את כלי הניתוח ושלבו מספריים ומלקחיים מתאימים לדיסקציה וקנולציה של הלב.
   הערה: כל המים צריכים להיות באיכות טהורה (18.2 MΩ·cm)

2. דיסקציה של רקמות

1. הזריקו לבעלי חיים הפרין סולפט סטרילי תוך צפקי במינון של 500 U/kg.
2. הניחו לבעל החיים לשבת בתא הזירוז למשך 15 דקות לאחר מתן הפרין. במהלך תקופה זו, ספקו 2 ליטר לדקה של גז O₂ טהור כדי לחמצן באופן מלא את בעלי החיים, להרגיע אותם ולמזער כל לחץ שעלול להיות בעל השלכות שליליות על רקמות עניין.
3. התחל השראת הרדמה על ידי זרימה רציפה של isoflurane ב 0.5%. לאחר דקה, להגדיל ל 1%. המשיכו להגדיל ב-1% בכל דקה עד שמגיעים ל-5%. פעם אחת ב 5%, לחכות 1 דקה ולפקח על דפוס הנשימה של החיה.
4. לאחר שהנשימה הואטה ונעשית מאומצת (בערך בסימן 6.5 דקות) כבו את זרימת האיזופלורן והחמצן.
5. הוציאו במהירות את בעל החיים מתא האינדוקציה ובדקו עומק הרדמה מתאים על ידי לחיצת כפה ובדיקת רפלקס הקרנית. אם בעל החיים מגיב לאחד הגירויים, החזירו אותו לתא הזירוז, קראו את ההרדמה וחזרו על בדיקת עומק ההרדמה.
6. ברגע שמגיעים לעומק הנכון של ההרדמה, ערפו במהירות את ראשו עם גיליוטינה כדי להחמיר את עמוד השדרה הצווארי והניחו את הגוף הנוטה על קרח.
7. בצע שני חתכים אנכיים מקבילים מעצם הבריח המתקדמים לאורך כלוב הצלעות הצידי לאורך בית החזה. ודא כי החתכים עמוקים מספיק כדי לחתוך דרך הצלעות על בית החזה לרוחב, אבל להימנע נזק מבנים intrathoracic כגון הלב או כלי גדול.
   הערה: גודל החתך האנכי תלוי בבעל החיים שבו משתמשים. אם אתם משתמשים בשרקנים וחולדות, חתכו לסרעפת (כ-6.35 ס"מ לחולדות ו-11 ס"מ לשרקנים). אם אתם משתמשים בעכברים, בצעו כריתת בית חזה סטנדרטית²⁷.
8. חשוף את הלב באמצעות hemostat כדי לעקור את בית החזה הקדמי ולארוז את חלל החזה החשוף עם קרח. צעד זה ממזער את זמן האיסכמיה החמה ומשפר את הכדאיות של האברונים המבודדים.
9. השתמשו בפינצטה כדי לנתח בבוטות את בלוטת התימוס וקרום הלב ולחשוף את הלב במלואו.
10. באמצעות מלקחיים, להחיל מתיחה נחותה עדינה על הלב כדי לחשוף ולזהות את אבי העורקים. אבי העורקים הוא הכלי הגדול העבה ביותר המסתעף מבסיס הלב. כלי דם גדולים אחרים, כגון וריד הריאתי, הם שקופים יותר באופן ניכר מאשר אבי העורקים.
11. חותכים את אבי העורקים כ-4-6 מ"מ מעל שורש אבי העורקים אך מתחת לנקודות ההסתעפות של התרדמה.
12. לערבב את אבי העורקים ולחורר את הלב^28,29 בתמיסת קרדיופלגיה קרה כקרח (CB) באמצעות ראש לחץ תלוי כבידה עד שהעורקים הכליליים מנוקים מדם והאיבר נראה מולבן.
    הערה: עבור מכרסמים גדולים, קוטר צינורית של 1.8-2.2 מ"מ עובד היטב, ואילו עבור מכרסמים קטנים יותר, טווח קוטר של 1.4-1.8 מ"מ מומלץ. רטרו זילוח צריך לקחת לא יותר מ 15-30 s עבור כלי הדם הכליליים לנקות דם.
13. בודדו את שריר הלב של החדר על ידי ניתוח האטריה, רקמת המסתם הסחוסית ורקמות השומן.
14. מניחים את החדרים בתוך 10 מ"ל צוננת מראש המכילה 0.1-0.2 מ"ל IB קר כקרח.
15. טחון רקמה עם מספריים כירורגיים חדים עד חתיכות הם כ 1 מ"מ³.

3. טיהור מיטוכונדריה וכימות חלבונים

1. מעבירים את הרקמה הטחונה לתוך צינור הצנטריפוגה המצונן מראש שכותרתו "ספינים 1 ו-2" המכיל את תמיסת הפרוטאז.
2. הוסף IB קר כקרח לנפח סופי של 25 מ"ל.
3. באמצעות הומוגנייזר רוטור-סטטור ידני ממונע, מפזרים את הרקמה ב-18,000 סל"ד על קרח למשך 20-25 שניות.
4. צנטריפוגה רקמה הומוגנית בצינור שכותרתו "ספינים 1 ו -2" ב 8,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
5. יש להשליך את הסופרנאטנט (המכיל פרוטאז) על ידי מזיגו לפח הפסולת ולשטוף בעדינות את הגלולה עם 5 מ"ל IB כדי להסיר שאריות פרוטאז.
6. לאחר השלכת השטיפה, יש להשהות מחדש את הגלולה עם IB טרי קר כקרח לנפח סופי של 25 מ"ל על ידי מערבולת עדינה.
7. צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
8. הסר את supernatant (מכיל מיטוכונדריה) על ידי מזיגה עדינה לתוך צינור 50 מ"ל צונן מראש עם הכיתוב "ספין 3". בזמן המזיגה, יש להקפיד להימנע מפירוק החלק העליון הרופף של הכדורית. כחלופה, פיפטה העברה או סטריפט ניתן להשתמש כדי לאסוף את supernatant.
9. צנטריפוגה את supernatant ב 8000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
10. השליכו את הסופרנאטנט שנוצר ושמרו על הכדורייה המכילה מיטוכונדריה.
11. השתמשו במגבון ללא סיבים כדי לספוג עודפי סופרנאטנט מהדופן הפנימית של הצינור, תוך הקפדה שלא להפריע לכדורית. שמור את הגלולה ב 4 ° C על קרח ככל האפשר.
12. כדי להשהות מחדש את המיטוכונדריה, הוסיפו 80 μL של IB קר כקרח לתחתית הצינור. השהה מחדש בעדינות את הגלולה על ידי שטיפה חוזרת ונשנית של IB מעל הכדור.
13. כדי למנוע יצירת בועות, להגדיר micropipette לשאוף ולספק בין 40-60 μL של נפח.
14. ככל שהכדוריות המיטוכונדריאליות מתפזרות, הגדילו את נפח המיקרופיפטה כדי להשהות מחדש ביעילות את המיטוכונדריה הכדורית. הימנעו מלגעת בגלולה עם קצה הפיפטה, והימנעו מיצירת בועות.
15. לאחר השהייה מחדש, העבירו את המיטוכונדריה לצינור מיקרוצנטריפוגה מקורר מראש ותייגו אותו כמיטוכונדריה מלאי. רשום לעצמך את נפח המתלים הכולל.
16. כדי לקבוע את ריכוז החלבון המיטוכונדריאלי בדגימה, יש לבצע בדיקת חלבון כוללת באמצעות בדיקות החלבון הידועות BCA או Bradford כפי שהוגדרו בהוראות היצרן.
    הערה: אסטרטגיה חלופית או משלימה להערכת התשואה היא לקבוע את פעילות הסינתאז ציטראט. לשם השוואה, ניתן לכמת את התוכן המיטוכונדריאלי על ידי ביצוע הפרוטוקול המתואר ב- Vinnakota et ^al.30.

4. בדיקות בקרת איכות

1. בצינור מיקרוצנטריפוגה מקורר מראש, לדלל את מלאי המיטוכונדריה לריכוז העבודה הרצוי עם IB.
   הערה: מלאי המיטוכונדריה מדולל ל-40 מ"ג/מ"ל כדי לעבוד בריכוז הסופי של 0.1 מ"ג/מ"ל לבדיקות רספירומטריה בעת שימוש במבודדים מרקמת הלב.
2. יש לשטוף תאי אוקסיגרף, פקקים ומזרקי מיקרוליטר עשר פעמים במים מזוקקים כדי לנקות אותם לפני השימוש בבדיקות ספירומטריה.
3. כדי לבדוק את הכדאיות והאיכות של מבודדים מיטוכונדריאליים, יש להעמיס 2.3 מ"ל של חיץ נשימה (RB) לתוך תאי אוקסיגרף ולאפשר לאות צריכת החמצן להתאזן ב-37°C למשך כ-10 דקות או כאשר הקצב קרוב ל-0.
4. ברגע שהאות מאוזן יש לדחוף כלפי מטה את הפקקים ולשאוף את החיץ העודף שיוצא מהנימים של הפקק.
5. הוסף 1 mM EGTA באמצעות מזרק microliter כדי chelate כל שאריות סידן במאגרים או דגימה מיטוכונדריאלית.
6. כדי לתדלק את הנשימה, להוסיף 5 mM נתרן pyruvate ו 1 mM L-malate.
7. לאחר הוספת המצע, הוסיפו בולוס של מיטוכונדריה מדוללת כדי להשיג ריכוז עבודה ולאפשר נשימה למשך 5 דקות. תקופה זו נקראת LEAK או State 2 respiration.
8. בסימן 5 דקות, הוסיפו בולוס של 500 מיקרומטר ADP כדי להתחיל נשימה במצב 3, המכונה גם OXHPOS, ואפשרו למיטוכונדריה לנשום עד לאנוקסיה.
9. חישוב יחס בקרת הנשימה (RCR) על-ידי חלוקת הקצב המרבי של צריכת חמצן במצב 3 בקצב צריכת החמצן ממש לפני הוספת ADP במצב 2 (ראה איור 1).
   הערה: ביטוי RCR חלופי של 1 - 1/RCR יכול לשמש גם כמדד איכות, התחום בין 0 ל- 1; עם זאת, קשה להבדיל בין איכות באמצעות מדד זה כאשר RCR > 10 (ראה איור 2).
10. שטפו את התאים והפקקים 10 פעמים במים טהורים כדי לנקות את האוקסיגרף לבדיקות הבאות. אם הספירומטריה הושלמה, מלאו את התאים באתנול 70% והניחו פקקים בתאים עד לשימוש הבא.

תוצאות

עם השלמת בידוד המיטוכונדריה, יש לבדוק את האיכות והפונקציונליות של המבודדים באמצעות כימות קצב צריכת החמצן (J_O2) באמצעות ספירומטריה ברזולוציה גבוהה. כדי לעשות זאת, מלאי המיטוכונדריה דולל ל -40 מ"ג / מ"ל כדי לאפשר ריכוזי עבודה של 0.1 מ"ג / מ"ל ב -2 מ"ל RB עבור כל בדיקות הספי?...

Discussion

הקפדה על השיטות המתוארות בתמציתיות בפרוטוקול זה תבטיח בידוד של מיטוכונדריה מצומדת היטב מרקמת הלב של מכרסמים קטנים, בנוסף לסוגי רקמות ומקורות אחרים. בסך הכל, התהליך צריך לקחת בסך הכל 3-3.5 שעות, שבמהלכן כל רקמות בעלי החיים, הדגימות והמבודדים צריכים להישאר על קרח ב -4 מעלות צל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL microcentrifuge tubes
10 mL glass beaker			For organ disection and mincing
50 mL centrifuge tubes			Centrifugation
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma	A5285	Respirometry assays
BSA Protein Assay Kit	Thermo Scentific	PI23225	Mitochondrial protein quantification
Dextrose	Sigma	DX0145	For buffer (CB)
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma	E4378	For buffers (CB and IB) and respirometry assays
Glass cannula	Radnoti		Guinea pig and rat heart perfusion
Heparin sodium porcine mucosa	Sigma	SRE0027-250KU	Animal IP injection
High-resolution respirometer			Clark-type electrode; oxygraph with 2 mL chambers
Induction chamber
Isoflurane	Sigma	792632	Anesthetic
L-malic acid	Sigma	02288-50G	Respirometry assays
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M9272	For buffer (RB)
Mannitol	Sigma	MX0214	For buffer (IB)
Microliter syringes			Sizes ranging from 5–50 µL
Microplate reader			Must be able to incubate at 37 °C
MOPS	Sigma	475898	For all buffers
O2 tank
OMNI THQ Homogenizer	OMNI International	12-500	Similar rotor stator homogenizers will work
pipettes			Volumes of  2–20 µL; 20–200 µL; 200–1000 µL
Potassium chloride	Sigma	P3911	For buffers (RB and CB)
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496	For buffers (IB and RB)
Protease from Bacillus licheniformis	Sigma	P5459
Sodium chloride	Sigma	S9888	For buffer (CB)
Sodium pyruvate	Fisher bioreagents	BP356-100	Respirometry assays
Sucrose	Sigma	8510-OP	For buffer (IB)
Surgical dissection kit			Depends on animal and tissue source
Tabletop centrifuge			Must cool to 4 °C